新たなライフサイエンス時代へ - Thermo Fisher Scientific

ライフテクノロジーズ情報誌 NEXT 4 月号
2014 / April / No.24
NEXT Interview
新たなライフサイエンス時代へ
ゲノム編集技術がもたらす遺伝子改変生物作製のパラダイムシフト
伊川正人氏（大阪大学微生物病研究所教授）
P. 04
P. 06
P. 07
P. 08
P. 12
P. 13
P. 14
P. 15
P. 16
P. 17
P. 18
Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit
GeneArt ® Strings™ DNA Fragments
Ion PGM™ シーケンサ＆ Ion PGM™ Sequencing 400 Kit
QuantStudio™ 3D デジタル PCRシステム
Click-iT ® Plus EdU Alexa Fluor ® 細胞周期細胞増殖アッセイ
FluoroBrite™ DMEM
ViraPower™ BacMam Expression System
EVOS ® XL Imaging System
FluoVolt™ Membrane Potential Kit
Fluo-4 Cytosolic Calcium Imaging Kit
iBind™ Western System
ProtoArray ® ヒトタンパク質マイクロアレイ v5.1
Invitrogen™
Next_24.indd 01
Applied Biosystems®
Gibco®
Molecular Probes®
Novex®
Ambion®
Ion Torrent™
14/03/19 11:33
NEXT Interview
page
02
新たなライフサイエンス時代へ
ゲノム編集技術がもたらす遺伝子改変生物作製のパラダイムシフト
伊川正人氏（大阪大学微生物病研究所教授）
2013 年 1 月、第三のゲノム編集技術として、世界中の研究者の注目を集めた CRISPR/Casシステム。
標的配列へ対応する短い RNA をガイド役にヌクレアーゼを誘導、ゲノム上の目的箇所を切断し、DNA 配列の削除や追加を行なう。
大阪大学の伊川正人氏は「論文を読むと同時にこのシステムを使う準備を始め、
5 月から10 月にかけて 50を超える遺伝子のノックアウト（標的遺伝子破壊）マウスを作製しました。
従来法では 50 年かかってもおかしくない実験が半年でできたことに驚きつつも、この技術の可能性を確信しました」と語ります。
そして同年 11 月には、わずか 1 か月間でノックアウトマウスを作製する方法を論文で発表。
新たなゲノム編集時代の幕開けに貢献しました。
「 CRISPR/Cas 技術がもたらす変化は、単なる時間の短縮だけでなく、労力やコストの削減、
さらにはバイオリソースのあり方にまで幅広い影響を与えるでしょう。新しいライフサイエンス時代の到来ですね」と語気を強めます。
高度な技術、豊富な経験、そして困難を乗り越える精神力を必要とした従来法を使いこなし、
生殖科学や受精に関する多くの研究成果を上げながら、数百系統の遺伝子改変マウスの作製を支援してきた伊川氏。
容赦なく進化するゲノム編集技術の衝撃を真正面から受け止め、
遺伝子改変動物への応用を軸に、この技術の可能性をさらに拡げる研究を推進中です。
新たな歴史の始まり
ヒトゲノム解読が終了した 2003 年以前か
ら、人工ヌクレアーゼを利用したゲノム編
集技術への関心は高まっていました。培養
細胞や受精卵にも応用でき、動物種を限
定せずに使える期待の技術として、多くの
研究者がその進展を見守っていたのです。
「非常に魅力的な技術でしたが、最初に
発表されたジンクフィンガーヌクレアーゼ
法は 3 塩基ずつの認識配列の組み合わせ
が難しく、取り組むことに躊躇していまし
た。しかし2011 年に TALEN 技術が発表さ
れた時、塩基の認識方法もモジュール式で
成功効率が高く、この技術を試してみるこ
とにしました」と伊川氏。そして遺伝子改変
マウスの作製に取り組むとともに、細胞内
で DNA 二重鎖切断が起きたことを蛍光タ
ンパク質の発光で検知するアッセイ系を開
発します。
「ところがちょうど TA L E N でマ
ウスが産まれた頃、さらに洗練されたゲノ
ム編集技術、CRISPR/Cas システムが発
表されたんです。躊躇する間もなく、今度
はこの技術の改良にすぐに取り組みました。
Next_24.indd 02
14/03/19 11:33
page
03
インタビュアー：ライフテクノロジーズサイエンスコミュニケーター橋本裕子
そして TALEN で開発したアッセイ系を活
への信頼から国内外の多くの研究者と共
用し、C R I S P R / C a s システムを使って一
同研究を進めたり、サポート体制を整えて
か月間でノックアウトマウスを作製する方
多くの研究を支えてきました。
法を確立しました」と語ります。
誰もが使える技術へ
50 年かかるかもしれない実験が
個体レベルでの遺伝子機能解析ツールの
わずか半年に
開発とともに、遺伝子改変動物を用いて生
殖生物学の研究を常に第一線で行ってき
従来法でのマウスのノックアウトやノックイ
ン（標的遺伝子挿入）は、最初に ES 細胞の
た伊川氏。新しいゲノム編集ツールの出現
EGFPを全身に発現するトランスジェニックマウス
相同組換え（ HR ）を介してゲノム改変を行
をどのように見ているのでしょうか。
「この
うことから始まります。そして ES 細胞のス
方法を使えば受精卵にプラスミドを注入し、
クリーニング、胚盤胞への注入によるキメ
産まれてきたマウスの遺伝子を調べるだ
ラマウスの作製後、交配により次世代に遺
けです。特別な技術や設備の必要性が減り、
伝子改変したゲノムが伝わることを確認し
かなり一般化すると思います。また細胞の
ていきます。
「 ES 細胞導入用のプラスミド
実験にも大きなパラダイムシフトが起きそ
作製とES 細胞での相同組換えに数か月か
うですね。細胞レベルで遺伝子破壊ができ
ら半年、そしてキメラマウス作製と交配は
るので、事前に遺伝子改変動物を準備する
順調に進んでも数年かかる根気のいる仕
必要もなく、完全に機能阻害できなかった
事です。しかも ES 細胞での相同組換え効率
siRNA とは異なるアプローチが可能にな
は低く、うまく選別できてもキメラマウスが
産れるとは限りませんし、キメラマウスがで
きたとしても次世代に変異遺伝子が伝わら
野生型マウスの精子が透明帯に結合するのに対し（左）、雄性不妊
となる14 以上の遺伝子ノックアウトマウスの精子が透明帯に結合
できない（右）。しかし真の不妊原因は透明帯結合不全ではなく、精
子が子宮から卵管に移行できないことにあった。
で、i P S 細胞を含むヒトのセルラインでも
様々な改変が行え、それをスクリーニング
に使うことで創薬への貢献も大きいはず
ないと意味がありません。一年近く、交配さ
せ続けたこともありました。もちろん変異
ります。しかも動物種を限らずに使えるの
です」。最高の技術で最高の研究を進めた
え生物。その後、このマウスを使って雌雄
遺伝子が伝わらなければ、最初からやり直
性差の研究や生殖細胞の性分化機構など
すことになります。ですからこれまではテー
成果を出していきます。ただしこの方法で
マを絞りに絞って実験を開始しなければな
は、外来遺伝子の過剰発現は行えても、目
りませんでした」と従来法の難しさについ
的遺伝子のノックアウトやノックインはで
て説明します。
「ところがゲノム編集技術を
きませんでした。伊川氏は岡部氏とともに
活用すれば、複数のテーマを並行して進め
大阪大学微生物研究所の研究室へ移動し、
ることも容易です。従来法で 50 種類の遺伝
西宗義武教授から勧められて、E S 細胞の
子改変マウスを作ろうとすれば 50 年かかっ
相同組換えを利用したノックアウトマウス
ていましたが、それが約半年に短縮できる
作製に取り組みます。
「手探りで始めたの
のですから」と続けます。
で最初はどのような条件が重要なのかも
いと話す伊川氏。これまで蓄積してきた知
識や経験やネットワークを活かし、留まるこ
とのないライフサイエンスの新たな世界
で一層の活躍が期待されます。
分からず、インキュベーターのドアの開閉
回数にも気を使う時期もありました」と当
始まりはグリーンマウスの作製
時を振り返ります。
「しかし様々な試行錯
高校の頃に読んでいた科学雑誌の影響
クアウトマウス作製に成功しました」と伊
誤の末、1995 年にカルメジン遺伝子のノッ
で、
「遺伝子組換え技術」にあこがれて大
川氏。カルメジンは精巣特異的な分子であ
学へ入学。大阪大学薬学部の岡部勝教授
り、ノックアウトマウスは雄性不妊となりま
の研究室で分子生物学実験に打ち込みま
す。1 9 9 5 年、大学院生の頃にマウスの受
した。さらにノックアウトマウスの研究から、院薬学研究科修士課程修了後、日本学術振興会特
精子の透明帯結合能力は考えられている
別研究員 DC 。1997 年大阪大学大学院薬学研究科
精卵前核に D N A を打ち込み、G F P を全
ほど重要でないこと、精子膜タンパク質の
身に発現するトランスジェニックマウスの
イズモが卵子との融合に必須であること
作製に成功します。鮮やかに光るグリーン
を次々と明らかにしていきました。その一
究員 -PD 。1998 年大阪大学遺伝情報実験施設助手、
2004 年大阪大学微生物病研究所助教授、2007 年大
阪大学微生物病研究所准教授、2012 年大阪大学微
マウスは、高校の頃に憧れた遺伝子組換
方でノックアウトマウス作製の技術の高さ
生物病研究所教授（現在に至る）。
Next_24.indd 03
伊川正人（いかわまさひと）
1992 年大阪大学薬学部卒業、1994 年大阪大学大学
博士課程修了（薬学博士）。日本学術振興会特別研
14/03/19 11:33
page
Invitrogen™
04
トランスフェクション性能がさらにパワーアップ！
■ Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit
NEW!
Lipofectoamine ® シリーズの最新の脂質ナノ粒子テクノロジーが、優れたトランスフェ
クション性能と高い再現性を実現します。新しい Lipofectamine ® 3000 Transfection
Kit は、導入困難な細胞にも、一般的な細胞にも、高い導入効率と細胞生存率の向上をもた
らします。
［特長］
● 優れたパフォーマンス ── 導入困難な細胞から一般的な細胞まで、高い導入効率を実現
● 細胞生存率の向上 ── 細胞に優しく、低毒性
● 高い汎用性 ── 1 つの試薬で DNA 、RNA 、co-transfectionに対応
▶ Lipofectamine ® 3000 の高い導入効率
様々な細胞で、従来試薬より導入効率が向上
Lipofectamine® 3000
Lipofectamine® 2000
他社製品 FH
HEK 293
HeLa
▶ Lipofectamine ® 3000による
LNCaP
タンパク質発現量の増加
Western blot, HepG2
Lipofectamine ®
2000
Lipofectamine ®
3000
他社製品
他社製品
FH
XH
HepG2
GST-STAT
A549
β-actin
HepG2 細胞に GST 融合タンパク質発現ベクターをトランスフェクト後、
5 種類の培養細胞について、3 種類の試薬を用い、GFP 遺伝子をトランスフェク
β-actin をコントロールにウェスタンブロットでタンパク質発現レベルを
ションしました。すべての細胞で Lipofectamine ® 3000 による遺伝子導入効率
検出しました。
が高いことが示されました。
Next_24.indd 04
14/03/19 11:33
page
05
Invitrogen™
Lipofectamine ® 3000 開発者に聞きました！
50,000 報以上の文献引用数を誇る信頼の Lipofectamine ®
シリーズに待望の Lipofectamine ® 3000 が新登場。さらに
進化した Lipofectamine ® 3000 の魅力を開発者の Xavier
い）。またヒト ES 細胞の H9 細胞などでも良い結果が出ていま
す。これまでの技術では、20% 以下の低いトランスフェクション
効率だったので、エレクトロポレーションを使わざるを得ません
でした。しかしこの試薬では、多能性を維持したまま 50% のトラ
（ザビエル）が語ります。
ンスフェクションが実現します。エレクトロポレーションとほぼ
Lipofectamine ® 3000 の開発目的は？
同等の効率です。
多くの研究者との対話から、遺伝子導入がどんなに困難でも、
研究に必要であればその細胞を使い続けることを知りました。
使いやすさはどうですか？
ですから今回の試薬は、導入困難な細胞でも導入効率が向上
これまでと同じプロトコールで使えます。またダイナミックレン
することが目的です。実際に 62 種類の細胞で試し、90% 以上の
ジが広がったので、最適化の手間を省き、多くの種類の細胞で
細胞種で遺伝子導入効率とタンパク質発現が向上することを
お使いいただけます。これまで諦めていた細胞での遺伝子導
確認しました。
入をぜひ試してみてください。
Xavier de Mollerat du Jeu, Ph.D
開発に当たり、特に意識した研究技術や応用分野は？
（ Sr. Staff Scientist, Transfection ）
この試薬は幅広く挑戦的な研究分野でお使いいただけます。
入社以来 8 年間、米国本社でトランスフェクション試
例えば、TALEN や CRISPR によるゲノム編集で切断効率や組
薬の開発に携わる。Lipofectamine ® 3000 の開発
換え効率に良い結果をもたらします（ p10-11 をご参照くださ
では主担当を務めた。
▶ トランスフェクション選択ガイド
製品名
多くの文献で引用されている
DNA の導入に
siRNA 、miRNA の導入に
試薬では導入困難な細胞の
ロングセラー製品
最適なリポフェクション試薬
最適なリポフェクション試薬
ためのエレクトロポレーション装置
Lipofectamine ® 2000
●プラスミド
サンプルタイプ
導入効率
DNA
●プラスミド
Lipofectamine ® RNAiMAX
DNA
● RNA（ siRNA 、
miRNA ）
● RNA（ siRNA 、
miRNA ）
● DNAとRNA の
● DNAとRNA の
コトランスフェクション
コトランスフェクション
★★
★★★
トライアルサイズ
0.1ml サイズ
（製品番号 L3000001）
Neon® Transfection System
●プラスミド
● RNA（ siRNA 、
miRNA ）
DNA
● RNA（ siRNA 、
miRNA ）
●タンパク質
★★★
★★★★
0.1ml サイズ
デモ受付中
（製品番号 13778-100）
製品名
サイズ
製品番号
Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit
0.1 ml
L3000001
¥9,000
0.75 ml
L3000008
¥64,500
1.5 ml
L3000015
¥97,000
1.5 ml × 5
L3000075
¥430,000
価格
¥720,000
15 ml
L3000150
0.1 ml
13778-100
¥8,900
0.3 ml
13778-030
¥26,000
0.75 ml
13778-075
¥63,000
1.5 ml
13778-150
¥89,500
Neon™ Transfection System
1 ユニット
MPK5000
¥900,000
Neon™ Transfection System Starter Pack
1 セット
MPK5000S
Lipofectamine ® RNAiMAX
Next_24.indd 05
Lipofectamine ® 3000
¥1,050,000
14/03/19 11:34
page
Invitrogen™
06
DNA 断片での納品なら、もっと安く、もっと速く！
■ GeneArt ® Strings™ DNA Fragments
NEW!
合成二本鎖 DNA フラグメントを提供するサービスです。多くの
ご要望にお応えし、新たに 3 0 0 0 b p までの長さに対応すること
［特長］
● 100-3,000bpまでの二本鎖 DNAフラグメントを合成
になりました。製品を受け取り、すぐにクローニングへ GO！複数
● 納期は 9 営業日∼（∼ 1000bp ）か、
断片を余分な配列なくつなげてクローニングできる GeneArt ®
12 営業日∼（ 1001 ∼ 3000bp ）
Seamless Cloning and Assemble Enzyme Mixと組み合
● 受け取り後は、ご自身でベクターへクローニング
わせれば、長い遺伝子のクローニングや部分的なミューテーショ
● 配列最適化も無料対応
最大
3kbまで
対応 !
ン挿入でも、スピーディなクローニングが実現します。
▶ オーダーから実験への流れ
とにかくスピード重視で、そのままクローニング
Zero Blunt® TOPO® ベクターなら5分
ロングセラーの Zero Blunt ® TOPO ® ベクターならDNA 断片とベクターを混ぜて室
温 5 分後、直ちにトランスフォーメーション。
方向性を保ち、そのままクローニング
断片をつなげて、クローニング
24 時間対応の
オンラインオーダーサイトへ
GeneArt ® Seamless Cloning Kit なら30 分
100-3,000bp の配列を入力
www.lifetechnologies.com/genesynthesis
キットの試薬とリニアベクターに、最大 4 つの DNA 断片を混ぜて室温
30 分後、コンピテントセルに加えるだけ。インサートの方向性を保ち、
余分な配列が残りません。
▶ Seamless Cloning Kit 使用時の DNA 断片末端デザイン例
▶ 高品質のフラグメントを
お届けします。
DNAフラグメントプールの状態でダイレクトシーク
エンスを実施しています。90% 以上の確率で正しい
配列のクローンを得るために、以下のガイドライン
を提供しています。
Strings™ fragments up to 1kb
Sequence 2-4 full length clones
Strings™ fragments 1- 2kb
Sequence 3-5 full length clones
Strings™ fragments 2- 3kb
Sequence 4-8 full length clones
Seamless kit 独自の酵素ミックスの特性で、15 塩基のオーバーラップを認識して反応が進みます。
余分な配列の付加や切断操作は不要です。GeneArt ® Strings 注文時に反応に必要な 15 塩基の
オーバーラップを追加して注文すれば、そのまま使えます。
製品名
GeneArt ® Strings™ DNA Fragments（オンラインオーダー , >200 ng ）
100600 bp
納期 ※1
価格
Email オーダー時の追加料金 ※2
601 750 bp
751 1,000 bp
1,001 1,250 bp
1,251 1,500 bp
1,501 1,750 bp
1,751 2,000 bp
9 営業日∼
2,001 2,250 bp
2,251 2,500 bp
2,501 2,750 bp
2,751 3,000 bp
12 営業日∼
¥12,000
¥15,000
¥18,000
¥39,000
¥45,000
¥50,000
¥55,000
¥60,000
¥65,000
¥70,000
¥75,000
¥1,200
¥1,500
¥1,800
¥3,900
¥4,500
¥5,000
¥5,500
¥6,000
¥6,500
¥7,000
¥7,500
※ 1 合成難航時および輸入時の輸送状況によりお時間をいただく場合があります。※ 2 E-mail（ Excelファイル）によるご注文時に発生する追加料金です。
（注）配列により合成をお受けできない場合があります。
製品名
サイズ
納期
Zero Blunt ® TOPO ® PCRクローニングキットシークエンシング用（コンピテントセルなし）
20 反応
K287520SP
¥59,500
価格
GeneArt ® Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix
20 反応
A14606
¥36,000
GeneArt ® Seamless Cloning and Assembly Kit★1
20 反応
A13288
¥48,000
GeneArt ® Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit★2
20 反応
A14603
¥55,000
★ 1 コンピテントセル付き ★ 2 コンピテントセル付き、かつ多断片のクローニングに最適。
Next_24.indd 06
14/03/19 11:34
page
07
Ion Torrent™
400bp ロングリードで微生物叢を解き明かす
■ Ion PGM™ シーケンサ＆ Ion PGM™ Sequencing 400 Kit
細菌ドメインと古細菌ドメインの間で高度に保存された 16S rRNA 遺伝子は、細菌種の同定や分類に利用されます。
9 つの超可変領域（ V1 ∼ V9 ）には十分な配列多様性があり、保存領域に挟まれているため、ユニバーサルプライマーで PCR 増幅が行えます。
そのため 1 回または数回の反応で細菌叢全体を増幅でき、その PCR 産物をシーケンスすることで、単離と培養を経ることなく、細菌群集の特性解析が行えます。
1. V1-2 領域をカバーする 400bp のロング
リードで高い識別能力
複数サンプルの V1-2 領域のアンプリコンを 1 回の
シーケンスで解読します。詳細はアプリケーション
ノートをご覧ください。
「 ION108 Ion PGM™ シス
テムによる16S rRNA 遺伝子シーケンス」
2. 信頼と実績の MicroSeq ® 微生物同定データベースを活用し、ビジュアルに表示する解析ツール
シーケンスデータは付属の専用ソフトウェアで解析後、AppliedBiosystems ® MicroSeq ® 微生物同定システムのデータ
ベースと公的データベースGREENGENESを活用した 2 ステップの解析ワークフローで、種のレベルで菌叢解析が行えます。
製品名
サイズ
製品番号
Ion PGM™ Template OT2 400 Kit
10 反応
4479878
価格
Ion PGM™ Sequencing 400 Kit
4 反応
4482002
¥96,000
Ion 318™ Chip Kit v2（ 4 pack ）
4 反応
4484354
¥200,000
¥150,000
User's Voice
竹下徹氏（九州大学大学院歯学研究院
口腔予防医学分野准教授）
2500 人の唾液サンプルをIonPGM™ システムでメタ16S 解析
口腔マイクロバイオームの構成バランスから健康状態の把握、そして予防へ
は、九州大学医学部を中心に 50 年以上前
んでしたが、次世代シーケンサの登場によ
から実施され、定期的に 40 才以上の全住
り遺伝子配列に基づいた詳細な解析でき
民を対象とした健診を行っていることで、
るようになりました。それはすごい進歩で
生活習慣病等に対する精度の高い調査と
すが、以前は機械も高価だったので、2 か月
して国内外から注目されています。
程かかる外注に出していました。コスト的
にも時間的にも 100 サンプル程度の解析
IonPGM™ システムの
ロングリードで「メタ 16S 解析」
が限度でしたね」と振り返ります。
メタ 16S 解析とは、サンプル中の細菌を単
さらに多くのサンプル解析へ
「 2007 年と2012 年の久山町住民一斉健
離、個別培養せず、そのまま 16Sリボゾー
久山町住民の検体以外にも、新生児の細
診において採取した約 2500 人の住民の
ム RNA 遺伝子の配列を読み取り、その多
菌叢の日動変化や、高齢者や歯科治療前
様性を基に菌の構成を特定する方法です。
後の患者サンプル等、様々な細菌叢の解
唾液サンプルを現在解析中です。歯周病
Next_24.indd 07
等の口腔疾患は、従来まで病原菌の探索
「 I o n P G M ™ システムを使い始めて 1 年
析に取り組む竹下氏。
「 IonPGM™ システ
が主流でしたが、近年口腔内の細菌叢の
ほどですが、タグをつけて一度に 200 人分
ムを使えば、多数のサンプルを短期間で
バランスとの関係や病原菌をアシストす
のサンプルを Ion318™ チップでシーケン
解析できるので、研究の幅が広がります
る細菌の存在等、様々な可能性が示唆さ
スしました。数日で結果が出るので、すで
ね」と語ります。
「多くの研究データの積
れています。私たちは、まず多くの方の
に 2007 年の 2500 人のデータに関しては
み重ねから、歯周病にハイリスクな口腔
データから口腔マイクロバイオームの構
ほぼ解読できました。今後このデータの分
マイクロバイオームや口腔マイクロバイ
成バランスの個人差を明らかにし、その研
析を進めながら、2012 年の 2500 人のサン
オームと糖尿病や肥満等の生活習慣病と
究を通して疾患の原因解明に迫りたいと
プルに取り掛かる予定です」と竹下氏。
「研
の関係も明らかにしていきたい」。竹下氏
思っています」と九州大学歯学研究院の
究開始当初は、T-RFLP 法（制限酵素切断
は新しい技術から拡がる様々な可能性を、
竹下徹氏は語ります。久山町コホート研究
断片解析法）で大まかな解析しかできませ
今後も確実に検証していくようです。
14/03/19 11:34
Applied Biosystems®
page
08
User's Voice
小亀浩市氏（国立循環器病研究センター分子病態部血栓止血研究室
室長）
血栓性血小板減少性紫斑病の確実な遺伝子診断を目指して
デジタル PCR で正確なハプロタイピングを
親のサンプルが必要となります。患者本人
検証中です。すでに QuantStudio™ 3D デ
のサンプルだけで区別できれば、迅速に結
ジタルリアルタイム PCR システムの予備実
果が得られ、家族への負担も減りますよね」
験では良好な結果を得ているそうです。
と新しい解析法の必要性を語ります。
血栓症全般の
遺伝子解析への応用も
デジタル PCR による
ハプロタイピング解析法の開発
ADAMTS13 の迅速で正確な活性測定法を
「そんな時に、デジタル PCR システムの情
確立するなど、TTP の治療や基礎研究に大
ADAMTS13 遺伝子変異による
報を耳にしました。このシステムを使えば、
きな貢献をしてきた小亀氏らの研究グルー
劣性遺伝病
患者本人のサンプルだけで、クローニング
プ。
「今後は、デジタル PCR を活用しながら、
血栓性血小板減少性紫斑病（ T T P ）は、細
せずに簡単にハプロタイピングできそうだ
TTP だけでなく他の血栓症も簡便に遺伝子
動脈に血小板血栓が生じることで神経障
と思いついたんです」と小亀氏。デジタル
診断できる方法を開発していきたい」と語り
害や腎障害等を引き起こす全身性の疾患
PCR 法の基本原理は、DNA サンプルを希
ます。ケースに合わせて様々な遺伝子解析法
です。血小板凝集を調節するプロテアーゼ
釈して、測定対象が 1 分子以下になるように
を使いこなすことで、今後も様々な血栓症の
®
治療に向けた基礎研究に邁進するようです。
ADAMTS13 の著しい活性低下が発症につ
反応ウェルに配分。各ウェルで Ta q M a n
ながり、先天性 TTP では ADAMTS13 の遺
アッセイを実施し、PCR 反応が進んだか進
伝子異常が原因となります。国立循環器病
まなかったかをプローブの蛍光量の増加で
研究センターの小亀浩市氏は、奈良県立医
判定します。標的配列のありなしで定量する
① 2 か所の変異に対
科大学輸血部の藤村吉博氏らの研究グルー
のでデジタル PCRと呼ばれ、微量な遺伝子
する 4 種類のハプロ
プとともに、TTP の研究に携わってきました。
の発現定量や絶対定量に威力を発揮します。
「 TTP は劣性遺伝形式の疾患であり、治療
小亀氏は、デジタル PCR を使うハプロタイ
が可能な病気です。これまでに臨床的に先
ピングを次の様に解説します（図参照）。
「例
天性 T T P だと強く疑われた約 5 0 人の患者
えば 2 か所の変異を解析する場合、組み合
に対してダイレクトシーケンシング法で複
わせから 4 種類のハプロタイプを区別する
合ヘテロ接合性（各アレルに別の変異）ある
必要があります。そこで 2 つの変異に対して、
デジタル PCRによるハプロタイピング解析模式図
タイプと Ta q M a n ®
プローブ
パターンA：2つの変異が同じアレルに存在する場合
C
G
VIC
FAM
いはホモ接合性（両アレルに同じ変異）の原
異なる蛍光分子を持つ TaqMan ®プローブ
因変異を同定しました」と小亀氏。世界的に
を準備し、サンプルを解析します。もし変異
は 140 を越える原因変異が報告されていま
が同じアレルに存在すれば 1 つのウェルに両
すが、そのうちの 4 割を彼らのグループが報
方の蛍光が検出され（パターン A ）、2 つの変
告しています。
「複数の変異がどちらの対立
異が別々のアレルに存在すれば片方ずつ検
遺伝子に由来するかを正確に判断できれば、
出される（パターン B ）はずです」。新しい機
この病気を正しく理解し適切な対処につな
械や技術が発表されると、常に自分の研究
②デジタルPCR の結果
げられます。ただしシーケンサを使った従来
に活かすことを考えるという小亀氏。デジタ
の解析法では、ハプロタイプの区別には両
ル PCR 技術を発展的に活用するアイデアを
2 つの変異が同じアレルあれば（パターンA ）、両方の蛍光が混
合されます。別のアレルにあれば（パターンB ）、別々の蛍光が
G
A
パターンB：2つの変異が別のアレルに存在する場合
FAM
C
A
G
G
VIC
検出されます。
解析データ例
■ QuantStudio™ 3D デジタル PCR システム
チップベースのコンパクトなデジタル PCRシステムです。
20,000 個の微細なウェルを持つチップが、
1 サンプルあたり20,000 データポイントを提供します。
チップと反応ウェル
製品名
サイズ
製品番号
QuantStudio™ 3D デジタル PCRシステム 2 年保証パッケージ
1式
QS3D-GA
価格
¥5,900,000
QuantStudio™ 3D 本体、デュアルプラットブロック GeneAmp ® PCRシステム9700 、
QS3D ChipLoader、インスタレーション試薬、設置・基本取扱説明、2 年保証
Next_24.indd 08
14/03/19 11:34
page
09
Life Technologies™
Technical Review
1 ステップ RT-qPCR で、より速く、より簡単に！
TaqMan ® Fast Virus 1-Step Master Mix を用いた遺伝子発現解析
澤口穣（ライフテクノロジーズジャパン株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト）
一般的な RNA 発現解析は、逆転写反応と定量 PCR 反応を2 段階で行いますが、Fast-PCR 用 1ステップ RT qPCR 用マスターミックスの
TaqMan ® Fast Virus 1-Step Master Mixを使えば、より速く、より簡単に行えます。この試薬は、製品名からウイルス定量に特化した
試薬と思われがちですが、一般的な遺伝子発現解析にも使える万能マスターミックスです。本稿では、通常 2ステップの RT qPCR で使用す
るTaqMan ® Array Card（図 2 ）で、TaqMan ® Fast Virus 1-Step Master Mix の有用性を検証しました。その結果、2ステップでは2
時間以上かかっていた実験が、このマスターミックスを使えば約 1 時間に短縮され（図 4 ）、CT 値の相関係数も高い結果を得ました（図 3 ）。
［実験・結果 ] リアルタイムPCR は、TaqMan ® Array Card, Format 96a（ 96 種類の TaqMan ® Assay が 4セット分注済み）を使用しました。1ステップ実験は
RNAを鋳型にTaqMan ® Fast Virus 1-step Master Mixで行い、2ステップ実験はcDNAを鋳型にTaqMan ® Fast Advanced Master Mixで行いました。
それぞれの増幅度合いをCT値の相関で比較しました（図 1 ）。その結果、相関係数は0.928となり、高い相関が見られました。またTaqMan ® Fast Virus 1-Step
Master Mix のサンプル調製（図 3 ）や反応時間（図 4 ）を他のキット類と比較した結果、サンプル量をより多く使用でき、反応時間も約半分に短縮できました。
［実験条件］
Step
Reverse transcription
RT inactivation/
initial denaturation
● RNA: Human total reference RNA 100ng/ポート
● cDNA: Human total reference cDNA 100ng/ポート
※ cDNA 合成にはSuperScript ® VILO cDNA Synthesis kitを使用。
Amplification
Stage
1
No. of cycles Temperature
1
50 ℃
Time
5 min
2
1
95 ℃
20 sec
40
95 ℃
60 ℃
1 sec
20 sec
3
TaqMan ® Fast Advanced MM
表 1. ラン条件 Fast mode の設定を基本として、逆転写反応時間を追加しました。
R2 = 0.928
図 2. TaqMan ® Array Card
3 8 4 ウェルで構成される特殊なプレート。各ウェルに
TaqMan ®アッセイが予め分注されており、8 つのポートに
TaqMan ® Fast Virus 1-Step MM
サンプルとマスターミックスの混合液を充填することで網
羅的な遺伝子発現解析が行えます。デザイン済みのパネ
®
図 1. TaqMan Array Cardを使った96 遺伝子増幅結果の CT値相関図（ n=2 の平均で算出）
ルやカスタムにも対応します。
®
TaqMan Fast Virus 1-Step MMと2-Step RT qPCRで強い相関がみられました。
2μl
14μl
Component
Volume for one reaction
4 × TaqMan ® Fast Virus 1-Step Master Mix
5 μl
TaqMan ® Gene Expression Assay（ 20×）
1 μl
Sample
Variable
RT-PCR Grade Water
Variable
Total volume per reaction
20 μl
図 3. 反応液調製時のサンプル持ち込み量（ 20μl 反応系の場合）
2 ステップ反応の場合、逆転写バッファー等の持ち込みの影響で cDNA 量は全体の 10% 以下が望ましいとされています。一
方、TaqMan ® Fast Virus 1-Step Master Mix では、精製 RNA を使用する点と、4 倍濃縮の組成により、2 ステップ反応
に比べ最大 7 倍ものサンプル量を持ち込め、濃度の薄い RNA を多く添加できます。
図 4. 4 種類のキットにおける実験時間の比較
Fast PCR ができる TaqMan ® Fast Virus 1-Step
Master Mix を使用すれば、別途逆転写の必要がなく、わ
ずか 60 分で RNA から直接定量できます。さらに他の 1 ス
テップキットと比較しても、1 本のチューブで提供されるた
め、分注誤差や作業時間が短縮できます。
［まとめ］ ● TaqMan ® Fast Virus 1-Step Master MixとTaqMan ® Array CardによるRT-qPCR では、
1well あたりわずか 1μl の反応系でも、2ステップ反応とほぼ同等の解析データが得られました。
● 1 時間程の逆転写作業を省き、RNA からわずか 60 分でより簡単に、より早く、網羅的な遺伝子発現解析ができました。
Next_24.indd 09
製品名
サイズ
製品番号
TaqMan ® Fast Virus 1-Step Master Mix, 1ml
200 反応
4444432
¥49,600
価格
TaqMan ® Fast Virus 1-Step Master Mix, 5x1ml
1,000 反応
4444434
¥152,000
TaqMan ® Fast Virus 1-Step Master Mix, 10ml
2,000 反応
4444436
¥295,000
14/03/19 11:34
page
Invitrogen™
10
Lipofectamine ® 3000 でゲノム編集の効率を、もっと高く
Introduction
イントロダクション
してベクターを構築しました。使用した TALENs のフォワード鎖とリ
バース鎖は FokIヌクレアーゼを含み、AAVS1 safe harbor locus
を標的にしています。またオール・イン・ワンCRISPR ベクターシステム
ゲノム編集は、細胞ゲノム内の基本的にどの位置においても遺伝
子のノックアウト、または外来遺伝子をノックインするための技術で
す。生物種を選ばず、動物細胞、魚類、植物、昆虫などほぼすべての生
物で利用できる魅力があります。代表的ツールは Transcriptional
activator-like effector nucleases（ TALENs ）や Clustered
re g u l a r ly i n t e rs p a ce d s h o r t p a l i n d ro m i c re p e a t s
（ CRISPRs ）であり、それらは DNA を切断するヌクレアーゼと、それ
には、Cas9ヌクレアーゼ発現カセット、および AAVS1 safe harbor
locus を標的とするガイド RNAクローニング・カセットが含まれ、下流
には Orange fluorescence protein（ OFP ）レポーターが結合して
います。さらに、ネガティブコントロールとしてプラスミドpcDNA™3.3
を使用しました。プラスミド調製は PureLink ® HiPure Plasmid
Filter Maxiprep Kit を用い、エンドトキシン活性が低く、高品質な
DNA であることを確認しました。
をゲノム内の任意の遺伝子座にデリバリーするエレメントで構成され
※詳細な実験条件は、Lipofectamine ® 3000ウェブページのアプリケーション
ます。ひとたび標的部位で DNA が切断されると、宿主細胞の修復機
ノートを参照ください。→ www.lifetechnologies.com/3000
構が働く過程で欠失や挿入が起こり、ノックアウト、ノックインが生じま
す。しくみはシンプルですが、ゲノム編集の成功率は、切断する場所の
特性のほか、TALEN や CRISPR を細胞内で発現させるベクターの導
GeneArt ® Precision TALまたは GeneArt ®
CRISPR Nuclease Vector でトランスフェク
入効率など、ワークフローの一つひとつのステップに左右されます。ま
た遺伝子改変が生じた細胞の割合が少ないと、その後に続く目的細胞
ションした細胞
のスクリーニングが非常に煩雑になります。したがって最終的に目的の
細胞の可溶化（ 30 分）
細胞・個体を短期間かつできるだけ少ない手間で効率的に得るには、ゲ
ノム編集ワークフローの各ステップにおいて、効率を最大化する技術
ゲノムDNA 中の
の採用が必要です。さらにゲノム編集では、遺伝子改変が目的の個所
インデル（挿入欠失）
で生じているか、また別の個所で変異が生じていないか（オフターゲッ
ト）を評価するプロセスを経て、ノックアウトモデルの確立を目指しま
PCR（ 2 時間 10 分）
す。したがってこれらの下流のワークフローを簡便化するツールも求め
インデル
られます。
新製品の L i p o fe c t a m i n e ® 3 0 0 0 は、当社がもつ最新の脂質ナノ粒
変性および再アニーリング
子テクノロジーを利用し、高い再現性で遺伝子導入効率を向上させま
ミスマッチ
す。特に様々な導入困難な細胞においても導入効率と細胞生存率が向
上します。今回、HepG2 細胞または U2OS 細胞のゲノム編集において、
トランスフェクション効率が改
Lipofectamine ® 3000 を用いることで、
善し、TALEN や CRISPR によるゲノム編集の効果が改善することがわ
かりました。ゲノム編集の効果測定には、新製品 GeneArt ® Genomic
NEW!
ミスマッチの検出
Cleavage Detection kit を使用し、従来よりも少ないステップ、かつ
簡便な操作で目的部位の遺伝子改変効率を評価しました（図 1 ）。これら
のツールを組み合わせることで、ゲノム編集効率の改善、およびその評
価に係る煩雑な作業を最小限にできます。
電気泳動（ 30 分）
Materials & Methods
材料及び方法
［プラスミドの設計と調製］
G e n e A r t ® P re c i s i o n TA L s および G e n e A r t ® C R I S P R
Nuclease それぞれについて AAVS1 safe harbor locus を標的に
Next_24.indd 10
図 1. GeneArt ® Genomic Cleavage Detection Kit の 5ステップ・ワークフロー
細胞を溶解後、ゲノムDNAを精製せずに、そのまま特異的プライマーで標的領域をPCR 増幅します。こ
の PCR 産物を変性して再アニールすると、indel 導入箇所でヘテロ二本鎖のミスマッチが形成されます。
このミスマッチをキット中の特別な検出酵素が認識、切断します。切断後の産物はゲル電気泳動で容易
に検出、定量化できます。
14/03/19 11:34
page
11
Invitrogen™
Technical Review
生物学的に重要な細胞モデルにおけるゲノム編集結果を改善
A
B
Results
結果
ヒト骨肉腫由来の U 2 O S 細胞、および
ヒト肝細胞がん由来 H e p G 2 細胞を
L i p o fe c t a m i n e ® 3 0 0 0 でトランスフェク
ションした結果、どちらの細胞でも高いトラン
スフェクション効率を示しました。そこで、タ
ンパク質の発現を Lipofectamine ® 2000
図 2 CRISPR ベクター使用時のトランスフェクション効率とタンパク質発現
ベクターは OFP レポーター遺伝子を含み、Lipofectamine ® 2000 Reagentまたは Lipofectamine ® 3000 Reagentで（ A ）U2OS と
（ B ）HepG2 細胞にトランスフェクションしました。上のグラフ（上）はレポーター遺伝子の発現、下はOFP 発現細胞の蛍光画像を示します。
の場合と比較しました。
トランスフェクション
効率やタンパク質発現は OFPレポーター遺
伝子を含む CRISPR コンストラクトで評価し
A
ました。
B
L i p o fe c t a m i n e ® 3 0 0 0 でトランスフェク
ションをした U2OS 細胞のトランスフェクショ
ン効率は 2 倍（データ未掲載）、蛍光強度は 4
倍に向上しました（図 2A ）。HepG2 細胞で
は、
トランスフェクション効率は 20 倍（データ
未掲載）、蛍光強度は 80 倍に向上しました（図
2B ）。
最も重要なことは、Lipofectamine ® 3000
でトランスフェクトした細胞では、
トランス
フェクション効率やタンパク質発現が増加
し、どちらも AAVS1 標的位置での TALEN や
CRISPR による切断が増加したことです。つ
まりLipofectamine ® 3000 でトランスフェ
クションした U2OS 細胞では TALEN 切断効
率が 1 . 5 倍に、C R I S P R での切断もわずか
に向上しました（図 3 A ）。H e p G 2 細胞では、
図 3. GeneArt ® TALENs と CRISPRs の切断効率
TALEN 切断効率が 3 倍に、CRISPR の切断
効率は 8 倍に向上しました（図 3B ）。
TALENs と CRISPRs は（ A ）U2OS および（ B ）HepG2 細胞の AAVS1 部位をターゲットとし、
切断は GeneArt ® Genomic Cleavage Detection Kitを使って評価しました。
Conclusion
結論
トランスフェクションが困難な細胞株のトランスフェクション効率を改善し、その後に続く煩雑な遺伝子工学プロセ
Lipofectamine ® 3000 は、
スを最小限にするために開発されました。ゲノム編集において、Lipofectamine ® 3000 のような、よりよいトランスフェクション試薬を使うと
TALEN や CRISPR での切断効率が向上し、さらに遺伝子修飾の効果が大きく改善しました。このことは後に続くプロセス、たとえばクローンのス
クリーニングに係る手間の減少に貢献すると考えられます。
製品名
サイズ
製品番号
価格
GeneArt ® Genomic Cleavage Detection Kit
20 反応
A24372
¥42,000
GeneArt ® CRISPR Nuclease: OFP Reporter Kit
10 反応
A21174
¥180,000
GeneArt ® CRISPR Nuclease: CD4 Enrichment Kit
10 反応
A21175
¥180,000
®
®
®
Lipofectamine 3000 の製品情報はp4-5をご覧ください。GeneArt Precision TALs 、及びGeneArt CRISPR Nucleaseの製品情報はNEXT No.23 p6-7をご覧ください。
Next_24.indd 11
14/03/19 11:34
Molecular Probes®
page
12
BrdU では得られない、スピード、感度、特異性。
■ Click-iT ® Plus EdU Alexa Fluor ® 細胞周期細胞増殖アッセイ
NEW!
細胞周期や細胞増殖を検出するアッセイキットです。
DNA 複製時に核酸誘導体の EdUを取り込ませ、低分子の標識化合物との化学反応で検出します。
［特長］
● シンプルで効率的 ── BrdU 等の従来法より、シンプルで短時間のプロトコル（ 60 分）。
● 安定したデータ ── 変動しやすい抗体ロットに依存しません。
また変性ステップも激しい処理も不要なので、多くの情報を保持した組織や細胞の形態を維持します。
● 蛍光タンパク質とのマルチプレックス検出 ── GFP 、mCherry 、R-PEや R-PEタンデムなど、蛍光タンパク質を同時に検出できます。
▶ 短い露光時間、GFPとの
［ Click-iT ® EdU ］
［ BrdU ］
同時検出、そして高感度！
露光時間： 80 msec
［ Click-iT ® Plus EdU ］
露光時間： 8 msec
露光時間： 8 msec
核酸誘導体の BrdUと2 種類の EdU キットを比較す
るために、GFP を発現する細胞で増殖を調べました。
その結果、BrdU のシグナル検出に必要な露光時間
は 80msec でした（左）が、EdU キット（従来品）では
8msec で検出できました（中）。また従来キットの反
応経路を改善した、新製品 Click-IT ® EdU Plus で
BrdU
GFP
Hoechst
は、シグナル検出は 8msecと同じでしたが、GFP 蛍
EdU
GFP
Hoechst
EdU
GFP
Hoechst
光を同時に観察できるようになりました（右）。
※赤は BrdUまたは EdU 、青は核酸染色。緑は GFP 。
▶ 従来よりもアッセイ時間を
EdUまたはBrdU でインキュベートし、サンプルを固定透過処理
大幅短縮 !
HCl 変性や抗体反応が不要なので、反応時間を大幅
EdUプロトコル＋ Click-iT ® アッセイ
BrdUプロトコル
に短縮できます。反応後は、顕微鏡観察、フローサイ
®
トメトリー、ハイコンテンツイメージングなどのアプ
Click-iT 検出反応
30 分
洗浄 × 3
15 分
リケーションで解析を行えます。
洗浄 × 2
10 分
HCl 変性
40 分
核対比染色
10 分
中和
12 分
洗浄 × 2
10 分
洗浄 × 3
15 分
ブロッキング
60 分
合計 60 分
抗 BrdU インキュベーション
1 ∼ 2 時間
洗浄 × 3
15 分
二次抗体インキュベーション
120 分
洗浄 × 3
15 分
核対比染色
10 分
洗浄 × 1
5分
合計 6 ∼ 7 時間
Next_24.indd 12
製品名
サイズ
製品番号
価格
Click-iT ® Plus EdU Alexa Fluor® 488 Flow Cytometry Assay Kit
50アッセイ
C10632
¥85,000
Click-iT ® Plus EdU Alexa Fluor® 647 Flow Cytometry Assay Kit
50アッセイ
C10634
¥85,000
Click-iT ® Plus EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit
1 キット
C10637
¥75,000
Click-iT ® Plus EdU Alexa Fluor® 555 Imaging Kit
1 キット
C10638
¥75,000
Click-iT ® Plus EdU Alexa Fluor® 594 Imaging Kit
1 キット
C10639
¥75,000
Click-iT ® Plus EdU Alexa Fluor® 647 Imaging Kit
1 キット
C10640
¥75,000
14/03/19 11:34
page
Gibco®
13
蛍光イメージング実験に最適な培地が新登場！
■ FluoroBrite™ DMEM
NEW!
蛍光イメージングに最適な培地です。従来のフェノールレッド不含の DMEM 培地に比べ、
蛍光のバックグランドが 90% も減少。
生細胞イメージングで、この培地を使用すれば、S/N 比を増強させ、弱い蛍光シグナルを
可視化でき、しかもそのまま高い生存率で培養できます。
［特長］
● フェノールレッド不含培地よりも、90% も蛍光バックグラウンドを低減
● 生細胞イメージングにおいて、S/N 比を増強し、弱い蛍光シグナルを可視化
● DMEM ベースでデザインされた培地なので、細胞をより最適な状態で維持可能 ※
※ 10% FBS 、4mM L-グルタミンもしくはGlutaMAX™を添加して使用
従来のフェノールレッド不含 DMEM 培地よりも優れた FluoroBrite™ DMEM の性能
A
▶ 低いバックグラウンドと高い SN 比
FluoroBrite™ DMEM のバックグラウンド蛍光は、フェノールレッド不含の標準
DMEM の 10 分の 1に減少、S/N 比は 9 倍に増強されました。
A: フェノールレッド不含の DMEM＋10%FBS（左）、もしくは FluoroBrite™
DMEM＋10%FBS（右）中で培養を行ない、CellLight ® Golgi-GFP で標識し
た生きた上皮細胞の画像。10 倍の画像中の細胞は、CellLight ® Actin-RFP
と一緒に標識しました。40 倍の画像（挿入図）中の細胞は、ER-Tracker™ Red
（ BODIPY ® TR Glibenclamide ）と一緒に標識しました。
DMEM
FluoroBrite™ DMEM
B
C
B: PBS 、FluoroBrite™ DMEM 、フェノールレッド不含の DMEMを480nm で
励起し、509nm の蛍光シグナルを測定。
C: PBS 、FluoroBrite™ DMEM 、フェノールレッド不含 DMEM 中の Alexa
Fluor ® 標識デキストランからの蛍光シグナルとバックグラウンドによるS/N 比。
▶ 高い生存率
フェノールレッド不含の D M E M 、もしくは
FluoroBrite™ DMEM で数回継代培養した 3 細胞
株の平均生細胞密度（実線：左の Y 軸）および平均
パーセント生存率（点線：右の Y 軸）を示します。
（ど
ちらも 10%FBSと4mM GlutaMAX™ を添加）。特
に Sp2 浮遊細胞株は、栄養不足に対して感受性が高
いので、FluoroBrite™ DMEM 中で長期増殖につ
いてテストを行ないました。
製品名
Next_24.indd 13
サイズ
製品番号
FluoroBrite™ DMEM
NEW!
500ml
A1896701
¥3,600
価格
FluoroBrite™ DMEM
NEW!
¥28,800
10 × 500ml
A1896702
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red
500ml
31053028
CellLight ® Golgi-GFP, BacMam 2.0
1ml
C10592
¥29,600
CellLight ® Actin-RFP, BacMam 2.0
1ml
C10583
¥29,600
ER-Tracker Red（ BODIPY TR Glibenclamide）, for live-cell imaging
100μg
E34250
¥52,300
Dextran, Alexa Fluor® 488：10,000 MW, Anionic, Fixable
5mg
D22910
¥59,200
¥2,200
14/03/19 11:34
Molecular Probes®
page
14
大きな DNA インサートを哺乳類細胞で発現できます！
■ ViraPower™ BacMam Expression System
▶ BacMamを介した遺伝子導入メカニズム
BacMam システムは、バキュロウイルス（ Bac ）を利用する
哺乳類（ Mam ）細胞用発現系です。受託サービスに加え、新し
目的遺伝子を組み込んだ BacMam 粒子は、エンドサイトーシスによっ
くベクターを製品化しました。ご自身の構築用でぜひお試し
て哺乳類細胞に取り込まれ、その後で目的遺伝子が転写・発現します。
ください。
遺伝子発現は形質導入後 4 ∼ 6 時間以内に始まり、24 時間以内でほぼ
最大になります。通常、
トランスジーンは 5 日∼ 14 日まで検出できます。
NEW!
ただし形質導入効率、細胞タイプ、細胞分裂割合で変動します。
▶ BacMam 導入・発現システムの利点
● 初代細胞や幹細胞を含む、
様々な哺乳類細胞株へ高効率な形質導入
● 小さな細胞変性効果
（ウイルス感染時の細胞形態変化）
※
● 大きな DNA インサートを導入可能
（ 38kb の論文実績あり
）
※ Cheshenko N et al.（ 2001 ）Gene Therapy 8, 846–854
▶ ウイルス添加量を変えることで発現レベルを容易に、しかも再現性高く調節
U2OS 細胞への GFP 発現 BacMam の導入
GPP Fluorescence vs. %vol BacMam Reagent
RFU
B a c M a m G F P Tra n s d u c t i o n C o n t ro l
（ BacMam 2.0 ）※ 1×10 8 pfu/ml を 10,000 細胞 /
ウェルの U2OS 細胞へオーバナイトで形質導入。バッ
ファーで 2 度洗浄後、FDSS 上で画像を取得し（左）、
RFU 値はFlexStation 上でカウントしました（右）。
※本データで用いたBacMam GFP Transduction
Control を含む CellLight シリーズはバッファー交換済みです。
BacMam 発現系は、限外濾過でバッファー交換でき、交換バッ
ファーには、例えば Live cell imaging solution＋1% BSA が
使えます。ただしこの溶液では、長期間の BacMam 安定性は証
⇧
⇧
⇧
⇧
⇧
⇧
10%
8%
6%
4%
2%
0.5%
%vol/vol BacMam Reagent
vol/vol dilution
明されていません。
製品名
サイズ
製品番号
価格
BacMam pCMV-Dest Vector
10μg
A24223
¥102,000
ViraPower™ BacMam Expression System
1キット
A24227 ※
¥188,000
※ A24227は、A24223に加えCellfectin ® II Reagent 、MAX Efficiency ® DH10Bac™ Competent Cellsを含んだキットです。
［受託サービス］カスタム BacMam 作製
BacMam 発現ベクターをご提供いただきバキュロウイルスを作製する受託サービスです。
→ www.lifetechnologies.com/s-bacman
Next_24.indd 14
製品名
サイズ
納期
Standard BacMam Service（ with titer ）
100ml
約 10 週間
¥1,200,000
価格
Standard BacMam Service（ with titer ）
200ml
約 10 週間
¥1,300,000
14/03/19 11:34
page
15
Life Technologies™
User's Voice
本田雅規氏（日本大学歯学部解剖学第Ⅱ講座
准教授）
幹細胞研究から、歯や歯周組織の再生へ
EVOS ® XL Imaging System が拓く新しい観察スタイル
成熟脂肪細胞から、
歯周組織の再生へ
本田氏（前列）と研究室の皆さん
得ることが期待できます。また間葉系幹
クターに接続して投影もできるので、今
細胞は歯の中心にある歯髄組織にも多
後は大学の講義での活用も考えていま
く含まれていますが、それらは虫歯で神
す。撮影も簡単なので、講義に使う画像
経（歯髄）を抜く際に取り除かれて捨て
データは学生に送信して予習・復習に利用
られてしまう組織です。歯髄幹細胞の医
してもらっています」。すでにほとんどの
療への有効利用も考えてみたいですね」。
学生はタブレット PC を持参しているので、
本田氏のグループは、生物資源学部や医
EVOS ® システムの導入で電子化授業は
学部の研究グループと協力し、様々な歯
さらに進化しそうです。
「日常的に顕微鏡
の細胞を利用した再生医療の研究を進
をのぞきこむ時代は終わった、という感じ
めています。
ですね」と本田氏。
顕微鏡をのぞく時代は終わった
®
歯の完全再生も目指したい
高齢で歯を失う第一の原因は、歯周病の
昨年 5 月に EVOS システムを購入した本
本田氏らは、歯を一から再生させる研究に
末期症状です。歯周病の有病率は歳を重
田氏の研究グループ。
「組織や細胞の観察
も挑んでいます。これまで成人の細胞を
ねるごとに上昇し、50 代後半になると5 割
に、ほぼ毎日使っています。これまでの顕
利用した歯の完全な再生は成功していま
近くに達するという報告もあります。
微鏡と比べてとても軽いので、研究室で
せん。歯の形は胎生期に決まり、あとはほ
「歯と骨をつなぐ歯周組織には、歯を支え
は皆自分の机に持ち運んで観察していま
ぼその形のまま大きくなります。
「一から
る大切な役割があります。私たちは、この
す。立ち上げや操作も簡単なので、標本を
完全な歯をつくることは、体性幹細胞では
難しいかもしれません。一方、胎児マウス
組織の再生を目指して研究を進めていま
作成した後すぐに結果を見たい場合に重
す」と話すのは、日本大学歯学部の本田雅
宝します」と本田氏。EVOS ® システムの
の細胞を利用すると、歯がうまく再生する
規氏。
手軽さで研究もさくさくと進んでいるよう
ことが知られています。人への応用を考え
です。
ると、iPS 細胞から歯の形成につながる細
「最近、同じ大学の生物資源学部の研究
グループが、成熟脂肪細胞の培養方法を
「また一度に複数の人が観察できるので、
胞を作製してみてもよいかもしれません」
変更するだけで間葉系幹細胞に類似した
グループ内でのディスカッションにも利用
と語ります。様々な細胞を利用した研究が、
幹細胞が得られることを発見しました。こ
でき、学生にピンポイントで標本を説明す
歯の再生医療を土台からしっかりと支えて
れにより脂肪組織から幹細胞を大量に
る時にも便利ですね。そのままプロジェ
います。
早く、便利で簡単な明視野デジタルイメージングシステム
■ EVOS ® XL Imaging System
製品組み合わせ例
価格
本体： EVOS ® XL（ AME3300 ）
電源ケーブル： Power Cord（ AMEP4644 ）
対物レンズ： Plan Achro 10X LWD PH, 0.25NA/6.9WD（ AMEP4633 ）
¥1,158,000
ベッセルホルダー： Vessel Holder, Universal（ AMEPVH009 ）
※上記は組み合わせの 1 例です。用途にあわせて多数のアクセサリーからカスタマイズできます。
EVOSシリーズは、蛍光顕微鏡を含めて 5 種類
デモ依頼・資料請求はこちらまで
↓
www.lifetechnologies.com/evos
Next_24.indd 15
14/03/19 11:34
Molecular Probes®
page
16
サブミリセカンドの迅速な反応性と高い検出感度
■ FluoVolt™ Membrane Potential Kit
NEW!
FluoVolt™ Membrane Potential 色素は、膜電位の変化に対応して、蛍光が変化する
新しい蛍光試薬です。迅速な膜電位変化を高感度に検出します。
［特長］
● 高速反応性：興奮細胞のわずかサブミリセカンドの電位変化を検出
● 高感度：100mV 当たり25% 以上シグナルが変化
di-3-ANEPPDHQ は 100mV 当たり2–10%
● 使いやすさ：バックグラウンド蛍光抑制試薬と細胞へのローディング用試薬を同封
FluoVolt™ Membrane Potential 色素による
分化 NG-108 細胞の膜電位変化の観察
10 ミリセカンドの照射パルスで、細胞をイメージン
グし、2 × binning でイメージを取得しました（左）。
自発的に脱分極と再分極を繰り返す 3 つの培養細胞
の蛍光応答トレースしました（右）。
製品名
サイズ
製品番号
価格
FluoVolt™ Membrane Potential Kit
1 キット
F10488
¥65,000
バックグラウンド防止効果が高まり、より鮮明な画像を！
■ Fluo-4 Cytosolic Calcium Imaging Kit
NEW!
細胞質のカルシウム濃度を高感度にイメージングするキットです。必要な試薬一式が揃っています。
［特長］
● カルシウムと結合することで、感度良く蛍光が増加
● Neuro Background Suppressor（バックグラウンド蛍光の抑制試薬）、PowerLoad™（細胞へのスムーズなローディング用試
薬）、水溶性プロベネシド（ Fluo-4 を細胞外に運ぶトランスポーター阻害用）を含み、すぐに実験開始
ニューロン発火による
カルシウムスパイクのイメージング
Next_24.indd 16
製品名
サイズ
製品番号
価格
Fluo-4 Cytosolic Calcium Imaging Kit
1 キット
F10489
¥61,000
14/03/19 11:34
page
Novex®
17
User's Voice
池田正明氏（埼玉医科大学医学部生理学教授、同ゲノム医学研究センター分子時計プロジェクト・プロジェクトリーダー）、熊谷恵氏（助手）
時計遺伝子を軸に研究と医療の現場をつなぎたい。
ウェスタン解析は iBind™ Western System で効率化！
およそ一日周期で体温や行動のリズム
指して研究を進めています。2010 年には、
が継続する動物の概日時計。哺乳類では、
PPAR-γ（ Peroxisome ProliferatorActivated Receptor-γ）という脂質代
脳の視床下部に存在する視交叉上核を中
枢とする時計遺伝子の転写・翻訳のフィー
謝に関連する転写因子が時計遺伝子に
ドバック機構が、概日リズム発振の分子基
よってリズム性の発現制御を受けること
盤として知られています。埼玉医科大学
を報告しました。
「臨床の現場との連携が
医学部の池田正明氏は、コア時計遺伝子
欠かせません。将来的には時間薬理学の
Bmal1 を世界に先駆けて発見し、続いて
その機能を補完する時計遺伝子 Bmal2
ます。
分野などにも応用したいですね」と語り
池田氏（左）と熊谷氏（右）
を同定しました。時計遺伝子を軸に研究
と医療の現場をつなぎ、臨床医の育成に
も取り組む池田氏に、iBind™ Western
タンパク質解析は iBind で効率的に
すね。学生の研究効率も上がり、私も助
「これまでスタッフから新しい装置導入
かっています。解析結果の再現性や精度
System の活用法を伺いました。
のリクエストはあまりなかったのですが、
時計遺伝子研究を医療に役立てる
iBind™システムは、強く推されましたね」
と笑う池田氏。助手の熊谷恵氏は、4 名の
池田氏は、うつ病など精神疾患の日内変
にも満足しています」と熊谷氏。
医学部生にタンパク質解析、遺伝子発現
研究マインドをもった
臨床医を育てたい
動に興味があり、大学院生の頃から体内
解析、細胞培養など実験の基礎を指導し
学部生が通年でラボに所属して基礎研究
時計の研究をはじめました。そしてショウ
ています。学生がラボで研究できるのは
に従事する「課外学習プログラム」は、埼
ジョウバエの period 遺伝子産物に含まれ
講義が終わる夕方以降。初心者で時間
玉医科大学が全国に先駆けて実施する取
る PAS ドメインを手がかりに、哺乳類の
が限られた学生でも、失敗なく使いこな
り組みです。遺伝子診断等、新しい技術と
胎児脳ライブラリから時計遺伝子 Bmal1
せる手軽さが i B i n d ™ システムの特徴
も向き合う将来の臨床医に、科学的なプ
をクローニングすることに成功（ 1 9 9 7
です。
「これまでウェスタン解析はマニュ
ロセスに基づき診断・検査を行う
“ 研究マ
年、2 0 0 0 年）。現在、名付け親となった
アルで行い、1 5 分から 1 時間おきに何度
インド”を身に付けてもらう。それがこの
Bmal1 の機能解析を中心に、時計遺伝子
も液替えや溶液の準備をしていました。
プログラムの目標です。池田氏は研究だ
と関連する生活習慣病、がん、精神疾患
i B i n d ™ システムなら、別の実験や作業
けでなく、将来の医療への貢献も念頭に
などの疾患の解明や、治療法の開発を目
を中断せず、集中できるところが良いで
研究を進めています。
ウェスタンブロッティングの抗体反応を自動化
■ iBind™ Western System
ウェスタン解析のブロッキング∼二次抗体反応・洗浄までのプロセスを自動で行うシステムです。
電源が必要ないので、実験室のどこでも使え、無音で反応が進みます。
自動化・ハンズフリーによる利便性に加え、マニュアルよりも良好なウェスタンデータが得られます。
［特長］
● すべての抗体反応・洗浄ステップを自動化
● オーバナイトで抗体反応の必要なく、全反応時間は約 2.5 時間で終了
● 高感度で再現性の高いクリアなデータ
● 煩雑な液交換作業から解放され、他の実験や研究に集中できます。
製品名
Next_24.indd 17
サイズ
製品番号
価格
iBind™ Western Starter Kit
：1 台 / iBind™ Cards（ SLF1010 ）
：10 枚 / iBind™ Solution Kit（ SLF1020 ）
：10 反応分
iBind™ Device（ SLF1000 ）
SLF1000S
¥168,000
iBind™ Western Device
1台
SLF1000
¥158,000
iBind™ Cards
10 枚 / 箱
SLF1010
¥17,000
iBind™ Solution Kit
1 キット（ 10 反応分）
SLF1020
¥8,000
14/03/19 11:34
page
Invitrogen™
18
網羅的なヒトプロテオーム解析ツール
■ ProtoArray ® ヒトタンパク質マイクロアレイ v5.1
9000 種以上ものタンパク質に対する生化学的機能を一度に解析
可能な高密度タンパク質マイクロアレイです。
［特長］
● 様々な疾患に関連する重要な 9000 種類以上の
ヒトタンパク質を搭載
9000 種以上のタンパク質が一枚のアレイに！
● 25mm×75mm サイズのアレイに、各タンパク質を 2 か所ずつ
Alexa Fluor ®647 標識の抗 GST 抗体でプロービング・スキャンした画像データ
スポッティング。より精度の高いデータを取得
▶ 幅広いアプリケーションに対応
ProtoArray ®は高密度で機能的なタンパク質のマイクロアレイです。
先進的なシステムとして、数千に上る生化学的な相互作用を迅速にプロファイリングします。
バイオマーカーの探索、標的薬剤の発見、酵素基質の同定、特異抗体のプロファイリングやタンパク質 ─タンパク質相互作用まで幅広いアプリケーションで使えます。
①免疫応答バイオマーカープロファイリング
（ IRBP ）
がんや自己免疫疾患等に特異的なバイオマー
②タンパク質 ─ タンパク質相互作用（ PPI ）
③キナーゼ基質同定（ KSI ）、
生物化学的パスウェイにおけるタンパク質間相互
ユビキチンリガーゼ基質同定（ USI ）
作用マッピング
ターゲット探索およびバリデーションのため、
カーを 9000 以上の抗原から迅速に探索
キナーゼやユビキチンリガーゼの基質を同定
ユビキチンリガーゼ複合体
B
E1 E2
E3
A
Ub
Ub
Ub
G2-00
123 45
S
Ub
④低分子 ─ タンパク質相互作用（ SMI ）
健常（対照）
疾患モデル（実験）
サンプル
サンプル
⑤抗体特異性プロファイリング（ ASP ）
目的の低分子化合物と相互作用するタンパク質
基礎ならびに医学研究目的の抗体開発のための
の同定
抗体特異性プロファイリング
抗ヒト××抗体
比較
製品名
サイズ
製品番号
ProtoArray ® Human Protein Microarray
1アレイ
PAH0525101
ProtoArray ® Human Protein Microarray
20アレイ
PAH05251020
価格
¥258,800
¥3,200,000
ProtoArray ®を使用した解析は、受託サービスをご利用いただけます。
※ 受託サービスの詳細は、サービスラボへお問い合わせください。TEL: 03-5753-3006 E-mail: jpcustom＠lifetech.com
製品名
免疫応答バイオマーカープロファイリング
※2
実験系の概要※ 1
使用アレイ数
実験区 5 サンプル、対照区 5 サンプル、NC
11アレイ
8 週間∼
¥2,400,000∼
納期
価格
抗体特異性プロファイリング
抗体 2 濃度で1 枚ずつ、PC 、NC
4アレイ
8 週間∼
¥1,200,000∼
キナーゼ基質同定
キナーゼ 2 濃度で2 枚ずつ、PC 、NC
6アレイ
8 週間∼
¥1,800,000∼
キナーゼ阻害効果検定
キナーゼ 2 濃度と阻害剤有無で2 枚ずつ、PC 、NC
10アレイ
8 週間∼
¥2,200,000∼
タンパク質 - タンパク質相互作用プロファイリング
タンパク質 2 濃度で1 枚ずつ、PC 、NC
4アレイ
8 週間∼
¥1,500,000∼
※ 1 PC：Positive Control 、NC：Negative Control ※ 2 例：健常 5 サンプル、疾患モデル 5 サンプル
Next_24.indd 18
14/03/19 11:34
page
19
Life Technologies™
いつ行く ? どうする ? 海外留学
Title
Name
Number
ドイツ留学で感じた
“幸せとメリハリ”の研究ライフ
06
上川内あづさ氏（名古屋大学大学院理学研究科生命理学専攻脳回路構造学・教授）
ショウジョウバエが音と重力を感じ分ける神経基盤を2009 年
G ö p f e r t 氏（以下マーティン）が、一緒に研究しないかと
にNature 誌で発表し、その後、36 才の若さで名古屋大学の
誘ってくれたのです。翌年、上川内氏は“ 遊びに行くような
教授となった上川内あづさ氏。
「子供の保育園の迎えもある
感じ”でマーティンのラボを 2 週間ほど訪れます。マーティン
ので、18 時半にはラボを出ます。一般的な研究者より早いと
夫婦の自宅に泊まり、週末はドライブを一緒に楽しみました。
思われるかもしれませんが、切り替えを上手くやれれば仕事
「マーティンにポスドクを雇う予算がなかったため、日本で
の効率は逆に上がる。これはドイツ留学で身につけたやり方
奨学金を得てから留学しました。
ドイツにいる間に、フンボル
です」と穏やかに語ります。
ト財団と、新たに日本の奨学金にも応募。うまく採用された
ので、2005 年から 3 年間、
ドイツで研究を続けることができ
たのです」と振り返ります。
ショウジョウバエの求愛歌で脳を解明
もともと脳に興味があったという上川内氏。脳の謎に一番早
ドイツ流の研究スタイル
く迫れるモデル生物はショウジョウバエだと考え、博士研究員
ドイツ語が分からない苦労は幾分感じたものの、セミナーは
として伊藤啓研究室（東京大学）に参加しました。
“ 求愛歌”
と
英語なのでなんとか理解できたという上川内氏。印象に残っ
いう、雄が種ごとに異なる羽音を奏でる求愛行動に注目し、カ
ているのは、ラボのコーヒータイムです。朝 1 回、午後に 1 回、
ルシウムイメージングなどを駆使した独自の手法を開発しな
自然にスタッフや学生が集まりコーヒー片手にお喋りする時
がら、研究を進めています。
間です。
「自分の実験を優先させるよりも、そういう場でみん
「神経細胞の個数が少ないシンプルなハエの脳で、脳回路構
なとのコミュニケーションをとることにしました。仲間から得
造と行動を包括的に解明したい。シンプルといっても、構造
る情報やアドバイス、そしてリラックスしたひと時が、日々の
的にも、行動的にも、ハエとヒトは似たところがあります。たと
研究を活き活きとするように感じました」
（上川内氏）。公私の
えば、雄が求愛歌のダンスを踊ると、雌は蹴ったり、産卵管を
切り替えが上手く
“幸せ”そうに研究生活を楽しむドイツの同
突き出し攻撃したりする。拒絶された雄は、ショックでしばらく
僚たち。休むことに罪悪感がないのも、日本との違いかもし
求愛できなくなることもあって。観察していて面白いですね」
れないと話します。
（上川内氏）。
国際学会で発表しよう！
出会いは学会のポスター発表
留学に不安がある人は、国際学会に参加して海外の研究者と
留学のきっかけは国際学会への参加です。ポスター発表
積極的にコミュニケーションをとってほしい。上川内氏はアド
で隣り合った同じショウジョウバエ研究者の M a r t i n C .
バイスします。
「たとえ博士研究員を公募していないラボでも、
自分で奨学金をとって行けることもあります。まずは相手を
知っていれば、後は研究室を移動するだけの話。どんどん国
際学会で発表して自分の研究をアピールし、行きたいと思う
ラボをみつけることですね」
（上川内氏）。
プロフィール： 1975 年東京都生まれ。1997 年年東京大学薬学部卒業、2002 年同
大学大学院薬学系研究科機能薬学専攻博士課程修了。2002 年基礎生物学研究
所・発生生物学研究部門科学技術振興機構 BIRD 研究員、2005 年ドイツケルン大
学に留学、2008 年∼ 2011 年東京薬科大学生命科学部助教授、2011 年より現職。
留学中のラボメンバーとケルン大学キャンパスで撮影。真ん中の青
Next_24.indd 19
2010 年より、JST さきがけ「脳情報の解読と制御」研究者を兼任。平成 22 年度、文
いジーンズ、青いシャツの白髪の男性が研究室リーダーの Martin
部科学大臣表彰若手科学者賞を受賞。平成 24 年度、日本神経科学学会奨励賞を
Gopfert 博士（現在はゲッティンゲン大学の教授）、前列右に上川内氏。
受賞。
14/03/19 11:34
INFORMATION
2014 / April / No.24
Century of Amazing Science
It ’
s your time – in this century of amazing science – to effect exponential change in the world.
s our promise to empower you with innovation that you do it faster.
And it ’
2014 年、ライフテクノジーズは輝かしい科学の世紀を盛り上げて参ります。
今年もイベントや楽しい企画を準備中。ぜひ今後の活動にご注目ください。
サーモフィッシャーサイエンティフィックの一員へ
この度、ライフテクノロジーズは、世界的な科学サービス企業のサーモフィッシャーサイエンティフィックの一員となりました。両社の統
合がもたらす多様な製品ラインをもって、私たちは皆様のライフサイエンス研究の加速、そして人々の生活や健康の向上に貢献できる
と確信しています。皆様の研究を支えるパートナーであることを心から誇りに思い、一丸となってお役にたてるようにこれからも努力し
てまいります。そして、より健康で、より清潔で、より安全な世界を皆様とともに目指していきたいと願っております。
ThermoFisher Scientific recently completed its acquisition of Life Technologies. We are excited about what our combined product lines can do to help accelerate life
sciences research and improve human health. As we integrate our companies, our commitment to serving our customers remains our number one priority. Thank
you for choosing us as your partner in science. We look forward to working with you to make the world healthier, cleaner and safer.
Dale H. Patterson, Ph.D. Vice President, General Manager of Japan / Life Science Solutions, Thermo Fisher Scientific
抽選で
QUOカード
プレゼント !
NEXT 4 月号はいかがでしたか ?
今回の特集は、大阪大学微生物病研究所教授の伊川正人氏。一言ひとことにゲノム編集技術が拓く新しいサイエンスの世界を実感でき
ますね。新製品「 Lipofectoamine ® 3000 」の情報も、開発者の熱いインタビューとともにお届けします。そして今号もたくさんのユー
ザーの方の声をいただきました。人気の留学記は、マイペースで留学を乗り越える極意を語る上川内氏です。ぜひご参考に ! 読者アン
ケートで皆様のご希望やご感想をお寄せ下さい。アンケートご回答者から抽選で 10 名様に2000 円の Quoカードをプレゼント! バックナ
ンバーや抜粋記事もご覧いただけます。→ URL: www.lifetechnologies.com/nextforum
公式 Facebook ページ&Twitter もチェック! facebook.com/LifeTechnologiesJapan
@LifetechJPN
販売店
記載価格は2014 年 4 月現在の価格です。消費税は含まれていません。
価格は予告なしに変更する場合がありますのであらかじめご了承ください。
最新の価格および在庫数は、弊社ホームページ右上の
“製品価格と在庫の検索”
でご確認いただけます。
研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。
記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。
販売条件はこちらをご覧ください。www.lifetechnologies.com/TC
The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners.
©2014, Life Technologies Japan Ltd. All rights reserved. Printed in Japan.
LFT061-A1403OB
ライフテクノロジーズジャパン株式会社
本社：〒108-0023
大阪：〒564-0052
東京都港区芝浦 4-2-8
大阪府吹田市広芝町 10-28
TEL.03（ 6832 ）9300 FAX. 03（ 6832 ）958
TEL.06（ 6389 ）1201 FAX. 06（ 6389 ）1206
ウェブサイト: www.lifetechnologies.com
Next_24.indd 20
14/03/19 11:34

Download Report