コメットアッセイ: 遺伝毒性を検出するための強力な解析法 - J

｢労働安全衛生研究｣, Vol. 3, No.1, pp.79-82, (2010)
技術解説
コメットアッセイ: 遺伝毒性を検出するための強力な解析法†
翁
祖
銓*1 小
川
康
恭*2
コメットアッセイは真核細胞における DNA の一本鎖或は二本鎖の切断量を測る上で感度がよく，定量性が
あり，そのうえ簡便，迅速，安価な方法である．今やこの方法は，産業化学物質や環境汚染物質の遺伝毒性評価，
ヒト集団における遺伝毒性影響のバイオモニタリング，分子疫学研究，さらには DNA 損傷と修復の基礎研究な
どの領域で広く応用されている．本文ではコメットアッセイの基本原理，実験プロトコール，解析方法，利点及
び欠点などを述べると共に，コメットアッセイ応用の現状を手短に紹介する．
キーワード: コメットアッセイ，DNA 一本鎖切断，遺伝毒性，分子疫学
1
標に基づき修復動態を検討できる．コメットアッセイの
はじめに
DNA 損傷を検出するために多くの手法が開発され使
基本原理は，電気泳動によりアガロースゲル中で DNA
用されている．代表的なものとして，アルカリ溶出法
を移動させることにある．顕微鏡下で見ると，泳動細胞
（alkaline elution assay：AEA），核様体沈降法
は彗星（コメット）のように見える．これは，核領域で
（nucleoid sedimentation：NS），姉妹染色分体交換法
構成される頭部と陽極へ移動しテールを構成するほどけ
（sister chromatid exchange：SCE），DNA 付加体測定
た DNA 鎖からできている(図 1)． DNA 移動量の変動
(DNA adduct measurements)，染色体異常試験
は様々な要因に依存している．例えば，ゲルのアガロー
（chromosome aberrations：CA ），小核法
ス濃度，pH，温度，そしてアルカリ性による巻き戻し時
（micronuclei：MN），不定期 DNA 合成試験
間，電気泳動における電圧，電流，そして泳動時間など
（unscheduled DNA synthesis：USD）などがある．し
である 1)．
かし，まず AEA 及び NS は細胞個々の DNA 損傷や修復
Ostling と Johanson2) が最初に単細胞レベルで DNA
能力を明らかにすることはできず，また比較的多くの細
損傷，特に DNA 二本鎖切断（DSB：double-strand
胞を必要とする．次にＳＣＥ，CA 及び MN は細胞遺伝
break），を検出するためのマイクロゲル電気泳動法を発
学的方法であるが，細胞を増殖させて評価するので処理
表した．しかしながら，Ostling と Johanson のプロト
効率から見て自ずと限界がある．さらに DNA 付加体測
コールは広く採用されていない．その理由は中性に近い
定と UDS は，技術的に厄介であるうえに同位体を使用
条件（pH＜10）を用いていたためである．その後，Singh
する必要があり感度も低い．
et al.3) は DNA 損傷を検出するためにアルカリ性条件
これらの方法より有用な方法として，単細胞ゲル電気
（pH>13）で電気泳動を行うマイクロゲル法を発表した．
泳動法（Single cell gel electrophoresis）であるコメッ
この pH では，テールへ移動した DNA 量の増大が DNA
トアッセイ(Comet assay）がある．この方法は単細胞レ
一本鎖切断（SSB：single-strand break）量そのものの
ベルで DNA 鎖切断を検出でき，また得られた切断量指
増大と連動する．また，主として不完全切除修復サイト
からなるアルカリ感受性サイト（ALS：alkali-labile site）
細胞
の数は SSB 量と相関する 4)のでこの変化とも連動する．
すなわち，ほとんどすべての遺伝毒性物質が DSB より
溶解
桁違いに多い SSB や ALS を生成するので 5)，このアッ
セイは遺伝毒性物質を同定するための方法としては非常
テール
頭部
に感度が高い．最近の 20 年間に，この方法は人間と環
境のバイオモニタリングから遺伝毒性学における DNA
電気泳動
修復の領域まで広範な分野で応用され，これらの分野に
携わる研究者にとって基本ツールとなるまでに発展した．
スーパーコイルDNA
コメット
（溶解後の核様体）
図1
コメットを構成する DNA.
† 原稿受付 2009 年 04 月 14 日
† 原稿受理 2009 年 11 月 18 日
*1 労働安全衛生総合研究所健康障害予防研究グループ.
*2 労働安全衛生総合研究所登戸地区担当
連絡先：〒214－8585 神奈川県川崎市多摩区 6－21－1
（独）労働安全衛生総合研究所小川康恭*2
E-mail: [email protected]
2
コメットアッセイのプロトコール
現在，コメットアッセイは上述の Singh et al.3)が実用
化したアルカリ性条件下による方法が最も頻繁に使用さ
れており，コメットアッセイのガイドラインが
International
Workshop
on
Genotoxicity
Test
Procedures 6)に解説されている．その方法を以下に簡潔
に述べる．図 2 で示すように，細胞をガラスのスライド
（またはプラスチックフイルム）の上でアガロースの薄
層に封入し，溶解液（ 100mMEDTA ， 2.5MNaCl ，
80
用意した細胞
0.75％低融点ゲル
Tail
Head
電気泳動
溶解
Tail length
中和
図2
染色
蛍光顕微鏡分析
Total Acreage of Head Intensity:
アルカリ性コメットアッセイにおける主要なステップ．
Total Acreage of Tail Intensity:
1%N-lauroylsacosine，10mMTrizma base と 1%のトリ
トン X-100 pH=10）中で 60 分間溶解する．この操作
Tail%DNA =
/(
+
) × 100%
により，膜と可溶性細胞成分ばかりではなくヒストンも
取り除かれ，スーパーコイル化された DNA が核マトリ
Tail Moment (TM) = Tail length × Tail%DNA/100
クスに付着した状態で残る．次に，アルカリ性溶液（1mM
EDTA 300mM 水酸化ナトリウム pH＞13）に 20 分
図3
画像解析法により求められる指標．
間浸しスーパーコイルの巻き戻しを行うと共に DNA を
一本鎖化する．このスライドをアルカリ性条件下（pH＞
解析において％tail DNA が唯一無二の測定項目である
13）で電気泳動（25V
300mA，20 分）する．電気泳
べきだとのコンセンサスは未だ得られていないので，な
動後，スライドを適当なバッファ（例えば trizma，
かには％tail DNA ではなく tail moment の測定値しか
pH=7.5）で 5 分間すすぎアルカリ性のゲルを中和した後，
出力されない測定システムがあり，その場合は tail
無水エタノールに 5 分程度浸すことによって脱水する．
length のデータがなければ％tail DNA を算出できない．
最終的にエチジウムブロマイド等を用いた DNA 染色を
なお，得られた結果の代表性が確保されるためには 1 ス
行い，コメットのテールを蛍光顕微鏡によって観察する．
ライドあたり少なくとも 50 個のコメットを解析するこ
とが推奨されている．
3
画像解析システムの利用もしくは人力による得点化
その他の定量法として，DNA 移動パターンを人力に
個別細胞の DNA 移動パターンを定量化するための
より得点化する方法がある．それは，テールの相対的強
様々な画像解析システム（あるいはソフトウエア）が流
度を 5 段階に分類した典型的な例を提示して（図 4）目
通しており，また無料で入手できるソフトウェアもある．
視計測でコメットを評価する方法である．この場合，1
コンピュータを用いた画像解析法により得られる指標
サンプル当たり 100 個のコメットを計測すると全体とし
は%tail DNA，tail moment，もしくは tail length で
て 0－400 の間の得点を得る 7)．
ある．一般的には，％tail DNA はテール中の DNA 量を
細胞中の全 DNA 量で割った値に 100 を掛けた値，tail
length はコメット頭部の中心もしくは推定される境界
線からテール末端までの距離，そして tail moment は％
tail DNA と tail length の積として定義される．現在広
0点
1点
2 点
く使われている定義を図 3 に示す．理論的には，tail
moment は DNA の移動量とテール中の DNA の相対量
の両方を考慮しているので，誘発された DNA 損傷量の
適切な指標である．しかしながらその tail moment の測
定法は標準化されておらず，異なった画像解析システム
は異なった値を与えるため，研究室間でデータを比較す
る場合には問題が生ずる．その際特に tail length が問題
3点
図4
となる．定義が異なっている場合があること，その値が
電気泳動条件に依存することなどが原因である．それと
4
4点
人リンパ球から得られたコメットの典型例．
視覚的分類による得点を下に示す．
コメットアッセイの利点・欠点
比較すると，％tail DNA は広い DNA 損傷量の範囲でそ
アルカリ性条件（pH>13）でのコメットアッセイが
の損傷量と関連を示し，さらにこのほとんどの範囲で
1988 年に導入されて以来，本法の応用範囲と使用研究者
DNA 切断頻度と直線的に関連している 7）．よって直感的
数はほとんど指数関数的に増加した．他の遺伝毒性評価
にも理解し易い便利な指標である．しかしながら，画像
法と比較してこの方法の利点は以下の通りである．
「労働安全衛生研究」
81
(1)低レベルの DNA 損傷量を検出するだけの感度があ
タ)．このように人における遺伝子－環境相互作用に関す
る．(2) 1 サンプル当たりの必要細胞数が少なくてよい．
る情報の集積が進めば，労働者の化学物質感受性に関す
(3)手技が複雑でない．(4)実験費用が安くて済む．(5)応
る知識も増大し労働者の曝露管理をする上で有益な情報
用が容易である．(6)個別細胞のレベルでデータを収集で
を提供できることになる．コメットアッセイはこの面で
きるのでより頑健な統計解析が可能となる．(7)増殖性，
も期待されている．
7
非増殖性を問わず，イン・ビトロ，イン・ビボ何れの真
核細胞集団でも実験することができる．(8)実験時間が短
おわりに
コメットアッセイは，細胞，動物，人間に対する産業
あるいは環境変異原物質の影響を評価したり，DNA の
くて済む．
欠点としては、アルカリ性状態での巻き戻し時間，電
損傷と修復の基礎的研究を行ったりするための強力な解
気泳動時間，評価指標の定義などコメットアッセイにお
析法であると多くの人が考えている 8, 15-17)．実際，コメ
ける手技の統一性欠如のため，実験室間の比較が難しい
ットアッセイを評価手法として使っている論文の数は非
こと，また，DNA の損傷の一つである染色体異数性の
常に多い．例えば 2009 年 3 月において，Pub Med デー
種類を検出できないことなどが挙げられる．
タベースに検索語として「comet assay」を使って論文
を検索すると 4266 件ヒットしたことからも推測できる．
5
労働衛生分野における応用
1990 年代に入りコメットアッセイは労働衛生の分野
多くの報告よりコメットアッセイは低レベルの DNA 損
傷量を検出できる敏感さを持つだけではなく，遺伝毒性
8）．近年，ある種の修復関
でも遺伝子毒性の評価指標として有用であることが認識
がないときは擬陽性率が低い
されるようになり，今ではスチレンなどの有機溶剤，多
連酵素（例えば，formamidopyrimidine glycosylase，
環芳香族（PAH）,毒性の強い金属，遺伝毒性物質を含む
endonuclease III，uracil-DNA glycosylase，ヒト
粉じん，農薬などに曝露された労働者の健康影響に関す
8-hydroxyguanine DNA-glycosylase など）を組み合わ
る数多くの研究で用いられている
8）．これらの結果を検
せることにより，この分析法の感度と特異度をさらに増
討すると CA，MN，SCE など細胞遺伝学的方法で得ら
大させる試みがなされている．コメットアッセイはこの
れた結果と基本的には矛盾していない．さらに，幾つか
ように簡便で信頼できる方法であるが，さらに処理工程
の遺伝毒性物質においてはコメットアッセイの方が細胞
を減らすことができればより処理量を大きくでき，コメ
遺伝学的方法よりも鋭敏である場合がある．例えば DNA
ットアッセイの潜在能力を完全に発揮できることになる
損傷について，廃棄物処理場で働いている労働者では
だろう．
SCE で，またジェット燃料や炭化水素類に曝露されてい
る飛行場の労働者では SCE 及び MN で検出できなかっ
たにもかかわらず，コメットアッセイでは DNA 損傷が
検出されている
文
1)
9)．また，抗ガン剤を扱っている薬剤師
と看護婦の調査では，低濃度の曝露においてもコメット
なかった
2)
mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun.
11）では，コメットア
1984; 123: 291-298.
3)
SCE と共に影響指標として推奨しているが，MN は職業
Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple
technique for quantitation of low levels of DNA damage
in individual cells. Exp Cell Res. 1988; 175: 184-191.
集団における試験方法としては不適であると述べられて
いる．このようにコメットアッセイは感度が鋭敏で今ま
Ostling O, and Johanson KJ. Microelectrophoretic
study of radiation-induced DNA damages in individual
10)．さらに，最近発表された職業性スチレン曝
ッセイは特に短期影響を評価する面で有利であるとして
Fairbairn DW, Olive PL, O`Neil, KL. The comet assay:
a comprehensive review. Mutat Res. 1995; 339: 37-59.
アッセイで DNA 損傷が検出できたが MN では検出でき
露者の遺伝毒性評価に関する総説
献
4)
Angelis KJ, McGuffie M, Menke M, Schubert I.
で検出されなかった影響も検出できる可能性を示してい
Adaptation to alkylation damage in DNA measured by
る．
the comet assay. Environ Mol Mutagen. 2000; 36:
6
146-150
コメットアッセイ応用への新たな展開
近年、遺伝子－環境相互作用の研究が広く行われてお
5)
Saga A, Ishida K, Tsuda S. The comet assay with
り，この分野におけるコメットアッセイの応用が進んで
いる
Sasaki YF, Sekihashi K, Izumiyama F, Nishidate E,
12）．著者の一人もコメットアッセイを使ってこの
multiple mouse organs: comparison of comet assay
方面での研究成果を発表しており，XRCC1 (X-ray
results and carcinogenicity with 208 chemicals selected
repair cross-complementing group 1)のコドン 280 の多
from the IARC monographs and U.S. NTP
型が白血球の基底レベルでの DNA 損傷に影響を及ぼす
Carcinogenicity Database. Crit Rev Toxicol. 2000; 30:
こと
13)，
さらには
XRCC1 コドン 194 と 399 の多型が、
単核細胞の基底レベルでの DNA 損傷に影響を及ぼすこ
とを報告した
14）．また最近、ALDH2（aldehyde
dehydrogenase-2）の多型が多量飲酒者の単核細胞の
DNA 損傷量を変動させることを見出した(未発表デー
Vol. 3, No.1, pp.79-82, (2010)
629-799.
6)
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「労働安全衛生研究」

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