カードマニュアルは下記アドレスからダウンロードできます。 http://www.dojindo.co.jp/manual/gk01.html Technical Manual Get pureDNA Kit - Agarose 200 samples はじめに キット内容 キット以外に必要な試薬・機器類 保存方法 注意事項 キットの使用方法 トラブルシューティング フローチャート ････････････････････ ････････････････････ ････････････････････ ････････････････････ ････････････････････ ････････････････････ ････････････････････ ････････････････････ P2 P2 P2 P2 P2 P2 P3 P3 1 はじめに アガロース電気泳動後の目的 DNA の回収には、透析膜を用い た電気泳動濃縮法、アガラーゼのようなゲル分解酵素を用いた 方法、シリカ担体を用いた方法等が汎用されています。中でも シリカ担体を用いた方法はキットとして市販されていますが、 1)処理するゲルの使用量に制限がある、2)高分子量の DNA では 回収量が低い、という問題がありました。 Get pureDNA Kit-Agarose はゲル溶解剤、ゲル除去剤および DNA 共沈剤で構成され、目的 DNA を簡便に高回収率で回収し ます。DNA はペレットで回収されますので、バッファーで目的 濃度の水溶液に調製でき、PCR、ライゲーション等にそのまま ご使用頂けます。 キットの使用方法 ゲルスライスは 200 mg 以下でご使用下さい。 Step 1 EtBr 等で染色したアガロースゲルから目的のバンド を切り出す。 TAE 及び TBE buffer で泳動したゲルがご使用できます。ゲ ル濃度 3%以内でご使用下さい。 Step 2 切り出したゲルを 1.5 ml 遠心チューブに入れ、ピペ ットチップなどで細かく砕く。 Step 3 Gel lysis buffer 300μl を加え、60℃で 10 分間イン キュベーションする。2∼3 分毎に vortex する。 キット内容 ゲルが完全に溶解していない場合は加温時間を延長し完全 にゲルを溶解させてください。 ・Gel lysis buffer 65 ml x 1 本 ・Precipitation solution 65 ml x 1 本 ・Ｃo-precipitation solution (20 mg/ml glycogen) 0.5 ml x 1 本 保存方法 本キットは 冷蔵保存（0∼5℃）して下さい。 Step 4 Precipitation solution を添加すると沈殿が析出します。 Step 5 13,000×g 以上で 5 分間遠心分離する。 Step 6 上澄みをピペットで新しい 1.5 ml 遠心チューブに移 す。 上澄みに沈殿物が混入している際は、再度遠心分離し上澄 みのみを回収して下さい。 キット以外に必要な試薬・機器類 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 100％エタノール 70％エタノール 1.5 ml 遠心チューブ マイクロピペット及びチップ ボルテックスミキサー 60℃恒温槽 ゲルが完全に溶解した後、室温に 2 分静置する。 Precipitation solution 300μl を加え、転倒混和する。 Step 7 Co-precipitation solution 2μl を加え、5 秒間 vortex する。更にエタノール 800μl を加え 5 秒間 vortex する。 Step 8 13,000×g 以上で 3 分間遠心分離し、上澄みをピペ ットで除去する。 上澄みを完全に除去してください。微量の上澄みの残存に より、PCR 反応を阻害することがあります。完全に上澄み を除去するために、除去の最終段階では、最小容量用マイ 注意事項 クロピペット(<20 μl)のご使用をお勧めします。 ＊ゲルを切出す際、余分なゲルはなるべく含まないようにして下さい。 ＊ゲル重量が 200 mg 以上の場合は、ゲル重量の 1.5 倍容量の Gel lysis buffer 及び Precipitation solution、4 倍容量のエタノール及び 70％ エタ ノールをご使用下さい。Co-precipitation solution は 2μl ご使用下さい。 またその際 1.5 ml チューブはご使用になれませんのでご注意下さい。 ＊ゲルスライスを切り出す際は、短波長の UV 照射を避け、照射をできるだ け短時間で行ってください。 Step 9 DNA ペレットに 70% エタノールを 1 ml 加え、5 秒 間 vortex する。13,000×g 以上で 3 分間遠心分離し、 上澄みをピペットで除去する。同じ操作をもう一度 繰り返す。 Step 10 DNA ペレットはそのまま保存するか、TE buffer (10 mmol/l Tris、1 mmol/l EDTA)に溶解する。 2 トラブルシューティング 1) フローチャート DNA が回収できない、または回収率が低い。 Gel slice (---Step 1, 2) 300 µl Gel lysis buffer (---Step 3) インキュベート（60℃,10 分以上） -ゲルスライスを完全に溶解してください（（2）を参照）。 -遠心操作後、使用するチューブによっては DNA ペレットがチューブ壁 室温、2分間静置 (---Step 4) 300 µl Precipitation solution 転倒混和 面にしっかりと付着していない場合があります。上澄み除去の際に、 DNA ペレットを吸い込まないようご注意ください。 2) ゲルが溶解しにくい。 -1.5 ml チューブ内でゲルスライスをあらかじめ細かく刻んでください。 -加温溶解の際、サンプル溶液を 2 分毎にピペッティングまたは vortex してください。 -加温時間を延長し完全にゲルを溶解させてください。 3) 室温で遠心分離 (13,000xg以上、5 分間) (---Step 5) *上澄みに沈殿物が混入している際は再度 遠心分離し上澄みのみを回収して下さい * 上澄み (---Step 6) 2 µl Co-precipitation solution (---Step 7) 5 秒間 vortex 800 µl エタノール添加 5 秒間 vortex Step 6 の遠心分離後の沈殿物が固くパックされていない。 -ゲルスライスを完全に溶解し Precipitation solution を加えてください。 -Precipitation solution を加えた後、均一になるようタッピングまたは vortex を行ってください。 -13,000xg 以上の遠心が困難な場合は、フルスピードでの遠心時間を長 室温で遠心分離 (13,000xg以上、3 分間) (---Step 8) 沈殿 くし沈殿物が完全にパックされるまで遠心して下さい。尚、遠心操作は 室温以下で行って下さい。 4) 1 ml 70-75％エタノール (---Step 9) 5 秒間 vortex 室温で遠心分離 (13,000xg以上、3 分間) 取り出した DNA の純度が低い。 -Step 6 で白色沈殿物をピペットで吸いこまないようご注意ください。 吸いこんだ場合は再度遠心分離し上澄みのみを回収して下さい。 沈殿 (---Step 10) -Step 8 及び 9 において上澄み除去の最終段階では、最小容量用のマイ クロピペットを使用し、上澄みを完全に除いてください。 <開発元> <委託製造元> Dojindo Molecular Technologies, Inc. 株式会社同仁化学研究所 211 Perry Parkway, Suite 5, Gaithersburg, MD 20877 Telephone : +1-301-987-2667 Fax : +1-301-987-2687 URL : http://www.dojindo.com/ Tel: 096-286-1515(代表) Fax: 096-286-1525 ドージン・イースト（東京） Tel: 03-3578-9651(代表) Fax: 03-3578-9650 3
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