脳や神経細胞に関する研究 Ⅰ 概要 脳の働きについて、マウスやショウジョウバエを用いて実験しました。脳の実験は自分達だ けではできないので、群馬大学大学院の神経生理学・遺伝発達生理学・高次細胞生理学の３つ の分野の方々にお世話になりました。 Ⅱ 研究目的 私達は、最近テレビでよく取り上げられている脊髄小脳変性症（ＳＣＤ）や自閉症などの脳 の機能障害から起こる病気について興味を持ち、脳の働きや神経細胞の働きについて調べてみ たいと思いました。 Ⅲ 神経生理学での研修 ◇平井教授の講義◇ 平井教授は、脊髄小脳変性症を治すための方法を発見しました。しかし、マウスでは成 功していますが、人にはまだ応用できていません。 脊髄小脳変性症（ＳＣＤ）とは 小脳や脳幹、脊髄の神経細胞が破壊され、小脳が収縮する。 物事を考えることはできるが、上手に話せなくなったり体を思う ように動かせなくなるため歩行が困難になる。 約 4 割が遺伝性で、そのうち半数ほどは小脳の“プルキン エ細胞”という神経細胞が遺伝子の異常で、毒性のタンパク 質を産出し、死滅することが原因と判明しています。 日本には約２万人、北関東には約１０００人の人がこの病 気にかかっています。http://www.brain-ex.com/nanda/ 実験用動物について ＊ドブネズミ（ラット） ＊ハツカネズミ（マウス） ＊クマネズミ 体長２２～２５㎝ 体長６～９㎝ 体長１５～２２㎝ 体重２００～４００㌘ 体重１０～３０㌘ 体重１４０～２５０㌘ PCR について PCR 法とは、ごく少量の DNA 断片を試験管内で短時間のうちに何十倍にも増幅するこ とができる技術です。複製によってできた DNA は、高温にすると再び１本鎖に分かれま す。PCR 法はこのことを利用し、高温でも変性しにくい DNA ポリメラーゼによる複製と 加熱を交互に繰り返して DNA 鎖を増幅させます。 1 ◇実験１◇ PCRでネズミの爪のDNAを２３５倍に増やし、ゲルをつくって、電気泳動をする。 実験材料 DNA １μℓ PCR 緩衝液 ５μℓ 2.5ｍM のプライマー ５μℓ スタート １．５μℓ ゴール １．５μℓ PAC ポリメラーゼ ０．５ μℓ 水 ３６μℓ ゲル作成 固体のアガロースゲル電子レンジで温める 液体にして型にはめる 固まったものに電気泳動 ゲルに紫外線をあてて結果を見る 電気泳動をしたゲルに紫外線をあてる。 エチジウムプロマ ＰＣＲによってＤＮＡが増幅していると白いバンドが写る。 ◇実験２◇ イドが紫外線に反 応する マウスにＳＣＤを感染させて運動能力を調べる。その後、平 井教授が発見した方法でＳＣＤを治して、運動能力の違いを調べる。 マウスをＳＣＤに感染させる 2 これは、資格がないとできないので群馬大学の先 生にやっていただきました。 マウスを固定する マウスの頭の毛を切る メスでマウスの頭を切る 顕微鏡で小脳の位置を確認して小脳に注射をうつ ２週間後に発症 運動能力を調べる 正常なマウスは回転数を速くしてもあまり落ち ない しかし ＳＣＤのマウスはすぐに落ちてしまう 平井教授の発見した方法で治療し たマウスはあまり落ちなくなる ◇実験③◇ マウスの赤ちゃんのＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させて、タイピングをする。 マウスの赤ちゃんの爪を切る マウスをタイピングするため、爪を切る。 とても小さいので、顕微鏡で見ながらやる。 マウスに番号をつけるために決められた 指の爪を切る。 法律で規制されているため、 先生にしてもらいました。 3 タイピング 取った爪からＤＮＡを取り出し、タイピングをする。 そのために、ＰＣＲを用いてＤＮＡを増幅させる。 タイピングとはタイプを分ける作業のこと ＰＣＲ法を使ってＤＮＡを増幅させる ＜実験材料＞ ① Taq DNA ポリメラーゼ ② 塩化カリウム ③ 塩化マグネシウム ④ Tris 緩衝液 ⑤ 合成ＤＮＡプライマー 耐熱性のＤＮＡ合成酵素 ②～④ ①の酵素が働きやすい 環境をつくる ＰＣＲの結果 白いバンドが０～２本出れば成功。 私たちは５匹タイピングして、３匹は成功し２匹は失敗。 ＜成功例＞ Ⅳ ＜私達の結果＞ 遺伝発達行動学での研修 ショウジョウバエの味覚の実験 ＜実験＞ ショウジョウバエに赤色のショ糖と青色のスクロースを 寒天に混ぜて食べさせました。色の影響がでないために、暗 いところに保存してやりました。 ＜用意するもの＞ スクロース ショ糖 寒天 ショウジョウバエ 4 ＜結果＞ z 赤 １３匹 z 青 ８８匹 ＜考察＞ この結果から青のほうの糖を好むことがわかった。 パッチクランプ 細いガラスの管を細胞にさし、細胞の神経の活 動電流を調べた。前は実験で使うガラス管を自分 達でつくっていたけど、今は機械があるので楽に できている。実際に私達もつくってみた。 ◆実験① フグの毒を細胞いれた。 ◆結果① 神経が毒の影響を受けて、神経が弱まったが水で洗い流すことによって再び活動し始め た。 ＜考察＞ フグの毒にあたってしまっても、すぐに洗い流 せば死なない。 中が空洞の細いガラスを火で 溶かし、おもいっきりひっぱると 中が空洞のとても細い針 ◆実験② のようなものができる。 グルタミン酸を細胞にいれた。 ◆結果② 細胞が影響をうけた。 すごい回復力 ＜考察＞ グルタミン酸は体に必要なものだが、過剰に入れすぎると神経に影響を与えることがわ かった。 5 Ⅳ 高次細胞機能学での研修 海馬初代培養染色法 ＜用意するもの＞ 海馬初代培養神経細胞 固定液：４％リン酸バッファー 浸透液：０．１％TritonX-100inPBS 封入剤パーマフロー ＜実験手順＞ ６０ｍｍディッシュに４％PFAinPBS を６ｍℓ入れる。 ① 15 分間固定。 ② 固定液を除去し、１ｍｌPBS で rinse。 ③ カバーガラスをひっくり返して（細胞面 が上）、パラフィンの足を除去する。 ④ カバーガラスをひっくり返して（細胞面 が上）、パラフィンの足を除去する。 ＊ 細胞面が乾かないように PBS 中で行 い、細胞を傷つけないように注意する。 ⑤ カバーガラスの細胞面が上側になるようにして、シャーレに乗せる。 ⑥ 乾かないうちに染色液（DAPI:核染色用、Rho-phalloidin:アクチン細胞骨格用）を 滴下する。 ⑦ １時間内、静置。 ⑧ PBS でカバーガラスを洗浄し、余分の染色液を洗い流す。（２回） ⑨ スライドガラスに封入剤を約２０μℓ滴下する。 ⑩ 細胞面を下にしたカバーガラスを置く。（ゆっくりと空気が入らないように） ⑪ デシケータ内で封入剤を乾燥させる（１時間以上） ⑫ 蛍光顕微鏡で観察する。 ＜結果＞ 綺麗に染色できた。 （赤）アクチン、（緑）ドレブリン、（青）シナプトフィジン 6 ＜考察＞ アクチンは赤色、ドレブリンは緑色、シナプトフィジンは青に染色されたことから、染 色は成功した。 Ⅵ 感想 群馬大学に４回お世話になって、色々な実験ができて本当に良かったです。学校ではなかな かできないような実験が自分でできたので、とてもいい経験になりました。 脳についての研 究はまだあまり、進んでなくなかなか実験しにくい分野であるにもかかわらず、色々なことを 学ぶことができ、とても勉強になりました。 今回、群馬大学で色々な実験道具を利用でき、脳について色々知ることができてよかったで す。ご協力していただいた群馬大学の方々には本当に感謝しています。ありがとうございまし た。 普段はできないような実験ができてすごくいい経験になりました。自分が知らないことが多 く、いろいろなことをもっと知りたいです。今回を通して研究の楽しさを身をもって感じるこ とができました。 また、今回のような機会があったら積極的に参加したいです。 協力：群馬大学大学院医学系研究科 神経生理学 平井教授・都筑先生・斉藤先生・飯野先生・寅嶋先生 飯塚先生・小山先生・高山先生 遺伝発達行動学 柳川教授・上野先生 高次細胞機能学 児島先生・山崎先生 参考URL：http://www.brain-ex.com/nanda/ 7
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