Miltenyi Biotec Report

Miltenyi Biotec
Report
マウスモデルにおける IL-12/23 p40 抗体は
IFN-γ/IL-17 産生細胞の抑制を介し GVHD を軽減する
岡本　幸代
藤原　英晃
前田　嘉信
岡山大学大学院医歯薬学総合研究科　血液・腫瘍・呼吸器内科学
慢性 GVHD（移植片対宿主病）は、同種造血細胞移植後晩期の主な死因の一つであり、自己免疫疾患に類
似した臨床像を呈する。MACS マイクロビーズを用いて分離した細胞を別系統のマウスに移入することによ
り、慢性 GVHD のマウスモデルを構築できる。このマウスモデルに、IL-12 と IL-23 の共通サブユニット p40 を
認識するモノクローナル抗体を投与したところ、慢性 GVHD 症状の緩和がみられた。リンパ節や皮膚局所
の T 細胞を刺激すると、IFN-γ/IL-17 共産生細胞の数が抗体投与により有意に減少していることが認められた。
IL-12/IL-23 シグナルは、慢性 GVHD の予防および治療の有望なターゲットとなり得る可能性が示唆された。
ご使用いただいた MACS 製品
• gentleMACS™ Dissociator（オーダー番号 130-093-235）
• Whole Skin Dissociation Kit（ヒト）（オーダー番号 130-101-540）
• C Tubes（オーダー番号 130-093-237）
• autoMACS® Pro Separator（オーダー番号 130-092-545）
• autoMACS® カラム（オーダー番号 130-021-101）
• CD90.2 マイクロビーズ（マウス）（オーダー番号 130-049-101）
• MACSQuant® Analyzer
著者プロフィール
岡本幸代 OKAMOTO Sachiyo, MD：2009 年から岡山大学大学院医
歯薬学総合研究科大学院生、現在に至る。
藤原英晃 FUJIWARA Hideaki, MD, PhD：医学博士。2014 年より岡
山大学病院血液・腫瘍内科がんプロコース助教、現在に至る。
前田嘉信 MAEDA Yoshinobu, MD, PhD：医学博士。2004 年より岡
山大学病院血液・腫瘍内科にて助教、2014 年より同講座講師、現
在に至る。血液・造血幹細胞移植を専門とし、GVHD マウスモデル
を用いた基礎研究および臨床研究に取り組んでいる。
www.miltenyibiotec.co.jp
Introduction
に 1 匹あたり 500 μg を腹腔内投与した。
移植後期に発症する慢性 GVHD は急性 GVHD と発症時期が異な
慢性 GVHD の評価
るだけでなく、その病態も異なると考えられている。慢性 GVHD は、
マウス皮膚の状態を以下のようにスコアに表した。
同種造血細胞移植の長期生存者の約半数が発症すると言われてお
• 健康 [0], 脱毛 <1 cm2 [1], 脱毛 1-2 cm2 [2], 脱毛 >2 cm2 [3]
り、強皮症やシェーングレン症候群のような自己免疫疾患様の臨
• 耳 / 尾 / 足に皮膚病変が認められた場合、それぞれ [0.3] を加算
床症状を呈する。ステロイドが標準的な治療法であり約半数はこの
最小スコアは [0]、最大スコアは [3.9] となる
治療に反応するが、ステロイド抵抗性の慢性 GVHD 特に強皮症に
は有効な治療法が見つかっていない。
細胞内サイトカイン / 転写因子染色と解析
慢性 GVHD の病因に関しては未解明な部分が多いが、急性
Figure 2 の通りに行った。
GVHD と同様に組織への免疫学的攻撃にはドナー T 細胞が中心
的な役割を担っていることが知られている。マウスモデルを用いた
Real-Time PCR
我々の研究では、慢性 GVHD において Th1 と Th17 の増幅が起
急速凍結した皮膚サンプルから total RNA を抽出し cDNA を作製、
きており、それが病気の進行の一因となっていることを以前に報告
ABI Prism 5300 system（Applied Biosystems）にて定量的 PCR
した 1）。また、同種移植時に見られるドナー由来の IFN-γ/IL-17 共
を行った。
産生細胞は、同種抗原刺激によって誘導されたものと示唆された。
この特徴的な T 細胞は、マウスおよびヒトの種々の炎症性疾患に
おいて検出されており、その機能の解明に注目が集まっている。
Results & Discussion
IL-12 と IL-23 は、それぞれ Th1 と “alternative” Th17 の誘導を
Anti-IL-12/23 p40 抗体は、マウス慢性 GVHD 症状を緩和する
促進する鍵となるサイトカインであり、共通のサブユニット p40 を
MHC（主要組織適合性抗原）一致、マイナー組織適合性抗原
持つことが知られている。今回、我々は慢性 GVHD に Th1 と “al-
不一致の同種骨髄移植（B10.D2 → BALB/c）による慢性 GVHD
ternative” Th17 が深く関与しているとの仮説に基づき、マウスモ
モデル（Figure 1）は、これまでにも詳細な解析がなされており、
デルにおける Anti-p40 抗体の影響を検討した。
よく使用されるマウスモデルである。このモデルにおいて、移植日
から 3 日毎に Anti-p40 抗体もしくはアイソタイプコントロール抗体
Materials & Methods
を腹腔内投与して、その影響を調べた。
移植後 14 日目にキメリズム解析を行ったところ、Ly9.1+ レシピエ
慢性 GVHD マウスモデルの構築と抗体投与レジメ
ントマウス（BALB/c）の脾臓、末梢リンパ節、末梢血において、
95% 以上の CD3+ T 細胞、B220+ B 細胞が、Ly9.2+ ドナー由来
Figure 1 の通りに行った。
細胞に入れ替わっていることが観察された（完全ドナー型キメリズ
Anti-p40 モノクローナル抗体の投与
ム）。これは、Anti-p40 抗体投与群、コントロール群共に同様の結
Anti-IL-12/23 p40 抗体は、慶応大学医学部吉村昭彦先生より供
果であった（末梢血の結果を Figure 1 に示す）。
与された。 Anti-IL-12/23 p40 抗体又は、Rat IgG アイソタイプコ
慢性 GVHD スコアを Figure 3 に示す。同系移植コントロール
ントロール抗体（Sigma-Aldrich）は、移植日含め、以降 3 日毎
キメリズム解析：フローサイトメトリー
Ly9.2
A
ドナー
B10.D2 (H-2d)
骨髄
B220+ cells
レシピエント
BALB/c (H-2d)
照射
CD90.2 マイクロビーズ（マウス）
CD3+ cells
Rat IgG
Rat IgG
Syn
Syn
Ly9.1
Day
0
3
TCD-BM
Anti-p40
Anti-p40
6
9
12...
Ly9.1
T 細胞ディプリーション
分離プログラム：
DEPLETE_S
B
T 細胞ポジティブセレ
クション
分離プログラム：
POSSEL
% of Ly9.1+ cells
脾臓
100
B220
細胞移入
Spleen-T
Anti-p40 抗体、または
コントロール IgG 抗体
を 3 日毎に腹腔内投与
CD3
B220+ cells
100
80
80
60
60
40
40
20
0
CD3+ cells
20
Syn Rat
Ig
G
Anti-
p40
0
Syn Rat
Ig
G
Anti-
p40
Figure 1. 慢性 GVHD マウスモデルの構築と抗体投与レジメ
MHC（主要組織適合性抗原）一致、マイナー組織適合性抗原不一致の同種骨髄移植（B10.D2 → BALB/c）による慢性 GVHD マウスモデルの構築。 autoMACS® Pro Separator と CD90.2 マイクロビーズを用いて、
B10.D2 マウスの骨髄細胞から T 細胞をディプリーションした分画（TCD-BM）、および脾細胞から T 細胞をポジティブセレクションした分画（Spleen-T）を調製し、亜致死線量の放射線を照射した BALB/c マ
ウスに静脈注射により細胞輸注した。同様の操作を BALB/c マウス由来の骨髄と脾臓を用いて行ったマウスをコントロールマウスとした（Syn：同系移植）。Anti-p40 抗体もしくはコントロール IgG 抗体を移
植した日を含め 3 日毎に腹腔内投与し、14 日目に脾臓、リンパ節、末梢血を採取しキメリズム解析を行った。末梢血を溶血した後、白血球を CD3、CD45R(B220)、Anti-Ly9.1 抗体で染色し、フローサイトメー
ター MACSQuant® Analyzer を使用して測定し、FlowJo ソフトウェアを用いて生リンパ球にゲートをかけて解析した。
（A） Anti-p40 投与マウス、コントロール IgG 抗体投与マウス、Syn（同系移植コントロール）マウスの、末梢血 B 細胞（左）および T 細胞（右）における Ly9.1 抗原の発現解析をヒストグラムにて示した。
（B）各細胞タイプにおけるレシピエント（BALB/c）由来細胞の割合。
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マウスモデルにおける IL-12/23 p40 抗体は IFN-γ/IL-17 産生細胞の抑制を介し GVHD を軽減する
皮膚組織の採取
皮膚組織の分散
単細胞懸濁液の調製
T 細胞刺激
移植後マウス
B10.D2-BMT BALB/c
慢性 GVHD 発症
フローサイトメトリー
IL-17
PMA / Ionomycin
Anti-CD3 抗体
表面抗原の解析
細胞内サイトカインの解析
細胞内転写因子発現の解析
酵素およびプロトコール
：Whole Skin Dissociation Kit
IFN-γ
Figure 2. 皮膚組織の分散と MACSQuant® Analyzer による細胞内サイトカインの解析
同種移植後キメラマウス背中の 2 cm2 角の皮膚を、Whole Skin Dissociation Kit の酵素を用い、キットのプロトコール通りに gentleMACS™ Dissociator にかけることによって単細胞懸濁液に分散した。細胞
懸濁液を 50 ng/mL PMA + 100 ng/ml Ionomycin（Sigma-Aldrich）、もしくは 1 μg/mL Anti-CD3 抗体で 3 時間刺激し、GolgiStop（BD Biosciences）にて分泌を止めたのち、膜透過固定処理を行い、細
胞内サイトカイン（IFN-γ および IL-17）を染色した。同時に CD3 や CD4 などの細胞表面抗原、および、T-bet や ROR-γt などの転写因子の染色を行い、7 色の解析が可能な MACSQuant® Analyzer を用い
てマルチパラメーター測定を行った。データ解析は FlowJo ソフトウェア（TreeStar）を使用して行った。
（Syngenic）では皮膚病変が認められなかったのに対し、同種移
しくは CD3 抗体で刺激し、CD4+ T 細胞のサイトカインと転写因子
植後にコントロール抗体を投与した群（Allo ＋ Rat IgG）では明ら
の発現を調べたところ、Anti-p40 抗体投与群では特に T-bet 陽性
IL-17+ 細胞の割合の減少が見られた（Figure 4B, C）。
かな臨床スコアの上昇が認められた。一方、Anti-p40 抗体投与
群（Allo ＋ Anti-p40 Ab）では、40 日目の臨床スコアが有意に
減少していた。同様の傾向は、皮膚、唾液腺、肝臓の組織染色
皮膚局所における Anti-IL-12/23 p40 抗体の影響
とその病理スコアにおいても認められており（data not shown）
、
慢性 GVHD のターゲット組織である皮膚においても、リンパ節と同
Anti-p40 抗体による IL-12/IL-23 のブロックが、慢性 GVHD の臨
じ現象が見られるのかどうかを検討するため、Figure 2 に示すよう
床症状および病理像を減弱することが示唆された。
+
に皮膚より単細胞懸濁液を調製し、PMA/Ionomycin 刺激を入れ
て、CD4+ T 細胞内サイトカインの解析を行った。皮膚においても、
+
Anti-IL-12/23 p40 抗体は、IFN-γ IL-17 ダブルポジティブ細胞を
抑制する
IFN-γ+ IL-17+ 産生細胞が Anti-p40 抗体投与によって有意に減少
移植後 28 日目にリンパ節を採取し、PMA/Ionomycin で刺激し、
CD4+ T 細胞の細胞内サイトカインの発現を調べたところ、慢性
していた（Figure 4D）
。また、皮膚組織における mRNA 発現を
Real-time PCR で調べたところ、Anti-p40 抗体投与で ROR-γt は変
GVHD モデル（Allo ＋ Rat IgG）で増加している IFN-γ 産生細胞、
特に IFN-γ+ IL-17+ 産生細胞の割合が、Anti-p40 抗体投与によっ
化が見られないが、Tbx21 は著明に低くなっていることが示された
（Figure 4E）。
て減少していることが認められた（Allo ＋ Anti-p40 Ab）（Figure
これらの結果は、リンパ節においても、皮膚においても、Th1 細
4A）。
IFN-γ+ IL-17+ 産生細胞は、いくつかの自己免疫疾患モデルで病
胞や “alternative” Th17 細胞が Anti-p40 抗体投与によって抑制さ
れていること、一方、IFN-γ- IL-17+ 細胞はコントロール抗体投与
変部に集積しており、組織炎症と自己免疫において特に病因となり
同種移植マウスと有意な変化がないことを示している。
得ること、IL-17 単独産生細胞に比較して転写因子 T-bet の発現が
高いことが知られている。Figure 4A と同様に PMA/Ionomycin も
リンパ節 CD4+ T 細胞
Allo + Rat IgG
B
Allo + Anti-p40 Ab
*
2
*
0.5
0.5
3
0
0
10
20
30
Days after BMT
40
移植後マウス皮膚の臨床 GVHD スコアを測定
した。各グループの平均値± SE（n=6）。
**p < 0.01
CD4+ IL-17+ IFN-γ+
2.5
1.0
2
0.8
1.5
0.6
0
4
2
0.2
Syn Rat
Ig
Figure ４.
0
Anti-
p40
CD4+ IL-17+ IFN-γ6
*
0.4
1
0.5
G
Figure 3. Anti-p40 抗体投与による慢
性 GVHD 症状の緩和
IgG
0
Anti-
p40
1
Syn Rat
IgG
0
Anti-
p40
Syn Rat
Ig
G
Anti-
p40
0
Syn Rat
Ig
G
E
Anti-
p40
Tbx21
0.004
Syn Rat
IgG
Anti-
p40
ROR-γt
1.5x10-10
Relative expression of
ROR-γt/GAPDH
CD4+ IL-17- IFN-γ+
(%)
0
2
皮膚 CD4+ T 細胞
D
1
p40
Syn Rat
Relative expression of
Tbx21/GAPDH
2
IgG
0
Anti-
3
2
(%)
**
(%)
Skin Score
IFN-γ
Syn Rat
4
4
(%)
(%)
1
CD4+ IL-17+ ROR-γt+
PMA
Anti-CD3
5
6
1
1.5
IL-17A
4
C
CD4+ IL-17+ T-bet+
PMA
Anti-CD3
1.5
2.5
(%)
A
Allo + Anti-p40 Ab
(%)
Syngeneic
Allo + Rat IgG
*
0.003
1.0x10-10
0.002
0.5x10-10
0.001
0
Syn Rat
Ig
G
Anti-
p40
0
Syn Rat
Ig
G
Anti-
p40
リンパ節および皮膚における Anti-p40 抗体投与による Th1 および Th17 細胞への影響
移植後 28 日目に移植後マウスのリンパ節（A, B, C）または皮膚（D, E）のヘルパー T 細胞を解析した。PMA/Ionomycin 刺激による CD4+ T 細胞のサイ
トカイン産生を細胞内染色により解析した（A）。PMA/Ionomycin もしくは Anti-CD3 抗体刺激による、CD4+ IL-17+ T-bet+ T 細胞の割合（B）あるいは
CD4+ IL-17+ ROR-γt+ T 細胞の割合（C）。Figure 2 に示す方法で解析した皮膚 CD4+ T 細胞の各サイトカイン産生細胞の割合（D）。皮膚組織における各
転写因子 mRNA 発現を Real-time RT-PCR にて定量した（E）。*p < 0.05
Conclusion
References
Anti-p40 抗体（ustekinumab）は、慢性炎症性疾患の治療に有
ここで紹介した実験の詳細については、下記の論文を参照された
効との知見が積まれつつある。今回、マウスモデルにおいて慢性
い。
GVHD への抗体投与の有効性が示され、それは Th1 細胞や ”al-
Journal of Immunology, 2015, 194: 1357-1363
ternative” Th17 細胞の抑制を介するものであることが示唆された。
1）Blood, 2012, 119: 285-295
慢性 GVHD の治療のターゲットとして IL-12/IL-23 経路が浮上し、
臨床に利用可能な Anti-p40 抗体が有効な治療薬となる可能性が
示された。
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完全自動化も可能なラインナップが揃いました
再現性の高い組織分散が可能な酵素キット
130-101-540
Whole Skin Dissociation Kit（ヒト）
130-095-929
Tumor Dissociation Kit（ヒト）
130-095-928
Epidermis Dissociation Kit（マウス）
gentleMACS™ Octo
Dissociator with Heaters
採取した組織の短期保存に
130-100-008
gentleMACS™ Octo
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できる Dissociators です。
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T 細胞用培地
130-097-196
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130-098-221
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T 細胞の活性化に
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T cell Activation/Expansion Kit（マウス）
130-107-559
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130-107-565
SF Whole Blood CD15 マイクロビーズ（ヒト）
130-107-568
SF Whole Blood CD19 マイクロビーズ（ヒト）
130-107-761
CytoBox Th1（マウス）
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SF Whole Blood CD33 マイクロビーズ（ヒト）
130-107-758
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130-107-567
SF Whole Blood CD56 マイクロビーズ（ヒト）
130-107-760
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130-090-517
マウス IFN-γ 産生細胞分離キット
Anti-RORγ(t) 抗体（ヒト , マウス）
Anti-T-bet 抗体（ヒト , マウス）
130-094-213
マウス IL-17 産生細胞分離キット
CD3ε 抗体（マウス）
CD4 抗体（マウス）
製品の詳細およびフルラインナップは WEB でご確認ください。
ミルテニー
MACS および autoMACS、MACSQuant は Miltenyi Biotec GmbH の登録商標です。また、gentleMACS は Miltenyi Biotec GmbH の商標です。
特別な明示がない限り、Miltenyi Biotec 社の製品とサービスは研究目的のみに提供され、治療・診断・検査に用いることはできません。
NEX

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