糖鎖分析メソッド集グルコースユニットへの変換法 Ver. 20131129 Written by S. Natsuka 方法の概要 Size-fractionation HPLC の溶出位置を標準化する方法。HPLC の溶出時間を比較することで同定を行う場合、実験間でのばらつきを少なくすればそれだけ正確な解析が可能になる。しかし、溶離液組成のわずかな違いやカラムの劣化など様々な要因により溶出時間は変動する。そこで基準物質を用いた標準化が行われる。Size-fractionation HPLC では分子サイズが異なるイソマルトオリゴ糖混合物を用いて PA 糖鎖の標準化を行う。この方法を使った時に引用すべき論文 Shunji Natsuka, Sumihiro Hase. Analysis of N- and O-glycans by pyridylamination. In Method in Molecular Biology,Vol. 76: Glycoanalysis Protocols (Hounsell,E.F. ed) Humana Press Inc. pp101-113 (1998). ピリジルアミノ化イソマルトオリゴ糖（PA-IMO）の調製標識物の市販品（タカラバイオ）もあるが、自ら調製する際には市販のデキストラン（1,6 グルカン）を部分酸加水分解して得られたオリゴ糖をピリジルアミノ化して作る。あるいは市販のイソマルトオリゴ糖混合物（低重合度のものが主）をゲルろ過などで分け、重合度の高いものが濃縮されるように再混合した後、ピリジルアミノ化して作る。 Size-fractionation HPLC での分離分離条件は「HPLC 条件」を参照。 PA-IMO の size-fractionation HPLC 標準曲線の作成とグルコースユニットの算出 1. PA-IMO を size-fractionation HPLC で展開する。 2. Excel を用いて、溶出時間を横軸、重合度を縦軸にとりプロットする。 3. 五次の多項式近似曲線を作成する。係数は 6 桁必要。 4. PA-糖鎖の溶出時間を近似曲線の数式に代入し相当する重合度（グルコースユニット）を小数点以下 2 桁まで求める。備考：グルコースユニットを求めるための Excel ワークシートが HP からダウンロード可能である。