PDF 946KB - 日本薬物動態学会 JSSX

日本薬物動態学会学会賞受賞講演
「薬物の腸管膜透過に関する機構論的解析」
2005年10月22日
（マウイにて）
東京薬科大学薬学部
薬物動態制御学教室
林正弘
薬物腸管吸収研究に取り組んで30年
薬物吸収機構研究
・Paracellular Routeとの出会い
・吸収促進剤の作用機構研究の始まり
・Paracellular Routeの変化に関する生理学的機構
・忘れてはいけないTranscellular Routeの変化
・トランスポーターと吸収促進剤
・病態時におけるParacellular Routeと
Transcellular Route透過性の変化
Paracellular Routeとの出会い
膜透過ルートとその解析法
・電気生理学の重要性
・Voltage Clamp法
Pm vs. ξ
・Impedance解析
Impedance vs. Frequency
・透過ルートの寄与率を評価可能
・吸収促進剤による透過ルートの変化を定量化
Two
TwoPermeation
PermeationRoutes
Routesand
andElectric
ElectricResistances
Resistancesin
in
Intestinal
IntestinalEpithelium
Epithelium
Transcellular Route
Paracellular Route
MV
Ra
TJ
Rtj
LIS
RL
Rb
MV: Microvilli
TJ: Tight Junction
LIS: Lateral intercellular space
Ra, Rb: Mucosal and serosal resistances
Rtj, RL: Junctional and intercellular resistances
吸収促進剤の生理学的作用機構
吸収促進剤の生理学的作用機構
・Paracellular Routeへの作用機構
Tight Junctionの開口
・吸収促進剤
Caprate (C10)
Decanoylcarnitine (DC)
Tartaric Acid (TA)
・Caco-2細胞とラット腸管膜
C10とDCのTJ開口機構
Decanoylcarnitine (DC)
Sodium caprate (C10)
PIP2 PLC
Uptake Process(OCT2)
Ca
2+
CaM Ca
2+
MLCK activation
Myosinphosphorylation
Depletion of ATP
Cadherin
Ca
2+
pool
Cadherin
Expansion
Ca
pool
Contraction of actin filament
2+
rich domain
Cadherin
IP3 + DAG
Ca
2+
Cadherin
ZO-1
Occuludin
Claudin
Dearrangement of
Cytoskeletal system
酒石酸 (Tartaric acid)のTJ開口機構
Tartaric acid
Actomyosin activation
Opening of TJ
ATP depletion
Intracellular acidosis
Increase of Ca2+
Ca2+-ATPase inhibition
Calpain activation
Phospholipase activation
Protein degradation and
Cytoskeletal destabilization
PKC activation
吸収促進剤の生理学的作用機構
吸収促進剤の生理学的作用機構
・Transcellular Routeの変化
膜Perturbation
・吸収促進剤
Caprate (C10)
・ＢＢＭを蛍光ラベル(膜タンパクと脂質部分)
蛍光偏光度（P value)測定 → 膜Perturbation
Sites Labelled by Fluorescent Probes
EMA, DNS-Cl
FITC
DNS-Cl
NH2
SH
ANS
ANS
2-AS
12-AS
DPH
Protein
Lipid
吸収促進剤と P-Glycoprotein (P-gp)
①Paracellular Routeの変化： Tight Junction (TJ) の開口
②Transcellular Routeの変化：
P-glycoprotein (P-gp) : Drug excretion pump function
の変化
促進剤：
Tartaric Acid (TA)
lumen
①
●
②
●
blood
stream
Rat Colon
1.4
1.4
0.2
0
pH7.4
TA
D-
co
n
(H trol
5 m Cl
M )
co
5 m ntro
l
M
DTA
0
pH4.5
0.8
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0
0
pH7.4
pH4.5
A
0.02
0.6
co
nt
(
H
5 m C rol
M l)
DT
0.4
1
A
0.04
1.2
0.8
co
nt
(
5 m HC rol
M l)
DT
0.6
1.4
nt
ro
l
M
DTA
0.06
1
5m
0.8
1.6
co
0.08
1.8
pH3.5
pH dependent effects of tartaric acid on permeation clearance (CL)
of Rhodamine123 in the serosal (S) to mucosal (M) direction and Rm
● Rm ( ratio of control )
1
● Rm ( ratio of control )
1.2
0.1
2
1.2
CL (µL/min/cm2)
0.12
CL (µL/min/cm2)
Rabbit Colon
Tartaric Acid (TA) の作用機構
・高濃度(20mM)のTAはTight Junction開口
作用を持つが、低濃度(5mM)のTAはP-gp機能
の抑制を示した。このP-gpへの作用は、pH依存
性を有しており、細胞内アシドーシスが関係して
いる可能性が示された
・上記のP-gpへの作用は、他の促進剤ピロチオ
デカンにも見出された。
虚血再灌流障害モデル
Apical (A)
Basal (B)
A
B
membrane
・細胞系 : Caco-2 cell monolayers
・評価系 : in vitro 拡散チャンバー
・脂質過酸化剤 : tertiary-butyl hydroperoxide (t-BuOOH)
・in vitro 障害モデル :
in vivo
in vitro
虚血
低酸素
t-BuOOH (1hr)
再灌流
酸素再供給
(1hr)
・ Paracellular route の評価 : Tight Junctionにおける膜抵抗 (TEER)
・ Transcellular route の評価 : P-gp 基質である Rhodamine123 の膜透過性
100
1.8
control
90
80
70
60
t -BuOOH
50
0.5 mM
1.0 mM
2.0 mM
40
30
20
10
5.0 mM
0
0
15
30
45
Time ( min )
60
Permeability (x 10-5 cm/sec)
TEER (% of initial value)
110
1.6
1.4
**
*
A→B
***
B→A
****
*
1.2
1.0
0.8
0.6
****
0.4
0.2
0.0
***
control 0.5
***
1.0
2.0
5.0
t –BuOOH (mM)
Effects of t -BuOOH on TEER (% of initial value) and permeability of
Rhodamine 123 in Caco-2 cell monolayers.
Results represent means and S.E.
*p<0.1, **p< 0.05, ***p<0.01, ****p<0.001 compared with control
conditions.
(A) Tiron (O2 - scavenger)
(B) DFO (iron ion chelater)
●
TEER (% of initial value)
110
110
control
100
(no additive)
100
90
control
(no additive)
+ 1.0 mM
90
80
70
+ 30 mM
+ 10 mM
60
+ 5.0 mM
60
80
50
+ 0.5 mM
70
+ 0.1 mM
50
40
30
20
+ 2.5 mM
40
t -BuOOH
30
alone
10
0
0
15
30
45
Time ( min )
60
alone
20
10
0
t -BuOOH
0
15
30
45
60
Time ( min )
Effects of Tiron (A) and DFO (B) on TEER reduction caused by
0.5 mM t -BuOOH in Caco-2 cell monolayers.
Results represent means and S.E.
CTRL
I/R50g
I/R100g
1.5
1
0.5
ileum (µL/min/cm)
4
3.5
CLe
Cumultive exsorbed amount
(ng/cm)
2
1
0
3
2.5
2
1.5
*
0.5
***
0
0
10 20 30 40 50 60 70
Time (min)
CTRL
I/R 50g I/R 100g
Effects of in situ ischemia-reperfusion treatment on
exsorption of Rhodamine 123 in rat ileum
Data represents mean ± S.E. (n=6~10 for each condition).
(*p<0.05, ***<0.001 compared with control)
虚血再灌流障害のまとめ
In vitro障害モデル
・脂質過酸化により、Tight Junctionが開口する
・上記機構には、スーパーオキシドや鉄イオンが
関与している
・脂質過酸化の程度が増大すると、Tight Junction
開口に加えて、P-Glycoprotein機能も低下する
In situ障害モデル
・P-Glycoproteinの機能低下は、in situモデルによ
り、確認された
感染症モデル
正常ラット結腸では
（背景）水溶性高分子Lipopolysaccharide (LPS)は、
Paracellular routeでわずかに透過可能 → 敗血症時には
腸管由来のLPSが血中に出現 → Paracellular route以外にも
Transcellular routeを介した能動的な透過機構の存在の可能性
実際に得られた結果
・粘膜側および奨膜側からLPSの構造認識を介した
FITC-LPSの取り込み過程が存在し、さらにCD14
およびTLR4やScavenger receptorも関与している
・細胞内へ取り込まれたFITC-LPSはP-gpおよび
mrpによって粘膜側へ排泄される
2
M to S
S to M
100
80
1.5
60
1
40
0.5
0
**
Normal
Disease
Normal
*
Disease
20
Rm (% of initial value)
Permeation coefficient (x10-4cm/s)
FITC-LPS Permeability through Rat Colonic
Epithelial Cells in Normal and Disease Conditions
Colonic Epithelial Cells
(M)
(S)
LPS Infection
0
Normal: Saline i.p.
Disease: Unlabeled-LPS (O111: B4) 10mg/kg i.p
４時間後に結腸部を摘出 → 透過実験
FITC-LPS: 0.5µg/mL
n: 7-15 *P<0.01,
**P<0.005 vs. Normal
Permeation coefficient (% of Normal)
The Effect of Verapamil on the FITC-LPS Permeability
through Rat Colonic Epithelial Cells in Disease Conditions
M to S
400
300
200
S to M
(M)
(S)
*
*
100
0
Colonic Epithelial Cells
LPS Infection
P-gp
e
l
l
l
il
i
se
s
a
a
a
a
m
m
m
m
e
e
a
a
r
r
s
s
i
i
p
p
o
o
a
a
D
D
N
N
er
er
V
V
+
+
FITC-LPS: 0.5mg/mL
Verapmail: 1mM
n: 3-15, *P<0.005
感染症におけるLPSの腸管膜透過のまとめ
Disease Conditions
Normal Conditions
Mucosal
LPS
CD14
TLR4
P-gp
mrp
Serosal
Mucosal
Serosal
LPS
SR
LPS Infection
●感染症時において、LPSの透過性は変動し、その機構には、
Receptorによる取り込み機構の低下（粘膜側）、消失（漿膜側）
および排泄型Transporterの発現レベルもしくは機能の亢進が
関与する
●腸管からのLPSの解毒・排泄を介した感染症の新たな治療
および予防法の確立へと繋がる重要な基礎情報となり得る
吸収促進剤投与時および
病態時の吸収制御因子の変動
•酒石酸：
P-gp機能低下 → 濃度↑で TJの開口
・虚血再灌流障害： TJの開口→ 障害↑で P-gp機能低下
•感染症：
ReceptorおよびTransporterの発現
レベルの変動 → LPSの透過性変動
•潰瘍性大腸炎： TJの開口→ 炎症↑でP-gp機能低下
薬物吸収を制御する腸管膜の変化機構
Physiological Change
Pathological Change
Tight Junctionの開口
P-gpの機能、発現の低下 or 亢進
謝辞
・花野学
・粟津荘司
（東京薬科大学名誉教授）（東京大学名誉教授）
**********************
********************
・東京薬科大学薬学部
堀江利治（千葉大学教授）
水間俊（助教授）
富田幹雄（講師）
柳樂眞友子（助手）
・東京理科大学薬学部
芳賀信（助教授）
奥平和穂（東邦大学講師）
海保房夫（講師）
電気生理学
・山下伸二
（摂南大学教授）
・高村喜代子
（東京薬科大学名誉教授）
・楠文代
（東京薬科大学教授）
*********************************************
・東京薬科大学大学院生・東京理科大学大学院生

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