AKAROLOJİDE MOLEKÜLER BİYOLOJİ ve PROTEOMİK UYGULAMALARI Yrd. Doç. Dr. Nabi Alper KUMRAL Uludağ Üniversitesi, Ziraat Fakultesi, Bitki Koruma Bölümü, Görükle, Bursa, [email protected] 1 1. 2. 3. 4. 5. NÜKLOTİDİN TANIMI NÜKLEOTİDİN YAPISI DNA’NIN KEŞFİ DNA’NIN FİZİKSEL VE KİMYASAL YAPISI KOMOZOM, KROMATİN, HİSTONLAR VE NÜKLEOZOMLAR 6. AMİNOASİTLER 7. KULLANILAN MARKIRLAR 8. ÖZGÜN DNA PARÇALARININ İZOLASYONUNDA KULLANILAN METOTLAR 9. DNA DİZİ ANALİZİ 10.PROTEİN ANALİZİ VE 1,2 VE 3 BOYUTLU JEL ELEKTROFOREZ 11. AKARLARDA MOLEKÜLER BİYOLOJİNİN KULLANIM ALANLARI 12.AKARLARDA MOLEKÜLER BİYOLOJİ ALANINDA BUGÜNE 2 KADAR YAPILAN ÇALIŞMALARIN ÖZETİ Moleküler Biyolojinin Temel Kavramları 3 Biyomolekül nedir? Biyomolekül, canlılarda yer alan moleküllere verilen isimdir. Bu moleküllerin arasında iri yapılı protein, polisakkarit ve nükleik asitler gibi canlı yaşamı için birinci dereceden önemli olan moleküller yer almaktadır. Biyomoleküller, genel olarak karbon, hidrojen, azot ve oksijen içeren organik bileşiklerden örülü yapılardır. Atomlar birbirlerine kimyasal bağlarla bağlanarak molekülleri ve moleküler yapı bloklarını oluşturur, onlarda hücreleri oluşturur. 4 Biyomoleküller nelerdir? 1. Nükleotidler 2. Aminoasitler 3. Karbonhidratlar 4. Yağ asitleri 5 Nükleotid nedir? Nükleotidlerin yapısında merkezi durumda bir beş karbonlu şeker (deoksiriboz), şekerin 1 no.lu karbonuna bir azotlu baz ve 5 no.lu karbonuna bir fosfat grubu bağlı bulunur ve bu kimyasal yapıya denir. Eğer fosfat grubu çıkarılırsa geriye kalan yapıya nükleosit (azotlu organik baz+ 5 karbonlu şeker) denir. Genellikle 50 veya daha az sayıda nükleotid içeren polimerler oligonükleotit, daha çok sayıda nükleotit içeren nükleik asitler polinükleotit olarak adlandırılır. 6 Nükleotidin hücredeki görevi nedir? 1. Nükleotid polimerlerini oluştururlar. 2. Hücrede biyolojik bilgi nükleotid dili şeklinde nükleotid polimerlerinde depo edilir ve gerektiğinde tümünün veya bir kısmının kopyası çıkarılır. 3. Kimyasal enerjiyi kısa süreli taşırlar. Aktif taşımada ve çeşitli sinyal iletim yollarında iş görürler. 4. Koenzimlerin yapısına katılırlar. 7 Nükleotidin Yapısı Nükleotidler taşıdıkları bazın adıyla ve asit karakterde oldukları için asit tanımlamasıyla anılırlar. Nükleotidlerin yapısında bulunan bazlar adenin, guanin, sitozin,urasil ve timin’ dir. Bunlar pirimidinler ve pürinler olarak ikiye ayrılır. Nükleotidin yapısında bulunan 5 karbonlu şeker (pentoz) riboz ve deoksiriboz olarak iki farklı şekildedir. Fosfatlar ise AMP, ADP, ATP ‘ dir. 8 DNA polimeri ve RNA arasındaki Farklar  Nükleotidler, kovalent 3’-5’ fosfodiester bağlarıyla bağlanarak DNA ile RNA ‘nın uzun, düz ve dallanmış zincirlerini oluştururlar. Başlangıç ve son uçtaki nükleotitlerin şekerlerine bağlanan fosfat grubunun bağlandığı karbon atomunun numarası zincirlerin yönünü belirler. RNA tek, DNA çift nükleotid zincirinden yapılıdır. DNA polimeri kalıtım materyali olarak daha uygundur. Yani riboz şekerin 2 numaralı karbonunda bulunan hidroksil grubu, RNA ‘nın kolay parçalanabilir olmasına neden olur. DNA’ da ise bu pozisyonda hidrojen bulunur ve parçalanması zor olur. 9 DNA ‘nın keşfi DNA’ nın biyokimyasal olarak araştırılması ilk kez Fried Miescher tarafından hücre çekirdeği üzerinde sistematik çalışmalar ile gerçekleştirilmiştir. Miescher 1868 yılında sargı bezleri üzerindeki lökositlerin çekirdeğinden nüklein adı verilen fosfor içeren maddeyi elde etmiştir. Bu araştırmacı nükleinin günümüzde DNA olarak bildiğimiz asidik olan ve bazik protein yapısında olan kısımlardan meydana geldiğini bulmuştur. Araştırıcı benzer maddeyi somon balığı sperm hücrelerinde de bulmuştur. DNA’ nın birincil yapısının anlaşılması 1940 ‘ların sonlarında olmuştur. DNA ‘nın genetik bilgiyi taşıdığına dair ilk kanıtlar 1944 yılında Osward T. Avery, Colin Macleod ve Maclyn McCarty tarafından bulunmuştur. 10 DNA’nın Fiziksel ve Kimyasal Yapısı Baz sekanslanması ve Çift Sarmal 1953 yılında Watson ve Crick elde edilen tüm bilgileri değerlendirerek DNA yapısının üç boyutlu şeklini önermişlerdir. İki sarmal DNA ipliğinin sağ-el durumundaki çift sarmalını oluşturmak için aynı eksen etrafında sarılmaktadır. Sağ el durumundaki çift sarmal DNA’ da, sarmalın ekseni sağ el başparmağı ile işaret edilirken sarmalların dönüş yönü sağ el parmakları yönünde olmalıdır.DNA sarmalının tam bir döngüsü her 3.4 nm’de olup, çapı yaklaşık 2nm’dir. Birbirine komşu bazlar arasındaki mesafe 3.4 nm olduğundan her dönüşte toplam 10 nükleotit bulunmaktadır. Bu özellikler DNA’ nın B-formu modelini oluşturmuştur. 11 DNA’nın farklı sarmal formları  B-DNA, Z-DNA, A-DNA Sarmal tipi Dönüş baz çifti (her bir dönüşte) Baz çifti başına dönüş Sarmal çapı (her baz çifti arasındaki uzaklık) A 11 + 34.7 23A B 10 +34.0 19A Z 12 -30.0 18A  B-DNA formu fizyolojik koşullar altında en kararlı formudur. A formu sudan yoksun çözeltilerde, sağ el durumundaki çift sarmal yapısıdır. Z formunda GC ve AC ikili 12 nükleotid bakımından zengindir. DNA Replikasyonunun Özelliği Genetik materyalin doğru olarak kopyalanması oldukça önemlidir. Replikasyon iki DNA ipliğinin birbirinden ayrılması ve her bir tamamlayıcı ipliğin baz eşleşme kuralları tarafından belirlenen dizilim içinde nükleotitlerin birbirine eklenmesi yoluyla sentezlenmesi aşamalarını içermektedir. Semikonservatif tipte eşleşme gerçekleşir. 13 Genetik Kod Genetik kod, mRNA boyunca üçlü gruplar halinde bulunan ve protein sentezleme sırasında üretilen aminoasit dizilerinin düzenini belirleyen nükleotid dizileridir. Genetik kod mRNA üzerinde her biri bir amino asidi temsil eden üçlü nükleotid grupları içinde okunur. Her bir üçlü nükleotide kodon denir. 14 Denatürasyon Çift sarmalı kararlı hale getiren kovalent olmayan güçler ve hidrojen bağları, ısı yada denatürant adı verilen bir takım kimyasallarla muamele edilerek bozulabilir. Çift sarmalın iki ipliği, iplikler arasındaki tüm hidrojen bağları kırıldığında tamamen ayrılır. Sarmalların birbirinden ayrılmasına denatürasyon ya da erime denir. DNA ipliklerinin denatürasyonu pH 11.3 üzerinde gerçekleşir. Renatürasyon: İki tamamlayıcı ipliğin tekrar çift sarmal haline dönüşmesine renatürasyon denir. Renatürasyon tamamlayıcı iplikler arasındaki kendine özgü baz eşleşmesine bağlıdır. Reaksiyon iki aşamada gerçekleşir. İlk aşamada, çözelti içindeki tek iplikli DNA’ lar tesadüfi olarak birbirleri ile karşılaşır. Eğer bunların dizilimi tamamlayıcı ise , iki iplik kısa bir çift sarmal bölgesi oluşturmak için eşleşir. Daha sonra baz eşleşme bölgesi, molekül boyunca fermuar benzeri bir etki ile daha uzun çift sarmal molekülü meydana getirir. 15 Komozom, Kromatin, Histonlar ve Nükleozomlar . 16 17 Aminoasitler Aminoasitler bir amino grubu, bir karboksil grubu ve bir yan zincirden oluşmaktadırlar. Amino asitler birbirlerine peptid bağlarıyla bağlanırlar. 20 aminoasidin birleşmesiyle oligopeptid, 80 ve daha fazla aminoasidin birleşmesiyle polipeptid oluşur. Aminoasitler Polipeptid zincirlerin katlanmasıyla oluşan protein yapıları: birincil,ikincil, üçüncül ve dördüncül yapıdır. Aminoasitler Aminoasitlerin temel görevi proteinleri oluşturmaktır. İkinci görevi ise amino asit dilini oluşturmaktır. Amino asit yan zincir irilikleri, yükleri, şekilleri, hidrofilik veya hidrofobik oluşları ve reaksiyona girme dereceleri bakımından farklıdır. Yan zincirin sudaki çözünürlüğüne göre amino asitler 3 gruba ayrılırlar. 1. Hidrobik aminoasitler: suda ya hiç çözünmezler yada az çözünürler.Alanin, valin, lösin gibi. 2. Hidrofilik aminoasitler: bunlar su severler. Arjinin, lizin gibi. 3. Özel aminoasitler: sistein, prolin gibi Proteinler aminoasitlerin zincir halinde birbirlerine bağlanmasından oluşan büyük moleküllü bileşiklerdir. Amino asit: Proteinin temel yapısı R NH3+ C COO- Amino grubu H Zincirin farklı taraflarında bulunan R, 20 farklı aminoasitin özelliklerini belirler. Karboksilik asit grubu Her proteinin kendisine has özelliklerinin olmasını sağlayan özel amino asit dizilimleri vardır. Bu zincirde bir amino asitin karboksil grubunun bir diğerinin amino grubuna bağlanmasıyla oluşan bağ peptit bağı olarak adlandırılır. Bir karboksilik asit; bir su molekülünün serbest bırakılması ile bir amino grubu olarak yoğunlaşır. R1 NH3 C R2 COO- ＋ NH3＋ H H 2O R1 C H A F ＋ H H 2O NH3 COO- C R2 CO NH Peptid bağı G N S C CO C NH Peptid bağı H T R3 D K G H S A CO Aminoasit dizilimi birincil yapı olarak adlandırılır. Aminoasit dizilimi, bir gende, DNA bazlı dizilim olarak kodlanır. DNA molekülü ＝・ G C G C T T A A G C G C ・・ DNA bazlı C dizilim G C G A A T T C G C G ・ Gen proteinin kopyası, genom ise hayatın kopyasıdır Genome Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Proteomics ve Protein Tanımlanması Proteinlerin yüksek işlem hacimli yaklaşımlar kullanılarak; geniş ölçekli görüntülenmesi, ifade edilmesi, değişimi ve ilişkilerinin belirlenmesidir. Neden? Belirlenmiş olan genler gen sayısı < protein sayısı Belirlenmiş olan proteinler Amacı  Tüm proteinlerin listelenmesi  Fonksiyonlarının belirlenmesi  Birbirleriyle olan etkileşimlerinin anlaşılması Proteomics Teknolojisi  Jel Elektroforez  Mass-spectrometre  Protein çipleri  Maya 2 hibrit metot Akarlarda Kullanılan Genomlar       1- Mitokondriyal DNA Hayvan mtDNA’sının evülasyon modelleri ve moleküler biyolojisi günümüzde çok iyi anlaşılmıştır. Özellikle iki tane kene türünün tüm mitokondriyal genomu dizilenmiştir. Ayrıca ikinoktalı kırmızıörümceğin mtDNA’sının restriksiyon haritası karakterize edilmiştir. Böceklerde olduğu gibi akarların mitokondriyal sekansları A+T varlığı açısından çok zengin bulunmuştur. Temel kompozisyondaki değişkenlikler aynı familyanın içinde türler arasında görülebilir. Buda filojenik yapıların ortaya konmasında oldukça önemlidir. Mitokondriyal genomun birçok geni hayvan taksonları arasındaki filogenetik ilişkilerin değerlendirilmesinde artan bir şekilde kullanılmaktadır. Akarlar üzerinde yapılan evülasyon çalışmaların birçoğu mt sitokrom oksidaz subünite I gen (COI) olmasına rağmen keneler üzerinde genellikle ribosomal 16S’ dir. 32 2- Nükleer Ribozomal DNA:  Ökaryotlarda ana ribosomal lokuslar 3 genden kodlanmaktadır (18S, 5.8S ve      28S ribozom subüniteleri ) bu genler arasında internal transkrip spacırlar I (ITS1 18s ve 5.8s genleri ve ITS2 5.8s ile 28s genleri arasında bulunur). Bir kromozomun üzerinde ribozomal genlerin yüzlerce kopyası bulunur. Hatta bunlar birden fazla kromozomda da bulunabilirler. Yinelenme kabiliyetleri temelde bir ön çoğalma adımıdır. Korunmuş ribozomal genlerde PCR primerleri tanımlanabilmektedir. Çoğaltılmış fragmentlerin sekansları uzak taksalarda filogenetik olarak karşılaştırma için oldukça yararlıdır. Bu nedenle birbirleri ile yakın ilişkili taksaların ayrılması için ITS bölgeleri oldukça kullanışlıdır. ITS bölgelerinin karakterizasyonu için genellikle daha çok korunmuş genlerdeki (18S, 5.8S ve 28S ) PCR primerleri dizayn edilir. ITS bölgeleri başarılı şekilde çoğaltıldıktan sonra diğer tekniklerle analiz edilir. ITS bölgelerin kopyaları sonucu oluşan ribozomal genler bireyler arasında ve içinde oldukça değişken potansiyele sahiptir. ITS sekanslarında tür içi çeşitlilik birçok kene türünde de ortaya konmuştur. Fitofag akarlarda da çok düşük düzeyde tür içi polimorfizim bu markırlar sayesinde oldukça etkili bir şekilde ortaya konabilmektedir. 33 Diğer nükleer genler  Ekto-5 nükleaz  Oktopamin benzeri G-protein reseptörü  Elongation (uzama) faktör 1 alfa 34 ÖZGÜN DNA PARÇALARININ İZOLASYONU PCR (Polimeraz zincir reaksiyonu) Polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction - PCR), DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir. Metod basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun koşullarda çoğaltılması esasına dayanır. Bir çeşit "in vitro klonlama" olarak da tanımlanan PCR; 94 °C-98 °C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon, 37 °C-65 °C aralığında gerçekleştirilen tavlama (annealing) ve 72 °C’de gerçekleştirilen uzama aşamalarından oluşur ve bu döngülerin belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır. PCR yönteminin gelişmesinde en büyük katkıyı Taq Polimeraz enziminin bulunması yapmıştır çünkü bu enzim yüksek sıcaklıklarda dahi dayanabilen tek enzimdir. Bu enzim ilk olarak Yellowstone milli parkında bir kaplıcada yaşayan termofilik bir bakteriden izole edilmiştir.Dr. Kary B. Mullis 1980’li yıllarda yaptığı PCR çalışmaları ile 1993 yılında Kimya alanında Nobel ödülü almıştır. 35 RAPD (Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA)  RAPD tekniğinde DNA dizilerinin rastgele çoğaltımı için PCR teknikleri kullanır.  RAPD yönteminin temel prensibi ilgili olan türe ait genomik DNA üzerinde rastgele seçilmiş, tek bir 8-10 bp oligonükleotidin, düşük bağlanma sıcaklığında tesadüfi olarak bağlanarak PCR ile çoğaltma yapmasıdır.  Tekniğin devamında elde edilen çoğaltma ürünü radyoaktif olmayan standart jel elektroforezinde yürütülür ve çoğaltma ürünleri bantlar halinde gözlemlenerek incelenir.  Bantların varlığı veya yokluğuyla sonuçlar değerlendirilmektedir. 36 DALP (Doğrudan çoğaltılan uzunluk polimorfizmi  DALP yöntemi çoklu bant genom DNA kalıpları üretmek için rastgele PCR primerleri kullanımını içerir ve polimorfik bantların dizilimlerini sağlar.  Daha sonra PCR-spesifik bantlar tanımlanabilir ve ayrı bölgeler üzerinde çalışılabilir. 37 AFLP (Çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizimi)  Bu teknik RFLP'den daha hızlı çalışır ve DNA örneklerini çoğaltmak için PCR kullanır. Değişken sayılı bitişik tekrar (VNTR) polimorfizmlerine dayalı aleller ayırdedilir, bunlar poliakrilamit jel elektroforezi ile ayrıştırılır.  Bantlar gümüş boyaması ile görülür. Analiz jelde yapıldığı için, çok yüksek sayılı tekrarlar jelin tepesinde sıkışabilirler ve birbirlerinden ayırdedilmeleri zor olabilir.  AFLP analizi yüksek oranda otomatikleştirilebilir. Bu yöntemle kişisel DNA örnekleri karşılaştırılarak filogenetik ağaçlar yaratılabilir. Düşük maliyeti, hazırlanma ve çalıştırma kolaylığı gibi nedenlerden dolayı AFLP hâlâ az gelirli ülkelerde yaygın olarak kullanılır . 38 RFLP (Restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi ) Restriksiyon endonükleaz enzimlerinin kullanıldığı bu yöntemde, Restriksiyon endonükleazlar, restriksiyon bölgeleri olarak bilinen çift zincirli DNA'nın sadece spesifik baz dizilerini tanımakta ve diziyi bu bölgelerden kesmektedir. RFLP’nın aşamaları:  Biyolojik materyalden genomik DNA izole edilir, ve bunlar bir RE ile kesilirler,  Kesilmiş DNA’lar elektroforeze tabi tutulurlar,  Polimorfik bölge olup olmadığına bakılır. 39 Mikrosatellitler • Genom içinde dağılmış 2-6 baz çifti ile tekrar eden kısa DNA baz segmentleridir (yaklaşık 100bp). • Daha çok kodlanmayan DNA bölgelerinde bulunmaktadır. Mikrosatellit lokuslar organizmalarda artan sayıda mevcuttur ve allel sıklığı verileri analiz etmek için istatistiksel yöntemler ve bilgisayar programlarının gelişmesine sebebiyet vermiştir. • Mikrosatellitlerin popülasyon genetiği çalışmaları için gerçekten mükemmeldir. Mikrosatellik lokus izolasyonu DNA'nın genomik yapısını kapsamaktadır ve mikrosatellittipi tekrarlayan dizisi problar ile taranmaktadır. 40 Allozimler: Protein elektroforezi genetik polimorfizm saptanması için etkin bir yöntem olmuştur. Akarlarda enzimatik sistemlerinden esteraz üzerinde çalışılmıştır. 41 Proteinlerin doğrudan analizi: Ayrılmış proteinler için yüksek hassasiyetli tekniklerden bazıları 2 boyutlu elektroforez’ dir, henüz akar ve kenelerde kullanılmamaktadır. 42 Filogenetik akrabalıklar (familyalar, cinsler) Filogenetik akrabalıklar (türler, populasyonlar) Teknik Avantajlar Sorunlar Örnekler rDNA sekanslanması (genler) •Derin filogenezlerin çözümü için uygundur. •Birden fazla kopya genler olduğu için PCR için çok hedef vardır. •Son zamanlardaki farklılaşmalar için daha az bilgi vermektedir. Black et al., 1997 Klompen et al., 2000 Dobson and Barker, 1999 mtDNA sekanslanması •Korunmuş bölgeler PCR için primer tasarımı kolaylaştırır. •Her hücrede birden fazla kopya olduğu için PCR için çok hedef vardır. •Evrimin yüksek oranda olması nedeniyle mutasyonlar tamamlanmamıştır. Navajas et al., 1999 Black and Piesman, 1994 Crosbie et al., 1998 rDNA sekanslanması ( ITS) •Korunmuş genler arasında bulanan küçük bölgeler PCR primerleri için oldukça kullanışlıdır. •Son derece değişkendirler. •Sekans dizilemeleri zor olabilir. •Anlamsız sekanslar üreten birey içi varyasyonların varlığı tamamlanmamış homogenizasyonu gösterir. Zahler et al., 1995 Fenton et al., 2000 mtDNA sekanslanması •Anneye ait değişmez kalıtımlardır. •Rekombinasyon yoktur. •Popülasyon yapısı coğrafi düzeyde tanımlanabilir. •Sadece anne soyları izlenebilir. •İdeal olarak hem mtDNA hem de rDNA kullanılır. Anderson and Trueman, 2000 Navajas et al., 1998 43 Populasyon çalışmaları (popülasyonlar ve bireyler) Teknik Avantajlar Sorunlar Örnekler PCR-RFLPs •Diğer tekniklere nazaran pahalı değildir ve basittir. •Türlerin teşhisinde kullanılabilir. •Düşük varyasyon vardır. Gotoh et al., 1998 Fenton et al., 1995 Microsatellite’ler •Yüksek miktarda polimorfik •Lokuslar kolayca kaydedilir •Gen haritalaması için kullanılabilir. •İzole etmek zordur ve pahalıdır. •Çoğunlukla türe özgü lokuslardır. Delaye et al., 2000 DALPs •Ko-dominant markırlardır. •Sadece polimorfik lokuslar izole edilebilir. •Markırların sayısı sınırsızdır. •Ön genetik bilgiye ihtiyaç yoktur. Türe özgü lokuslardır. Perrot-Minnot et al., 2000a Perrot-Minnot et al., 2000b AFLPs •Ön genetik bilgiye ihtiyaç yoktur. •Markırların sayısı sınırsızdır. •Gen haritalaması için kullanılabilir. •Heterozigotlar homozigotlardan ayırt edilemez. Weeks et al., 2000 44 Popülasyon çalışmaları (popülasyon ve bireyler ) Teknik Avantajlar Sorunlar Örnekler RAPDs •Diğer tekniklere nazaran pahalı değildir ve basittir. •Ön genetik bilgi gerekli değildir. •Markırların sayısı sınırsızdır. •Heterozigotlar homozigotlardan ayırt edilemez. •Tekrarlanabilirlik için büyük dikkat gerekir. Hemandez et al., 1998 de Guzman et al., 1997, 1999 Edwards et al., 1998 Allozimler •Pahalı değildir ve basittir. •Protokoller birçok enzim tespit edebilmek için kullanılabilir. •Düşük varyasyon vardır. •Büyük miktarda materyal gerektirir. •Küçük hayvanlarda düşük miktarda lokus saptanır. Dunley and Croft, 1994 Kain et al., 1997 45 POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR)  PCR yaygın olarak tıbbi ve biyolojik araştırma laboratuvarlarında kalıtsal hastalıkların teşhisi, genetik parmak izlerinin tanımlanması, bulaşıcı hastalıkların teşhisi, genlerin klonlanması, babalık testi ve DNA hesaplaması gibi değişik konularda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır.  PCR yöntemine dayalı olarak birçok primer olarak adlandırılan başlatıcı DNA teknikleri geliştirilmiştir. Bu başlatıcı DNA'lar belli dizilere sahip ve sentetik olarak üretilebilen moleküllerdir. PCR'a dayalı RAPD, AFLP, SSR ve ISSR gibi genetik markır teknikleri geliştirilmiştir. Bu teknikler birçok bitki ve hayvanda genetik akrabalığın teşhisinde tür içi ve türler arasında kullanılmaktadır. 46 Akarlarda DNA ekstraksiyonu Tek bir bireyden toplam DNA’nın ekstraksiyonu DNeasy Tissue DNA ekstrasyon Kiti (Qiagen) kullanılarak “Hayvan kanı ve hücrelerinden toplam DNA’nın saflaştırılması” (Spin-Column Protocol) protokolüne göre yapılmaktadır (Kanouh et al., 2010; Tixier et al., 2010). 1. Tek bir akar içeren tüp öncelikle kurutulur. 2. Sonra tüpe 90 mikrolitre liziz tamponu (Tuzlu Fosfat Tamponu), 10 mikrolitre Proteinaz K and 100 mikrolitre tampon AL (Qiagen) eklenir. 3. Sonra tüpler 13,000 rpm’de 5dk santrifüj edilir.Sonra 100 mikrolitre (%100) alkol eklenir ve 56 °C’ de 16 saat inkübe edilir. 4. 1 dk boyunca 8000 rpm’de tekrar santrifüj edilir. Daha sonra üstteki sıvı içerik atılır ve alt kısım tutulur. 5. Kolon üzerinde bulunan DNA 250 mikrolitre tampon AW1 (Qiagen) ile 1dk 8,000 rpm’de santrifüj edilerek yıkanır. 6. Tekrar üst kısımda birikenler atılır ve ikinci kez yıkama yapılır. 250 mikrolitre tampon AW2 (Qiagen) eklenir ve 13,000 rpm’de 3dk santrifüjlenir. 7. Son olarak DNA’yı iyice temizlemek için 50mikrolitre ultra saf su eklenir ve 8,000 rpm’de 1dk sanrifüj edilir. Aynı işlem ikinci kez tekrarlanır. 8. Ve DNA tüm maddelerden ayrılmış olarak saf şekilde elde edilmiştir. 47 Akarlarda DNA’nın PCR ile çoğaltılması 1. 2. 3. 4. 5. PCR reaksiyonu 4 µL akar DNA’sı, 2.5 µL (1 mM) 10X buffer, 1 µL (1.5 mM) MgCl2, 0.5 µL (0.05 mM herbir primer için) DNTPs, 0.175 µL (0.7 µM), 0.125 µL (0.625 U) Taq Qiagen ve 16.525 µL su içeren 25-µL’lik çözelti içinde yapılmaktadır. Bu karışımdan tüplere konulur. PCR makinesine tüpler yerleştirilir ve programa göre PCR reaksiyonları başlatılır. Sıcaklık döngüsü ITS markırları için: 92 °C’de 2 dk., 92 °C’de 15’er saniyelik 35 döngü, 50 °C’de 45 saniye ve 72 °C’de 1 dk. ve ardından 72 °C’de 7 dk. daha olacaktır. Yatay elektroforezde PCR ürünleri %1.5’luk agaroz jel’de 0.5 × TBE buffer’da 20 dk. 135 V.’da koşturulmaktadır. 48 PCR ve dizileme analizlerinde kullanılan bazı primerler Markır ITS Tür T. urticae Uzunluk (bp) 1200 N. californicus COI T. urticae 890 Referans Ben Ali ve ark (2000) Primerler Kullanım yeri 5’PCR ve dizileme AGAGGAAGTAAA AGTCGTAACAAG3’ Navajas ve ark. (1999) 5′AGAGGAAGTAAA AGTCGTAACAAG3′ 5’PCR ve dizileme GGAGGATTTGGA AATTGATTAGTTC C-3’ Simon ve ark. (1994) 49 Sıcaklık döngüsü ITS markırları için: 92 °C’de 2 dk., 92 °C’de 15’er saniyelik 35 döngü, 50 °C’de 45 saniye ve 72 °C’de 1 dk. ve ardından 72 °C’de 7 dk. daha olacaktır. 50 Yatay elektroforezde PCR ürünleri %1.5’luk agaroz jel’de 0.5 × TBE buffer’da 20 dk. 135 V.’da koşturulmaktadır. 51 NÜKLEİK ASİT ANALİZ TEKNİKLERİ NÜKLEİK ASİTLERİN MOLEKÜLER ANALİZİ NÜKLEİK ASİTLERİN ELEKTROFOREZİ Elektroforez farklı büyüklükte, yükte ya da konformasyonda olan makromolekülleri, özellikle protein ve nükleik asitleri, ayırmak, saflaştırmak ve molekük ağırlıklarını saptamak amacıyla biyokimya ve moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Yüklü moleküller bir elektrik alanına maruz bırakıldığında, yüklerine göre pozitif veya negatif kutba göçer ederler. Elekroforez DNA moleküllerini sadece molekül ağırlığına göre değil, aynı zamanda yapısal ve topolojik özelliklerine göre de ayırır. Elektroforez RNA moleküllerinin ayırmada da kullanılır. Günümüzde en yaygın olarak kullanılan agaroz ve poliakrilamit jel elektroforezidir. 52 a) Agaroz Jel Elektroforezi Agaroz ortalama molekül ağırlığı 12000 olan doğrusal bir polisakkarittir ve kırmızı bir alg türü olan Agar agar’ dan izole edilir. Agaroz orta büyüklükte ve büyük DNA moleküllerini ayırmak için en yaygın destek ortamıdır. Agarozun konsantrasyonu ayarlanırken moleküllerin büyüklükleri dikkate alınarak jelde porların büyüklüğü ayarlanır. Jelin konsantrasyonu arttıkça porların çapı küçülür. Küçük DNA parçaları için yüksek, büyük DNA parçaları için düşük agaroz konsantrasyonları kullanılarak nükleik asitlerin en iyi şekilde ayrılmaları sağlanır. Agaroz jeller genellikle floresan bir boya olan etidyum bromür ile boyanır ve UV ışğı altında DNA parçaları görüntülenir. 53 54 7) DNA DİZİ ANALİZİ Dizi analizi için iki farklı yöntem vardır; 1) Zincir Sonlandırma(chain termination): İngiltere’de F. Sanger ve A.R. Coulson tarafından geliştirilmiştir. 2) Kimyasal Yıkılım (chemical degradation): ABD’de A.Maxam ve W.Gilbert tarafından geliştirilmiştir. Her iki yöntem birbiriyle neredeyse aynı olmasına rağmen kimyasal yıkılım neredeyse hiç kullanılmamıştır. PCR ürünleri CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing ile Quick Start Kit kullanarak sekanslanır (CEQ 2000XL DNA Analysis System, Beckman Coulter). Tüm DNA fragmentleri sekanslanır. Sekanslar GENEIOUS, versiyon 3.5.4 programı ile analizlenir (Drummond et al., 2007). 55 b) Poliakrilamit Jel Elektroforezi Poliakrilamit jeller, vinil polimerizasyonuyla akrilamit monomerlerinin uzun poliakrilamit zincirleri ve genellikle ortama belli miktarda ‘bis’ olarak bilinen N,N’-metilen-bis-akrilamit ilavesiyle çapraz bağlanmalar yaparak oluşur. Akrilamit/bis karışımı polimerleşmeyi katalizleyen amonyum persülfat ile TEMED varlığında polimerleşerek jel yapısı kazanır.Çapraz bağlanmalar sonucu oluşan porların büyüklüğü akrilamit ve bis-akrilamitin başlangıç konsantrasyonlarına bağlıdır. Poliakrilamit jel elektroforezi küçük DNA moleküllerini ayırmak için uygundur. Manuel DNA dizi analizi çıkarmak için ve sadece birkaç tekrarlı dizi bakımından farklı olan mikrosatellit DNA moleküllerini ayırmak için kullanışlıdır. Poliakrilamit jeller genellikle gümüş nitrat veya etidyum bromür ile boyanarak nükleik asitlerin görüntülenmesi sağlanır. 56 57 Jel Elektroforez  1-D Jel Elektroforez  2-D Jel Elektroforez  3-D Jel Elektroforez (görüntüleme) 1-D Jel Elektroforez 1) Örnek Hazırlanması  Protein Ekstraksiyonu       Memeli dokulardan Eritrositlerden Yumuşak bitkisel dokulardan Mayalardan ektraksiyon Bakterilerden ektraksiyon Yağlı dokulardan ektraksiyon  Protein Konsantrasyonun Belirlenmesi  Warburg-Christian yöntemi  Biüret yöntemi  Bradford yöntemi  Lowry yöntemi DNA, RNA veya Protein moleküllerinin, elektriksel ortamda jel kalıp üzerine ayrıştırılarak aktarılması işlemidir. 60 61 62 Jel Elektroforez Aşamaları Örnek hazırlanması Jel elektroforez Protein emdirimi Protein belirlenmesi PROTEİN EKTRAKSİYONU  Tampon çözelti eklenmesi  Örneklerin koyulup ezilmesi Örneklerin santrifüjlenmesi  Süpernatant çekilmesi PROTEİN KONSANTRASYONU  Örneklerin ve standart proteinin(BSA) mikroplakalara yüklenmesi  Boya çözeltisinin eklenmesi Elisa reader’ da boyanın özelliğine göre belirli bir nm’ de(450-595) okuma yapılması   Toplam protein miktarının belirlenmesi 2) Protein Elektroforez PAGE – polyacrilamide gel electrophoresis  kesiksiz (tek ayırıcı jel)  kesikli (yükleme jeli; büyük delikli, ayırma jeli; küçük delikli) Jelin Koşturulması Proteinin yürüdüğünü gösteren İzleme boyası Koşturma işlemi Boyama Protein jelinin boyama sonucu görüntüsü Western Emdirimi (Blotting) Elektroforez sonrası jel üzerinde bir takım enzimler ortaya çıksa da çok düşük molekül ağırlıklı(1-5ng) proteinler bu jelin polimer ağı içerisinde gömülü halde bulunurlar. Bu nedenle bu proteinlerin saptanması için ayrı bir yöntem kullanmak gerekmektedir.  Pasif emdirim  Elektro-emdirim Pasif Emdirim Jeldeki protein bantlarının Islak filtredeki tampon aracılığı İle membran tarafından emilmesi (1-2 gün) Tank Aktarma Sistemi ile Emdirim (Islak Emdirim) 45 dk Yarı Kuru Emdirim Membrana geçirme işlemi Membrandaki boşlukların kapatılması Hedeflenen Proteine özgü antikor 2-D Jel Elektroforez 1) Bir örnekteki tüm proteinleri geniş bir skala içerisinde belirlemek 2) Farklılık ortaya koymada(dayanıklı-hassas) Proteinlerin izoelektrik yüküne göre+ birikimi ve – yük taşıyan aminoasit İzoelektrik noktaları belli amfolit Myzus persicae Primicarb dirençli ve hassas ırkların karboksilesterazlarının iki boyutlu elektroforezde İncelenmesi * * Kwon et al. 2008 Kesilerek Örnek alınması Kesilen kısmın tüpe aktarımı Protease içeren Sıvı aktarımı Sonrasında buharlaşmaya bırakılır ve geriye kuru peptidler kalır Sonrasında buharlaşmaya bırakılır ve geriye kuru peptidler kalır Tamamen kuruduktan sonra içerisine peptid çözücü bir diğer sıvı konulur ve analiz için hazır hale getirilir. Sekans Analiz Teknikleri  Mass Spektrofotometre (MS) sekans analizi  Edman degredation sekans analizi Mass Spektrofotometre ile Sekans Analiz Teknikleri 1 - Peptid kitle parmakizi metodu [Peptide mass fingerprinting, Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (Maldi MS)] 2 - Sekans bazlı tanımlama (Sequence based identification, Tandem MS-MS) 3 - Sıvı kromotografi-kütle spektrofotometre (LC-MS) ile sekans analizi LC-MS Spektrofotometre Çözülmüş peptid sıvı kromotograf (LC) tüpüne konulur. Tüp içerisindeki kürecikler tarafından peptidler uyarılır ve uyarılma derecelerine göre düzenli bir akış olur.  Peptidler + yükle yüklenir Elektrik yüküyle beraber ağırlığına göre ayrım olur.  Bu boşlukta damla buharlaşır.  İyonlar – yüklü MS’ e geçer. 2 +, 2 – yüklü çubuk  Peptidler 1. kısımdan vakum İçerisinde geçer.  Bunun yanında gaz moleküller 2. Kısma geçiş yapar. Genellikle Nitrojen ve argon’ dur.  Peptidler 2. kısımdaki gaz ile çarpışırlar.  Peptidler kısımlara ayrılırlar ancak Kendilerini oluşturan aminoasitlere ayrılmaz.  Yalnızca + yükle yüklü peptid kısımları bu plaka tarafından bir sonraki kısma gönderilir.  Yükü olmayanlar direk geçiş yapar.  Zamanlayıcı peptid kısımlarının plakadan dedektöre kadar ne kadar sürede ulaştığını hesaplar.  Ağırlığı fazla olanlar çabuk ulaşırken, Ağırlığı az olanlar daha geç ulaşacaktır. Yandaki şekilde verilmiş olan pikler peptidin ulaşma zamanı aynı zamanda ağırlığını belirlemektedir.  Bu yöntemle birlikte her peptid Bağındaki aminoasitin ağırlığı Belirlenebilmektedir.  Bundan sonraki işlemde ise elde edilen veriler bilgisayar ortamında diğer bilinen aminoasit sekansları ile karşılaştırılır ve muhtemel protein belirlenir. Primicarb dayanıklı M. persicae ırkının esteraz sekans analizi Dİğer MS Teknİklerİ Edman Degradation Aminoasit Sekans Analizi  Bir peptid’ deki aminoasitlerin sekansı için kullanılan bir yöntem  Terminal bir amino grubu kullanılarak işlem yapılmaktadır.  Peptid’ deki amino grubu diğer pepttid bağları bozulmadan belirlenmektedir. Phenylisothiocyanate (HPLC’ de ajan kullanılan kimyasal madde) türevi Phenylthiocarbamoyl türevin aminoasit ile bağlanması Phenylthiohydantoin (PTH)- aminoasit Kromotografi cLC Capillary 492 Protein Sequencing System  MS yerine Edman degradation kullanılması daha yaygındır.  daha fazla peptid belirlenebilmesi (MS: en fazla 20) (ED: en az 30, en fazla 60) Protein Array (Chip) Teknolojisi  Farklı amaçlar için kullanılır;  Antikor-antijen  Protein-protein  Protein-küçük moleküller  Protein-nükleik asit  Protein-lipid interaksiyonlarının belirlenmesinde kullanılır. Yüzeye bilinen bir protein, antikor vb. bağlanır. Belirlenecek örnek yüzeye aktarılır. Maya 2 Hibrit Metodu  Mayanın gen transkripsiyonu mekanizmasından yararlanır.  Bait; bilinen bir protein  Prey; bilinmeyen protein  İki proteinin etkileşimi Reporter gen Reporter gen oluşturan hücreler DNA sekans analizi yapılır . Akarlarda Yürütülen Moleküler Çalışmalar 105 Araştırmalar  Moleküler çalışmalar, çevre, iklim, konukçu ve tarımsal uygulamalardan etkilenip etkilenmediği ve populasyonlar arasındaki gen akışları konularının açıklığa kavuşturulmasında kullanılmaktadır. DNA bilgilerini hangi alanlarda kullanabiliriz : 1. Filojeni çalışmalarında 2. Filocoğrafya ve türlerin genetik yapısını incelemede 3. Türlerin tanımlanmasında 4. Yeni coğrafi bölgelerde türlerin ortaya çıkışlarının takip edilmesinde 5. Wolbachia ve üreme uyuşmazlıklarında 106 Sonuç  Yapılan literatür çalışmasına göre tetranychid’ler ve phytoseiid’ler üzerine     yapılan moleküler çalışmaların 1992 yılından itibaren başladığı ancak son 10 yılda oldukça yoğunlaştığı görülmektedir. Bu çalışmalarda genellikle morfolojik karakterlerle filogenetik ağaçlar arasındaki ilişkiler incelenmiş olup, bu sayede türlerin birbirinden ayrılmasında moleküler metotların kullanılabilirliği üzerinde durulmuştur. Yine bu yöntemlerin türlerarasında olduğu gibi tür içi farklılıkların da kullanılabilirliği, farklı popülasyonların veya ırkların ayrılması hızlı bir metot olup olmadığı incelenmiştir. Farklı konukçuların veya farklı coğrafik bölgelerin popülasyonlarının ayrılmasında da moleküler yöntemler kullanıldığı görülmüştür. Özellikle ribozamal ve mitokondrial DNA markırlarının yaygın olarak kullanıldığı literatürden de anlaşılmaktadır. 107