Slayt 1

NAT – Yöntem onayı
Dr. A. Arzu Sayıner
Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji AD
Yöntem onayı (minimum)
Ticari test
(Verifikasyon)
Doğruluk
Tekrarlanabilirlik
(intra-,inter-assay)
Doğrusallık
Laboratuvar yapımı test
(Validasyon)
Doğruluk
Tekrarlanabilirlik
(intra-,inter-assay)
Doğrusallık
(kantitatif ise)
(kantitatif ise)
Duyarlılık
Özgüllük
Rabenau HF et al, J Clin Virol 2007
Kalitatif
HSV
Problem


LYT – kalitatif HSV DNA PCR
CE belgeli test – kantitatif HBV DNA PCR
LYT – Analitik duyarlılık

Analitik duyarlılık (saptama alt sınırı)

Probit analizi




CLSI  5 örnek x 12 çalışma (60 veri)
Örnekler saptama alt sınırının altı ve üstü olacak şekilde
farklı konsantrasyonlarda analit içermelidir.
%95 olasılıkla saptanan en düşük konsantrasyon,
saptama alt sınırı olarak seçilir.
Farklı matriksler ve genotipler için yeniden
değerlendirilmelidir.
LYT – Kesinlik (Tekrarlanabilirlik)

Çalışma içi


Çalışmalar arası



1P ve 1 N  üçer kez çalışılır. (Rabenau)
1P ve 1N  üç ayrı günde birer kez (gerekirse ayrı kişiler
tarafından) çalışılır. (Rabenau)
CLSI  Saptama alt sınırı civarında 3 farklı konsantrasyondaki
örneğin >15 gün ikişerli çalışılması  Gerekiyorsa sayı
azaltılabilir ancak ölçüm gücü de azalır.
Sonuçlar SD ve %CV olarak incelenir.

Kabul edilebilir değer? (sayısal değer veya log10 karşılığı
kullanılabilir)


CV ≤%15, kantitasyon alt sınırı için %20, biyokimya testleri için %30
Her bir konsantrasyon için ayrı hesaplanarak konsantrasyon – kesinlik
ilişkisi belirlenebilir.
LYT - Özgüllük


Çapraz reaksiyon
 Benzer genetik yapıya sahip mo
 Örnekte bulunması olası flora üyeleri
 Benzer hastalık veya koinfeksiyon yapan mo
 Hedef NA dizisine benzer diziye sahip mo (GenBank –
BLAST ile tarama)
İnterferans




Hb
Lipid
Bilirubin
İlaçlar, antikoagülanlar,…
LYT - Özgüllük



İnterferans yaratabilecek maddeyi içeren,
hedefi içeren ve içermeyen örneklerin eş
zamanlı çalışılması
Örnek sayısı : En az 20 (Rabenau)
Çapraz reaksiyon yapabilecek mo yüksek
konsantrasyonda (105 kopya/ml)
olmalıdır.
LYT - Doğruluk

Yeni test ile belirlenen değer ile beklenen değer arasındaki yakınlık.

İçeriği bilinen standart örneklerin çalışılması



Yöntemlerin karşılaştırılması (örnek ikiye bölünür).
Örnekler




Gerçek hasta popülasyonunu temsil etmeli
Farklı genotipleri içermeli
Negatif ve farklı düzeylerde pozitif örnekler içermeli
Farklı matriksler kullanılacaksa, her biri ayrı ayrı değerlendirilmeli




Standartlar, kalite kontrol örnekleri
Kalan hasta örnekleri – saklama koşulları önemli !
Diğer laboratuvarlardan edinilecek örnekler
Ticari kaynaklar
Örnek sayısı


>20 olmalı. LYT için 50 pozitif, 100 negatif örnek.(Burd)
LYT için  3 YP, 3 DP, 3 negatif (Rabenau)
LYT-Doğruluk değerlendirme

Saçılma grafiği “Scatter diagram”
 Dışarıda kalanlar incelenmeli
 Korelasyon / Regresyon analizi



Eğim ve korelasyon katsayısı ile uyum
belirlenir. Eğimin 1’e yakın olması,
korelasyon katsayısının r2≥0.95 olması
önerilir.
Farklılık grafiği (Blant-Altman grafiği)
Ölçülen sapmanın, kabul edilebilir aralık
ile olan ilişkisi incelenir.
Referans testi doğru olarak kabul ettiği için
yeni testin üstün olduğu durumlarda
sorun olabilir.
Klinik verilere göre doğruluk belirleme


2x2 tablo ile değerlendirilir.
Kappa değeri >0.80 önerilir.
Yöntem onayı (minimum)
Ticari test
(Verifikasyon)
Doğruluk
Tekrarlanabilirlik
(intra-,inter-assay)
Doğrusallık
(kantitatif ise)
Kantitatif HBV
Laboratuvar yapımı test
(Validasyon)
Doğruluk
Tekrarlanabilirlik
(intra-,inter-assay)
Doğrusallık
(kantitatif ise)
Duyarlılık
Özgüllük
Rabenau HF et al, J Clin Virol 2007
CE belgeli test - Kesinlik
Burd


YP 1 örnek + DP 1 örnek  3er kez 5 gün
Rabenau


Çalışma için (intra-assay)


P 3 örnek + DP 3 örnek  3er kez
Çalışmalar arası (inter-assay)

P 1 örnek + DP 1 örnek  Birer kez 3 gün
Değerlendirme



Sayısal değer ve log10 karşılığı kullanılır.
SD ve %CV hesaplanır. Firmanın sonuçları ile karşılaştırılır.
CE belgeli test - Doğruluk

Burd



Rabenau


P 3 örnek + DP 3 örnek + Negatif 3 örnek
Yöntem



20 hasta örneği  İkişer kez 2-5 çalışma veya
YP ve DP standartlar  İkişer kez 2-5 çalışma
Referans örneklerin çalışılması
Referans yöntem ile karşılaştırma
Değerlendirme



xy eğrisi ve regresyon analizi
Bland-Altman grafiği ve bias hesaplanması
2x2 tablo ve kappa değeri
CE belgeli test - Doğrusallık

Yöntem:



Bir adet yüksek pozitif değeri bilinen örnekten 10 katlık en az
3 (CLSI: 5-7) dilüsyon hazırlanır. Her dilüsyon aynı çalışmada
çift çalışılır.
Dilüent: negatif plazma, su, SF olabilir. Kaydedilmelidir.
Değerlendirme

Beklenen değer (x) ile bulunan değerler (y) regresyon analizi
ile değerlendirilir.


Değerler log10 olarak girilir.
Tekrarlar tek tek veya ortalama değer olarak kullanılabilir.


Genelin dışında kalan bir adet örnek ihmal edilebilir. Daha çok
olması testin tekrarlanabilirlik sorunu olduğunu gösterebilir.
Linear regresyon analizinde ideal değer  r²:1
Kaynaklar


Burd EM. Validation of laboratory-developed
molecular assays for infectious diseases.
Clinical Microbiology Reviews 2010;23:550576.
Rabenau HF et al. Verification and validation
of diagnostic laboratory tests in clinical
virology. Journal of Clinical Virology
2007;40:93-98.

Download Report