Hippurat hidrolizi - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu

Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MİKROBİYOLOJİ
STANDARTLARI (UMS)
Hippurat Hidrolizi Testi
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-05
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Hippurat hidrolizi testi
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BİLGİ ................................................................... 3
TEKNİK BİLGİLER ............................................................. 3
1
2
3
4
Test için asgari laboratuvar koşulları ................................ 3
Testin uygulanması ....................................................... 5
Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması ...................... 5
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 5
KAYNAKLAR ..................................................................... 6
Sayfa 2 / 6
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-05 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Hippurat hidrolizi testi
Kapsam ve Amaç
Bakterilerin hippuratı hidrolize etme yeteneklerinin gösterilmesi tür düzeyinde
tanı için önemli bir tanımlama parametresidir. Klasik olarak hippurat hidrolizi 48
saatte sonuç veren bir test ile saptanabilmekte idi. Günümüzde 2 saatte sonuç
veren hızlı hippurat testi kullanılmaktadır (1). Bu UMS’de de hızlı hippurat testinin
uygulanması ve yorumlanmasına dair bir rehber sunulması hedeflenmiştir.
Kısaltmalar ve Tanımlar
PYR L-pirolidonil--naftilamid
Genel Bilgi
Bazı bakteriler sodyum hippuratı benzoik asit ve glisine yıkan hippurikaz
enzimine sahiptirler. Hippurat testi, ortama indikatör olarak ninhidrin ilave
edildiğinde glisin ile verdiği reaksiyonun gözlenmesine dayanır (2,3).
Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Gardnerella vaginalis,
Streptococcus agalactiae ve diğer bazı bakteriler %1’lik sodyum hippurat ile
inkübe edildiklerinde hippuratı hidrolize ederler. Oksitleyici bir ajan olan ninhidrin
ilavesi ile glisin deamine olarak indirgenir ve ortam rengi mavi-mora döner.
Ninhidrin her tür serbest aminoasit ile reaksiyona girebildiği için ortamda
glisinden başka aminoasit bulunması yanlış pozitif sonuç alınmasına yol açabilir.
Bu olasılığı önlemek için test süspansiyonu sadece hippurat içermelidir (2,3).
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS’de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar
şartlarında gerçekleştirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluşturması muhtemel tüm laboratuvar çalışmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS’yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aşina olmalı, ve; (iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-05 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 6
Hippurat hidrolizi testi
1.3. Örnek, Besiyeri, Donanım
Test mikroorganizmaları

Hippurat testi gerekli görülen mikroorganizmanın taze kültürü.

Tür düzeyinde tanımlanmak üzere şüpheli bakteri izolatları;
(a) L. monocytogenes şüpheli izolat (eğer katalaz pozitif, -hemolitik,
25°C’de hareketli, narin, gram pozitif çomaklar tanımlanmış ise),
(b) S. agalactiae şüpheli izolat (eğer katalaz negatif, dar -hemoliz
zonlu şeffaf koloniler gram pozitif koklar olarak tanımlanmış ise),
(c) C. jejuni şüpheli izolat (eğer oksidaz ve katalaz pozitif, aerob
üreyemeyen, kıvrık gram negatif çomaklar tanımlanmış ise),
(d) G. vaginalis şüpheli izolat (eğer katalaz-negatif, narin, gram
değişken çomaklar tanımlanmış ise).
%1’lik sodyum hippurat

Hippurat test solüsyonu - piyasadan temin edilebilir (tüplerde liyofilize
halde veya diskler ya da tabletler halinde); üretici firmanın talimatına
göre kullanılır. Hippurat test solüsyonu laboratuvarda da hazırlanabilir.

Hazırlamak için; 1 g sodyum hippurat 100 mL distile suya karıştırılır ve
erimesi sağlanır. Test tüplerine 0.4 mL alikotlar halinde dağıtılır,
etiketlenir ve derin dondurucuya (-20°C) kaldırılır. Raf ömrü 6 aydır.
NOT: G. vaginalis için pozitif reaksiyonun saptanmasında pH’ın 6.4’e
ayarlanmış olması önemlidir (3).
Ninhidrin solüsyonu

Ninhidrin piyasadan liyofilize halde temin edilebilir. Üretici firmanın
talimatına göre kullanılır.

Laboratuvarda hazırlamak için; bir kahverengi cam şişeye 50 mL
aseton ve 50 mL butanol konur. Üzerine 3.5 g ninhidrin ilave edilir,
karıştırılır, etiketlenir. Oda ısısında saklanır. Raf ömrü 6 aydır.
NOT: Ninhidrin ile çalışırken cilde veya giysilere dökülmemesine dikkat
edilmelidir. Mavi bir renk meydana getirir. Yıkamakla geçmez, ciltten
24-48 saatte temizlenir.
Diğer gereç, donanım

Öze, steril tek kullanımlık veya nikrom

İnkübatör
1.4. Kalite kontrol

Her yeni reaktif serisi kullanıma sokulmadan önce ve kullanılırken en
az ayda bir kalite kontrol organizmaları ile test edilmelidir. Reaktifler
kalite kontrolü geçemezlerse kalanlar atılmalı ve yeni seri yapılmalıdır.

Kalite kontrol organizmaları (3).
Streptococcus agalactiae ATCC 12386 - hippurat pozitif
Streptococcus pyogenes ATCC 19615 - hippurat negatif
Sayfa 4 / 6
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-05 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Hippurat hidrolizi testi
2 Testin uygulanması
NOT: Test prosedürü laboratuvarda hazırlanan hippurat solüsyonu içindir!

Hippurat solüsyonu içeren tüp derin dondurucudan çıkarılır, erimesi ve
oda sıcaklığına gelmesi beklenir.

İncelenecek bakterinin taze agar kültüründen tek düşmüş bir koloniden
öze ile alınarak hippurat tüpünün içinde homojenize edilir. Yoğun
(≥McFarland standart No 3) bir süspansiyon elde edilmelidir.
ÖNEMLİ: Koloniden alınırken agar besiyeri parçası almamaya büyük
özen gösterilmelidir. Çünkü besiyerinden protein içerik taşınabilir ve
ninhidrin ile reaksiyona girerek yanlış pozitif sonuca neden olabilir.

Tüp 2 saat 35-37°C’de inkübasyona kaldırılır.

İnkübasyon sonunda hippurat-bakteri tüpüne 4 damla ninhidrin
solüsyonu damlatılır.

Tüp 30 dakika daha 35-37°C’de inkübe edilir. Ancak 10 dakikada bir
tüp renk değişimi yönünden incelenmelidir. Renk değişimi genellikle,
ninhidrin ilavesinden sonra 10-15 dakika içinde meydana gelir.
3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması
Pozitif sonuç - 30 dk içinde koyu mavi bir renk oluşumu
Negatif sonuç - Renk değişimi olmayışı veya hafif mor renk oluşumu
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Eğer ninhidrinin inkübasyonu 30 dakikayı geçerse yanlış pozitif sonuç
alınabilir.

S. agalactiae’nin bütün kökenleri -hemolitik değildir. Öte yandan
viridans grup streptokoklar da hippurat pozitif olabilirler. Bu nedenle
non-hemolitik kolonilerin S. agalactiae olup olmadığının
belirlenmesinde başka testlere de başvurulmalıdır.

Enterokokların nadir kökenleri -hemolitik olabilir ve hippuratı hidrolize
edebilirler. Ancak bunlar PYR pozitif olmaları ile ayırt edilirler.

C. jejuni’nin küçük bir yüzdesi hippurat negatif olabilir; diğer
metotlarla tanımlanmalıdır.

Bakteriyel vajinoza neden olan biyotipler hippurat negatif
olabileceklerinden, negatif test G. vaginalis tanısını dışlamamalıdır.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-05 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 6
Hippurat hidrolizi testi
Kaynaklar
1
Hwang MN, Ederer GM. Rapid hippurate hydrolysis method for presumptive identification of
group B streptococci. J Clin Microbiol 1975;1:114–115.
2
Pratt-Rippin K, Pezzlo M. Identification of commonly isolated aerobic gram-positive bacteria.
Rapid hippurate hydrolysis test. In: Isenberg HD (ed. in chief). Clinical Microbiology Procedures
Handbook. ASM Press, Washington D.C. 1992, p. 1.20.21-22
3
York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic
bacteria. Hippurate Hydrolysis Rapid Test. In: Garcia LS, Isenberg HD (eds). Clinical
Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p.
3.17.21.1 - 3.17.21.3
Sayfa 6 / 6
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-05 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji

Download Report