Bile-eskülin hidrolizi - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu

Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MİKROBİYOLOJİ
STANDARTLARI (UMS)
Eskülin ve Safra-EskülinTestleri
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-02
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Eskülin ve Safra-eskülin testleri
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BİLGİ ................................................................... 3
TEKNİK BİLGİLER ............................................................. 4
1
2
3
4
Test için asgari laboratuvar koşulları ................................ 4
Testin uygulanması ....................................................... 5
Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması ...................... 6
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 6
KAYNAKLAR ..................................................................... 7
Sayfa 2 / 7
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-02 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Eskülin ve Safra-eskülin testleri
Kapsam ve Amaç
Bazı organizmalar eskülini hidrolize edebilen enzimlere sahiptir. Enzim
aktivitesinin gösterilmesinde ise eskülin ve safra-eskülin testleri kullanılır.
Özellikle safra-eskülin testi enterokokların ve Streptococcus bovis grubu
bakterilerin (ki, hemen hepsi pozitiftir), diğer streptokoklardan ayırıcı tanısında
temel bir testtir.
Bu UMS‟de de eskülin ve safra-eskülin testlerinin dayandığı prensipler ile
kullanım ve yorumlanmalarına dair bir rehber sunulması hedeflenmiştir.
Kısaltmalar ve Tanımlar
PYR
L-pirolidonil--naftilamid
LAP
Lösin aminopeptidaz
Genel Bilgi
Eskülin bir „glikozid‟dir ve bazı bakterilerin ürettiği bir yapısal enzim olan
eskülinaz (-glikozidaz) aktivitesi ile glikoz ve eskületine yıkılır. Eskületin, eğer
ortamda demir tuzları varsa, bunlarla bir fenolik demir kompleksi oluşturarak
besiyerinin rengini kahverengi veya siyaha çevirir. Eskülin, aynı zamanda
floresan bir maddedir ve üreyen mikroorganizma tarafından yıkılmakta olduğu,
ortamdan yayılan floresanın azalması ve kaybı ile gösterilebilir (1,2).
Öte yandan, eğer eskülin içeren bir besiyerine safra tuzları da eklenecek olursa,
safra varlığında üreyebilen organizmaların eskülini hidrolize edip etmediklerini
test etmek mümkün olur. Bu amaç için kullanılan safra-eskülin agar bakteri için
besleyici maddeler, eskülin ve ferrik sitrata ilave olarak %40 safra içerir. Söz
konusu safra yoğunluğunu elde etmek için ise besiyerinde genellikle „oxgall‟
kullanılır (%4 oxgall, %40 safraya eşdeğerdir) (1,3). Safra-eskülin agar seçici ve
ayırt ettirici bir besiyeridir. Safra besiyerine seçicilik özelliği kazandırırken ferrik
sitrat demir kaynağı olarak işlev görür; eskülinin hidroliz ürünü ile reaksiyona
girerek testin pozitif olduğunu gösterir.
Pek çok bakteri asidik şartlar altında eskülini hidrolize eder; bazı bakteriler de,
özellikle gram negatif enterikler, safraya tolerans gösterirler. Buna karşın
streptokoklar arasında, tipik olarak sadece enterokoklar ve S. bovis grup üyeleri
(S. equinus, S. gallolyticus, S. infantarius ve S. alactolyticus) yüksek oranda
safra varlığında ürer ve eskülini hidrolize ederler. Bu özelliklere sahip bir diğer
gram pozitif mikroorganizma ise Listeria monocytogenes‟tir (1).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-02 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 7
Eskülin ve Safra-eskülin testleri
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS‟de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar
şartlarında gerçekleştirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluşturması muhtemel tüm laboratuvar çalışmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS‟yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aşina olmalı, ve; (iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
1.3. Örnek, Besiyeri, Donanım
Test mikroorganizmaları

Taze kültürlerinden şüpheli izolatlar (ayırıcı tanısı için eskülin ve/veya
safra-eskülin testi gereksinimi duyulan):
(a) S. bovis grup şüpheli izolat (katalaz negatif, gram pozitif, zincir
yapmış kok)
(b) Enterokok şüpheli izolat – diğer PYR pozitiflerden ayırıcı tanı için
(c) Listeria şüpheli izolat (hemolitik, katalaz pozitif, gram pozitif
çomaklar)
(d) Oksidaz pozitif gram negatif çomaklar (Aeromonas spp dahil) ve
sarı pigmentli nonfermenterler – (safrasız) eskülin testi

Pozitif kan kültürü – eğer mikroskopide gram pozitif kok zincirleri veya
gram pozitif çomaklar görülmüş ise, enterokok veya Listeria olasılığı
için hızlı (4 saat) bir ön tanı koyabilmek amacıyla
Besiyeri / Reaktif

Safra-eskülin yatık agar veya plak besiyeri – ferrik (Fe3+) sitrat içerir.
Piyasadan hazır temin edilebilir. Laboratuvarda hazırlanabilir.
ÖNEMLİ: Hazır veya toz besiyeri olarak satın almadan önce
besiyerinin içerdiği safra oranına (%40 safra veya %4 oxgall olup
olmadığı) bakılmalıdır. Bazı formüller daha düşük oranda safra içerir;
bunlar amaca uygunluk açısından laboratuvar tarafından
değerlendirilmelidir!

Safra-eskülin azid agar/buyyon – ilave olarak azid (gram negatiflerin
çoğu için inhibitör) içerir. Sulardan enterokok izolasyonunda kullanılır.
Sayfa 4 / 7
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-02 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Eskülin ve Safra-eskülin testleri

„Peptose-yeast-esculine‟ buyyon – anaeroblar ve mikroaerofiller için.

Eskülin agar (kalp-infüzyon baz besiyerine %0.1 eskülin eklenmiş
formül) – safra veya azid içermez; ancak ferrik (Fe3+) sitrat içerir.

Hızlı eskülin testleri – Piyasada filtre kağıdına emdirilmiş veya tüpte
hızlı test reaktifleri mevcuttur. Bunlardan bazıları PYR, LAP gibi diğer
tanımlama parametreleri ile kombine olabilir.
NOT: Bütün besiyerleri buzdolabında (2-8°C) saklanmalıdır.

Eğer demir besiyerine katılmamış ise ayrıca reaktif olarak (%1‟lik ferrik
[Fe3+] amonyum sitrat) temin edilir.
Diğer gereç, donanım

Öze, steril tek kullanımlık veya nikrom,

Test tüpleri,

Uzun dalga boylu (360 nm) UV lamba (Wood lambası),

İnkübatör (35°C)
1.4. Kalite kontrol

Her yeni besiyeri ve reaktif lotu kullanıma sokulmadan önce pozitif ve
negatif kalite kontrol suşları ile test edilmelidir.

Agar besiyerleri her kullanımdan önce donma, kuruma, kontaminasyon
ve çatlak vb. için kontrol edilmeli, uygunsuz olanlar atılmalıdır.

Ekim yapılmamış sıvı besiyerinin floresan verme durumu kontrol edilir.

Kalite kontrol organizmaları (1):
Enterococcus faecalis ATCC 29212 - safra-eskülin ve eskülin pozitif
Escherichia coli ATCC 25923 - safra-eskülin ve eskülin negatif
Streptococcus pyogenes ATCC 19615 - safra-eskülin ve eskülin negatif
2 Testin uygulanması
2.1. Tüp testi

Öze ile incelenecek bakterinin taze kültüründen tek düşmüş bir koloni
alınır. Safra-eskülin (veya eskülin) agar (veya sıvı) besiyerine inoküle
edilir.
ÖNEMLİ: Enterokok ve S. bovis tanımlaması için sadece %40 safra
içeren besiyeri kullanılır ve 10-µL kalibreli öze ile -steril suda 0.5
McFarland bulanıklığında hazırlanmış bakteri süspansiyonundan- bir
öze dolusu inoküle edilir (3).

Tüpün kapağı gevşekçe kapatılır.

35°C‟de 24 saat (yavaş üreyen gram negatifler ve anaeroblar 7. güne
kadar) inkübe edilir; renk değişimi gözlenir. Enterokoklar ve S. bovis
için sadece 18-24 saat inkübasyon sonrası değerlendirme yapılır.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-02 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 7
Eskülin ve Safra-eskülin testleri

Eğer demir içermeyen eskülin buyyon kullanılıyorsa günlük olarak
floresan kaybı takip edilir.
ÖNEMLİ: Karşılaştırma için paralel olarak inoküle edilmemiş bir kontrol
tüpü de kullanılmalıdır. Floresan gözlenmediğinde tüpe 2-3
damla %1‟lik ferrik amonyum sitrat ilave edilir ve renk değişimi
gözlenir. İstenirse her gün tüpten bir alikot alınıp indikatör ilave ederek
de eskülin hidrolizi olup olmadığı takip edilebilir.
2.2. Disk testi

Disk bir damla distile veya deiyonize su ile ıslatılır.

Steril bir öze ile bakterinin 18-24 saatlik taze kültüründen 2-3 tek
düşmüş koloni alınır ve disk üzerine ezerek sürülür.

Oda ısısında 10 dk bekletilir.

Diskte koyu kahverengi veya siyah renk değişimi olup olmadığı gözlenir.
3 Sonuçların değerlendirilmesi/yorumlanması
3.1. Tüp testi

Pozitif sonuç (a) Demir içeren besiyerinde siyahlaşma görülmesi;
(b) Demir içermeyen besiyerinde demirli reajenin damlatılması ile
siyah renk oluşması;
(c) UV lamba altına tutulduğunda besiyerinin floresan vermemesi

Negatif sonuç (a) Demir içeren besiyerinde siyahlaşma görülmemesi;
(b) UV lamba altında tutulduğunda besiyerinin floresan vermesi.
NOT: Safra toleransı olmayan bakteriler, eskülini hidroliz yeteneğine
sahip olsalar da, safra-eskülin besiyerinde üreyemezler ve negatif
sonuç verirler.
3.2. Disk testi

Pozitif sonuç – koyu kahverengi veya siyah renk gelişmesi

Negatif sonuç – diskin renksiz kalması
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Safra-eskülin agar kullanılırken, eğer inokulum fazla veya besiyerinin
safra konsantrasyonu %40‟dan az ise yanlış pozitif reaksiyonlar
görülebilir.
Sayfa 6 / 7
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-02 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Eskülin ve Safra-eskülin testleri

Birçok mikroorganizmanın metabolizması esnasında meydana
getirebildiği H2S (hidrojen sülfür) de demir ile reaksiyona girerek siyah
renk meydana getirir ve eskülin hidrolizi deneyinde karışıklığa neden
olur. Bu durum göz önünde bulundurularak, gram negatif çomakların
eskülin hidrolizi testinde reajen katıldıktan sonra meydana gelen
siyahlaşmanın ayrımını yapabilmek için tüpler UV lamba altında da
bakılmalıdır; yıkılmamış eskülin beyaz-mavi floresan verirken, eğer
eskülin yıkılmış ise floresan vermez.

Escherichia coli gibi bazı organizmalar indüklenebilir -glikozidaz
enzimine sahiptirler ve uzamış inkübasyonda eskülin reaksiyonu
verebilirler ve yanlış pozitifliğe neden olabilirler.
Kaynaklar
1 York MK, Traylor MM, Hardy J, Henry M. Biochemical tests for the identification of aerobic
bacteria. Bile-Esculin and Esculin Tests. In: Garcia LS (editor in chief). Clinical Microbiology
Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 3.17.5.1 - 3
2 MacFaddin JF, editor. Biochemical tests for identification of medical bacteria. 3rd ed. Philadelphia:
Lippincott Williams and Wilkins. 2000, p. 8-26.
3 Chuard C, Reller LB. Bile-esculin test for presumptive identification of enterococci and
streptococci: effects of bile concentration, inoculation technique, and incubation time. J Clin
Microbiol 1998;36:1135–1136.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-02 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 7

Download Report