PREGLED
REVIEW
Gynaecol Perinatol 2013;22(3):150–156
Poliklinika Gruji} Kora~in
IZVANSTANI^NE NUKLEINSKE KISELINE PLODA
U KRVI MAJKE – DIJAGNOSTI^KE MOGU]NOSTI,
PERSPEKTIVE I IZAZOVI
CELL-FREE FETAL NUCLEIC ACIDS IN MATERNAL BLOOD
– DIAGNOSTIC POSSIBILITIES, PERSPECTIVES AND CHALLENGES
Jasenka Gruji} Kora~in, @eljka Modri}
Pregledni ~lanak
Soyons réalistes – demandons l´impossible / Budimo realisti, zahtijevajmo nemogu}e
– parola sa zidova Sorbonne, svibanj 1968.
Klju~ne rije~i: testiranje izvanstani~nih nukleinskih kiselina ploda, izvanstani~na DNK (iDNK),
neinvazivno prenatalno testiranje (NIPT)
SA`ETAK. Tehnika izolacije fetalne DNK/RNK iz krvi majke bli`i se danas rutinskoj uporabi u prepoznavanju spola i
RhD imunizaciji u rizi~nim trudno}ama. Podru~je prenatalnog testiranja na naj~e{}e aneuploidije intenzivno se razvilo
posljednjih godina zahvaljuju}i novim tehnologijama koje su omogu}ile analizu genetskoga materijala ploda iz krvi
majke. Ovi testovi (neinvazivni prenatalni testovi – NIPT) jo{ su uvijek testovi probira, ali razvojem laboratorijskih
dijagnosti~kih postupaka mogu}e je da }e postati i dijagnosti~ki s obzirom na vrlo visoku osjetljivost i specifi~nost
(osjetljivost za naj~e{}u aneuploidiju, tj. trisomiju 21 je 99 – 100%). Mnoga su me|unarodna profesionalna udru`enja
implementirala NIPT u svoje preporuke u vezi s detekcijom naj~e{}ih aneuploidija, uvijek uz obvezno genetsko savjetovanje. U ovome se pregledu navode fiziolo{ke pretpostavke za NIPT, raspravlja se o klini~kim istra`ivanjima koja su
provedena i implikacijama koje prate uvo|enje ove, za sada skupe i u Hrvatskoj ve}ini trudnica nedostupne, ali vrijedne
i perspektivne metode koja bi i u smjernicama na{ih profesionalnih udru`enja mogla na}i svoje mjesto.
Review
Soyons réalistes – demandons l’impossible /Be realistic, ask for the impossible
– notice from the walls of the Sorbonne, may 1968
Key words: Cell-free fetal nucleic acid testing, cell-free DNA (cfDNA), non-invasive prenatal testing (NIPT)
SUMMARY. The technique of fetal DNA/RNA isolation is a routine procedure today, particularly in sex determination
and RhD immunization in high-risk pregnancies. The field of prenatal testing for the most common aneuploidies /trisomy 21, trisomy 18 and trisomy 13/ has seen an intensive development in the last few years thanks to new technologies
that use maternal blood for the analysis of fetal genetic material (the massive parallel sequencing method – MPS) but
also thanks to biostatistics’ algorithms. Noninvasive prenatal testing –NIPT is based on a molecular genetic method,
which can examine cell free DNA fragments circulating in maternal blood: the method is able to clarify the origin of
these fragments and to asses their amount. These tests /noninvasive prenatal tests – NIPT/ are still used as screening
methods but with the development of the technology and biostatistics analysis it is possible that they become diagnostic
tests due to their specificity and sensitivity /for trisomy 21 99–100%/ which is today already considerable. It is for this
reason that many international professional societies have implemented NIPT into their protocols for detection of the
most common aneuploidies. Genetic counseling is unavoidable in all protocols. This review article lists physiological
preconditions for the techniques of isolation of fetal DNA/RNA from maternal blood, necessary to perform noninvasive
prenatal tests – NIPT. It also discusses clinical trials which were conducted and the implications which implementing
this expensive (and therefore to most of our patients unavailable) but valuable method, that could in its future find a place
in the national protocol of prenatal screening for aneuploidies in Croatia.
Uvod
Razvoj novih neinvazivnih tehnologija koje omogu}uju genetsko testiranje ploda stavljaju pred medicinsku
zajednicu koja brine o zdravlju `ena nove zadatke, ali
i pitanja. Budu}i da se neinvazivno prenatalno testiranje – NIPT (engl. non-invasive prenatal testing) vr{i u
nas (za sada samo u nekoliko privatnih ustanova), `eljeli smo pregledom novije literature i protokola pribli`iti medicinskoj zajednici tehnologije koje omogu}uju
150
takvu dijagnostiku, ali i zapo~eti raspravu o mogu}im razmimoila`enjima koja uvijek prate nove, revolucionarne pomake u medicini. Valja znati da visoku
razinu znanja o NIPT-u ima (i u bogatijim i razvijenijim sredinama) tek 15% zdravstvenoga osoblja koje
se bavi porodni{tvom, kako u svojemu ispitivanju navode Sayres i sur.1 Bez dovoljne razine znanja o ovim
novim metodama ne}e biti mogu}a njihova implementacija u dijagnosti~ke protokole, osobito ne u na{oj sredini.
Gynaecol Perinatol 2013;22(3):150–156
Gruji} Kora~in J., Modri} @. Izvanstani~ne nukleinske kiseline ploda u krvi majke…
Fiziolo{ke pretpostavke
Prijelaz stanica s odr`anom jezgrom iz krvo`ilnoga
sustava ploda u krvo`ilni sustav majke uo~ili su jo{
1969. godine Walknowska i sur.2 Premda bi genetski
materijal dobiven iz ovih stanica mogao omogu}iti neinvazivno prenatalno testiranje, fetalne su stanice u maj~inoj krvi toliko rijetke da je njihova izolacija neisplativa.3 Radom koji su objavili Lo i sur. 1997. godine predstavljena je mogu}nost neinvazivnoga prenatalnoga
testiranja zahvaljuju}i izvanstani~noj fetalnoj dezoksiribonukleinskoj kiselini – ifDNK(engl. cell-free fetal
DNA – cfDNA) iz krvi majke,4 iako je prisutnost izvanstani~ne DNK (iDNK) u krvi uo~ena jo{ 1947., kako
navodi Amy Swanson.5 Izvanstani~nu DNK predstavljaju mali isje~ci dugi oko 200 parova baza.6 Ovi su
isje~ci zapravo rastavljena DNK koja potje~e iz apoptoti~nih stanica trofoblasta koji grani~i s interviloznim
prostorima. Isje~ci se odavde otpu{taju u maj~inu cirkulaciju.7,8 Izvanstani~na fetalna DNK mo`e se detektirati
od 5. tjedna trudno}e tijekom cijele trudno}e i u svih
trudnica.9
Nakon otkri}a na koje su ukazali Lo i sur.,4 uo~ena je i
prisutnost mRNK placentarnoga porijekla u krvi majke,
kao tre}i mogu}i izvor fetalnog geneti~kog materijala,10
pa su razvijene i metode kojima je mogu}a identifikacija
specifi~nih fetalnih RNA biljega iz maj~ine krvi.11
Ve}ina fetalne izvanstani~ne DNK i mRNK placentarnoga je porijekla uz manji udio fetalnoga hematopoetskoga sustava i samoga ploda.12
Polu`ivot fetalne izvanstani~ne DNK traje oko 16 minuta (16,3 min) pa nekoliko sati nakon poro|aja vi{e
nije mogu}e ustanoviti ifDNK u maj~inoj krvi. Stoga je
i mogu}e potpuno pouzdano tvrditi da je ifDNK u aktualnoj trudno}i ifDNK doti~noga ploda, a ne genetski
materijal ploda/plodova iz prethodnih trudno}a.13
Izvanstani~na DNK u krvi majke je ili maj~inoga ili
fetalnog porijekla. Fetalni udio – fetalna frakcija iznosi
od 3,4 – 6,2% do oko 10% (3 – 19%) ukupne koli~ine
ifDNK. Razina fetalnoga i maj~inoga udjela razlikuje se
me|u trudnicama.14,15 I fetalne i maternalne karakteristike utje~u na razinu pojedinoga udjela pa je koncentracija ifDNK ve}a u `ena afrokaripskoga i azijskoga
podrijetla, a ni`a u `ena koje pu{e duhan.16
Klini~ka primjena ifDNK u svrhu prenatalnoga testiranja najprije se odnosila na odre|ivanje spola u vezi s
X-vezanim bolestima i kongenitalnom adrenalnom hiperplazijom(CAH), na fetalnu RhD genotipizaciju i na
detekciju monogenskih bolesti zahvaljuju}i specifi~nim sekvencama na fetalnoj DNK zbog alela naslije|enih po ocu i de novo mutacija. Detekcija aneuploidija
mogu}a je jedino izra~unavanjem omjera koncentracije
heterozigotnih alela ili sekvenci specifi~nih za pojedini
kromosom.17
Odre|ivanje fetalnoga spola
Medicinska indikacija za prenatalno testiranje spola
odnosi se na prevenciju i lije~enje spolno vezanih bole-
sti. Tu se u prvome redu misli na X-vezane bolesti kakve
su hemofilija i muskularna distrofija Duchenne kada je
za mu{ki fetus rizik da naslijedi takvu bolest 50% ako je
njegova majka nositeljica promijenjenoga alela. Kako
se za trudne nositeljice mutiranoga gena na X-kromosomu preporu~uje jedan od invazivnih postupaka (biopsija korionskih resica ili amniocenteza) ranim neinvazivnim testiranjem spola, trudnice koje nose `ensko
dijete mogu biti po{te|ene rizika navedenih invazivnih
postupaka.18
U slu~aju kongenitalne adrenalne hiperplazije /CAH/
nastoji se ranim propisivanjem deksametazona majci
umanjiti stupanj virilizacije spolovila `enskoga fetusa.
Budu}i da deksametazon ne rje{ava uvijek virilizaciju
spolovila, a nosi rizike za plod i majku, ranom detekcijom mu{kih fetusa neinvazivnim testiranjem ifDNK
moglo bi ih se po{tedjeti propisivanja deksametazona
majci.19
Otkri}e izvanstani~ne fetalne DNK u maj~inoj plazmi odnosilo se na detekciju gena DYS14 lociranome na
Y-kromosomu metodom lan~ane reakcije polimeraze
(polymerase chain reaction – PCR).4 Budu}i da je detektabilna koncentracija DYS14 mala, osjetljivost testa
za trudno}e s mu{kim plodom nije prelazila u ovome
prvome istra`ivanju 80%. Razvojem novih testova za
odre|ivanje spola (koji uklju~uju i druge sekvence locirane na Y-kromosomu poput gena SRY (engl. sex determinining region Y), tj. testova kvantitativne lan~ane
reakcije polimeraze u vremenu (quantitative real-time
PCR – qPCR)– kakav je YRS-test(engl. Y chromosome
repetitive sequence assay), postigla se zna~ajno ve}a
osjetljivost i specifi~nost pri odre|ivanju spola fetusa.20,21 U metaanalizi (devedeset istra`ivanja) koju je
provela Caroline Wright (bilo je uklju~eno 9.995 trudno}a s 10.587 postupaka odre|ivanja spola) na|ena je
osjetljivost testova od 96,6% uz specifi~nost 98,9%, bez
obzira na to koristi li se kao »marker« mu{koga spola
SRY ili DYS14, a rezultati se nisu bitno mijenjali u
pojedinim fazama trudno}e.22
Neinvazivni prenatalni testovi za dokazivanje spola
dostupni su u Europi i rade se ve} od 7. tjedna trudno}e
uz preporuku lije~nika u slu~aju medicinske indikacije
za odre|ivanje spola fetusa.23 Eti~ki komitet ACOG-a
(American College of Obstetricians and Gynecologists) smatra da medicinska indikacija za detekciju spola postoji samo u slu~aju poznate ili u slu~aju sumnje na
spolno vezanu genetsku bolest.24 Jasno je da je, s obzirom na eti~ke implikacije prilikom odre|ivanja spola
ploda, komercijalizacija ovih testova neprihvatljiva,
osobito u patrijarhalnim dru{tvima.
NIPT i fetalna RhD genotipizacija
Ubrzo nakon otkri}a ifDNK, tj. mogu}nosti odre|ivanja fetalnoga spola, sli~ne su se metode upotrijebile i
za tipizaciju RhD statusa ploda. Vrlo efikasna perinatalna prevencija izoimunizacije propisivanjem profilakse
anti-RhD imunoglobulinom dobila je spoznajom o pre151
Gynaecol Perinatol 2013;22(3):150–156
Gruji} Kora~in J., Modri} @. Izvanstani~ne nukleinske kiseline ploda u krvi majke…
natalnome odre|ivanju RhD statusa ploda dodatnu dijagnosti~ku mogu}nost.
RhD negativnim trudnicama koje imaju visok rizik za
izoimunizaciju mogu}e je predlo`iti ifDNK RhD testiranje pa bi se anti-RhD imunoglobulin davao samo onima koje nose RhD pozitivni plod.25
Me|utim, ekonomske analize ne ukazuju na isplativost uvo|enja NIPT-a u protokole prenatalnoga nadzora
RhD negativnih trudnica.26
Detekcija fetalnih autosomalnih
monogenetskih bolesti
Budu}i da su mnoge bolesti uzrokovane mutacijama
pojedinoga gena, prenatalni invazivni dijagnosti~ki postupci ovih bolesti uobi~ajeni su u klini~koj praksi u
slu~aju pozitivne obiteljske anamneze.
Neinvazivni prenatalni testovi za autosomno dominantne bolesti temelje se na detekciji fetalnih DNA
sekvenci iz maj~ine krvi, naslije|enih od oca. Jo{ je
2000. godine detektirana analizom ifDNK, pomo}u PCR
metode i elektroforeze, miotoni~na distrofija ploda.27
U slu~aju autosomno recesivnih bolesti, ifDNK mo`e
se upotrijebiti da se utvrdi je li plod nosilac mutiranoga
alela naslije|enoga po ocu ako se aleli roditelja razlikuju. To se uspjelo posti}i za kongenitalnu adrenalnu
hiperplaziju pa je ro|ena zdrava djevoj~ica nakon {to je
analizom fetalne DNK dokazano da nema mutacije
o~inskoga alela.28
Nose li, me|utim, oba roditelja istu recesivnu mutaciju ili majka ima autosomno dominantnu mutaciju,
uobi~ajeno neinvazivno prenatalno testiranje konvencionalnim PCR-om nije mogu}e pa su Fiona Lun i sur.
razvili digitalnu metodu temeljenu na PCR tehnologiji
– RMD (engl. relative mutation dosage), kojom su
zna~ajno pro{irili mogu}nosti i indikacije za NIPT u
slu~aju maj~inske mutacije za npr.talasemiju i hemoglobinopatije.29
NIPT aneuploidija
Svakodnevni posao porodni~ara i primarne i konzilijarne razine ipak se daleko ~e{}e odnosi na prenatalnu
dijagnostiku aneuploidija. Otkako je dr. Jerome Lejeune
jo{ 1959. dokazao da je uzrok Downovu sindromu trisomija 21. kromosoma, desetak godina poslije Edwardsov sindrom povezan s trisomijom 18, a Patauov sindrom s trisomijom 13, potkrijepljene su spoznaje o klini~kome zna~enju numeri~kih odstupanja kromosoma.5
Jedno od 300 novoro|en~adi ra|a se aneuploidno, tre}ini spontanih poba~aja prethodi aneuploidnost ploda, a
do 30% ljudskih oplo|enih jaja{aca je aneuploidno.30
Trudnicama za koje se smatra da su u visokome riziku da nose aneuploidno dijete nudi se jedna od metoda uzorkovanja (amniocenteza ili biopsija korinskih resica) koje omogu}uju kariotipizaciju stanica iz plodove
vode ili korionskih resica. Ovi su postupci uzorkovanja
rizi~ni pa im se pripisuje stopa spontanog poba~aja od
152
0,5–1%, iako je za amniocentezu rizik vjerojatno daleko manji.31
Osim dobi trudnice koja indicira invazivne postupke
per se, u mla|im je dobnim skupinama mogu}e tradicionalnim testovima probira ukazati na one koje imaju
povi{eni rizik da nose aneuploidno dijete. To su kombinirani test koji se radi nakon 11. tjedna trudno}e (do
13+6 tjedana) s o~ekivanom stopom detekcije od 85–
90% i uz 5% la`no pozitivnih rezultata, a u drugome
tromjese~ju dvostruki ili trostruki test s osjetljivo{}u od
oko 85% i uz 5% la`no pozitivnih rezultata.32,33
Navedeni se tradicionalni testovi probira u nas savjetuju `enama mla|ima od 36 godina.34
Ipak, (sada izgleda dosanjani) san svih porodni~ara
posljednjih desetlje}a bio je trudnicama ponuditi neinvazivni postupak kojim je mogu}a prenatalna dijagnostika aneuploidija. Takav bi postupak u najboljem slu~aju zamijenio amniocentezu i biopsiju korionskih resica, a u najmanju ruku smanjio broj la`no pozitivnih
rezultata dobivenih tradicionalnim testovima probira pa
onda i zapravo nepotrebne invazivne zahvate.
I premda su dijagnosti~ke mogu}nosti koje pru`a
izvanstani~na fetalna DNK u krvi majke obuhvatile prenatalno odre|ivanje spola, RhD status i monogenetske
bolesti, tek je radom koji su 2008. godine objavili Christina Fan i sur.,35 opisuju}i kvantifikacijsku metodu za
detekciju fetalnih aneuploidija, zapo~elo razdoblje intenzivnog istra`ivanja neinvazivnih prenatalnih testova i
potom njihova klini~ka primjena.
Metoda koju je uvela Christina Fan35 temelji se na
prebrojavanju kromosoma dobivenih postupkom masivnog paralelnog sekvencioniranja ifDNK (massively parallel sequencing – MPS) iz maj~ine plazme, a bez
odvajanja fetalne i maternalne frakcije i oboga}ivanja
fetalne DNK. Metodom se generiraju deseci milijuna
sekvenci cijeloga genoma, odre|uje se, usporedbom s
referentnim kromosomima kojemu kromosomu pripadaju i potom prebrojavaju. Pojednostavljeno, ako se u
plazmi majke na|e 100 sekvenci specifi~nih za 21. kromosom, oko 90 njih je maj~ino, a 10 fetalno, no u `ene
koja nosi dijete s trisomijom 21 bit }e 105 sekvenci kromosoma 21, od toga 90 maj~inih, ali 15 fetalnih.
Biostatisti~ki algoritmi kori{teni u ovoj i naknadnim
studijama nisu mogli pouzdano otkriti druge aneuploidije osim trisomije 21.36 To je uspjelo prvo Amy Sehnert i sur.,37 potom i drugima koji su rabili metodu tzv.
normaliziranih kromosomskih vrijednosti (normalized
chromosome values – NCVs). Metoda se temelji na
~injenici da razni kromosomi imaju razli~itu proporciju
G-C parova baza (kromosom 21 ima vrlo ujedna~enu),
za razliku od A-T parova. Tako su metodom normaliziranih kromosomskih vrijednosti mogli osim trisomije
21 detektirati i trisomiju 18, trisomiju 13, monosomiju
X te trisomije 20 i 16.37,38 Sparks i sur. su nedavno razvili metodologiju sli~nu onoj koju je uvela Christina
Fan,37 tj. novi pristup – drugu generaciju masivnog paralelnog sekvencioniranja (MPS) selektivno analiziraju}i
ifDNK fragmente.39
Gynaecol Perinatol 2013;22(3):150–156
Gruji} Kora~in J., Modri} @. Izvanstani~ne nukleinske kiseline ploda u krvi majke…
Nakon 2008. godine provedeno je vi{e istra`ivanja,
ali i velikih multicentri~nih istra`ivanja koja su otvorila
put klini~koj implementaciji neinvazivnih prenatalnih
testova za aneuploidije.
U prospektivno randomizirano istra`ivanje koje su
proveli Diana Bianchi i sur. (MELISSA – MatErnal
BLood IS Source to Accurately diagnose fetal aneuploidy)38, kohortno istra`ivanje koje je vodio Glenn Palomaki40i istra`ivanje parova GhalieAshoor41 uklju~ene
su »visokorizi~ne« trudnice, tj. one koje su to prema
dobi, rezultatu tradicionalnog prenatalnog probira, ultrazvu~nog nalaza koji govori u prilog aneuploidiji ili
aneuploidiji u anamnezi. Analizirali su jednoplodne
trudno}e.
Za trisomiju 21 na|ena je osjetljivost 99,1 – 100%,
specifi~nost 99,9 – 100%, za trisomiju 18 osjetljivost je
bila 97,2 i specifi~nost 99,7 – 100%, a za trisomiju 13
osjetljivost 78,6% uz specifi~nost 99,1 – 100%.
Bianchi i sur. odre|ivali su spol, a budu}i da su analizirali sve kromosome, nai{li su i na druge aneuploidije
(trisomija 20).38
U skupini nerizi~nih trudnica Nicolaides ustanovljuje (kohortno ispitivanje 2049 trudnica u 11. – 13. tjednu
koje su bile podvrgnute rutinskome probiru na trisomiju
21 i 18) samo 0,1% la`no pozitivnih rezultata.42
Norton i sur. ustanovili su u multicentri~nom kohortnom istra`ivanju (NICE –Non-Invasive Chromosomal
Evaluation Study) uz metodu selektivnog sekvencioniranja osjetljivost za trisomiju 21 100% i stopu la`no pozitivnih rezultata 0,03%. Osjetljivost za trisomiju 18
bila je 97,4% uz 0,07% la`no pozitivnih rezultata. U
istra`ivanje NICE bilo je uklju~eno 3228 trudnica kojima je u~injena ili biopsija korionskih resica ili amniocenteza bez obzira na to jesu li u niskome ili visokome
riziku za naj~e{}e aneuploidije.43
U slu~aju la`no pozitivnih rezultata neinvazivnoga
prenatalnoga testiranja, tj. ako nalazi NIPT-a i kariotipa
dobivenoga invazivnim zahvatima nisu konzistentni,
nekoliko mogu}nosti dolazi u obzir. Mogu}e je da se
radi o mozaicizmu trofoblasta, potom potpunoj aneuploidiji ili mozaicizmu majke ili pak odumrlom aneuploidnom blizancu.5
Ipak, kako je vidljivo i iz navedenih istra`ivanja, ali i
metaanaliza, neinvazivnome prenatalnome testiranju fetalnih aneuploidija pripisuje se visoka pouzdanost.44,45
Slijedom toga su profesionalna udru`enja mogla implementirati NIPT u postupnike, tj. preporuke u vezi s
prenatalnom detekcijom naj~e{}ih aneuploidija inzistiraju}i na temeljito provedenome postupku genetskoga
savjetovanja uz informirani pristanak trudnice. Neinvazivno prenatalno testiranje mo`e se ponuditi svim trudnicama kojima tradicionalni testovi probira uka`u na
visok rizik da nose aneuploidno dijete, dakle kao sekundarni probir, a ACOG smatra da je indikacija za NIPT i
primarni probir svih visokorizi~nih trudnica.46–49
Valja se, me|utim, prije mijenjanja pristupa prenatalnom probiru na aneuploidije, suo~iti s ~injenicom da
neinvazivno prenatalno testiranje izvanstani~ne fetalne
DNK, koliko god bilo sigurno {to se ti~e trisomije 21 i
18, za ostale trisomije i kromosomalne abnormalnosti
nema tako visoku osjetljivost.Neinvazivno prenatalno
testiranje izvanstani~ne fetalne DNK jo{ je uvijek samo
probir. Pozitivan rezultat testa, a prije odluke o prekidu trudno}e, zahtijeva primjenu invazivnoga postupka
(amniocenteza) kojim se iz dobivenih stanica plodove
vode dokazuje kariotip ploda.
Ekonomske analize pokazuju zna~ajne prednosti ako
bi se NIPT uveo u sada{nji uobi~ajeni probir. Kako navodi Susan Garfield, uz NIPT bi se mogla smanjiti potreba za invazivnim postupcima u onih trudnica kojima
tradicionalni probir ukazuje na visok rizik da nose aneuploidno dijete, a budu}i da bi se smanjio broj invazivnih
zahvata i komplikacija zahvata, smanjila bi se i cijena
prenatalne skrbi.50
Neinvazivni prenatalni testovi za aneuploidije
dostupni u Republici Hrvatskoj
Dva su testa za neinvazivnu prenatalnu detekciju
aneuploidija (T21, T18 i T13) bazirana na drugoj generaciji sekvencijske tehnologije dostupna u Hrvatskoj. To
su PrenaTest® (LifeCodexx AG, Konstanz, Germany) s
CE certifikatom i Nifty test (BGI Hong Kong). Oba se
testa rade nakon 12. tjedna trudno}e i ne rade se u
blizana~kim trudno}ama. Osjetljivost ovih testova je
98–99% uz 0,2% la`no pozitivnih rezultata. Manje
strukturne aberacije kromosoma 21,18 i 13 koje rijetko
uzrokuju trisomije, ne mogu se detektirati ovim testovima.
Rezultat testa predstavlja se trudnici kao negativan
({to zna~i da se trisomija 21,18 i 13 mo`e sa sigurno{}u
isklju~iti) ili kao pozitivan ({to zna~i da plod vrlo vjerojatno ima trisomiju 21,18 ili 13). Mo`e se dijagnosticirati i spol ploda.51
Testovima je mogu}e pristupiti u vi{e privatnih zdravstvenih ustanova gdje se trudnici venepunkcijom uzima
krv koja se {alje u jedan od inozemnih laboratorija.
Rezultat testa dobije se za 10–14 dana, a test pla}a
trudnica (do 6.500,00 kn, ovisno o te~aju i vrsti testa)
Izvanstani~na fetalna DNK i mogu}nost
pretkazivanja komplikacija u trudno}i
Prema nekim istra`ivanjima, uo~ena je povezanost
koncentracije izvanstani~ne fetalne DNK i stupnja proteinurije i hipertenzije u trudnica s preeklampsijom.52
Dapa~e, pove}ana razina ifDNK prethodi po~etku
preeklampsije, otvaraju}i mogu}nost identifikacije rizi~nih trudnica.53
S druge strane, Poon i sur. nisu mogli dokazati da je
razina izvanstani~ne fetalne DNK izme|u 11 i 13 tjedana zna~ajno promijenjena u trudno}ama kompliciranim preeklampsijom, zastojem u rastu ploda ili prijevremenim poro|ajem.16 Stein i sur. nisu, odre|ivanjem
razine ifDNK u drugome tromjese~ju, na{li da je razina
ifDNK biljeg za trudno}e s komplikacijama, budu}i da
povi{ena razina ifDNK nije povezana s nepovoljnim
153
Gynaecol Perinatol 2013;22(3):150–156
Gruji} Kora~in J., Modri} @. Izvanstani~ne nukleinske kiseline ploda u krvi majke…
ishodom trudno}e u 611 ispitanica. Povi{ena razina
ifDNK nije uo~ena u trudnica s preeklampsijom, zastojem u rastu ploda i prijevremenim poro|ajem.54 Poon16
stoga dobro zaklju~uje da uspje{ni probir na aneuploidije uporabom ifDNK ne}e biti ometen u trudnica s velikim rizikom za preeklampsiju, zastojem u rastu ploda
ili prijevremenim poro|ajem.
Perspektive i izazovi
Klini~ka primjena NIPT-a uspje{na je posljednjih godina, i to {to se ti~e fetalnoga spola i X-vezanih bolesti,
RhD statusa i naj~e{}ih aneuploidija. Dijagnoza nekih
genetskih stanja i bolesti koje su odre|ene s vi{e od 300
parova baza donedavno nije bila mogu}a. Nove metode
sekvencioniranja ifDNK i novi bioinformacijski analiti~ki pristupi se, me|utim, ispituju i u blizana~kim
trudno}ama, a vrlo je velika mogu}nost da se ove tehnologije klini~ki upotrijebe i za sve aneuploidije, subkromosomalne delecije i duplikacije, monogenetske
bolesti i eventualno cijeli fetalni genom. 5,55
Zbog dostupnosti testova za prenatalno testiranje
spola medicinska zajednica mora takva testiranja omogu}iti samo u iznimnim i indiciranim slu~ajevima, upravo kakav se postupnik koristi u Europi.28 Vrlo patrijarhalne sredine jo{ uvijek vi{e cijene ro|enje mu{koga
djeteta pa nije ~udo {to je u nekim zemljama prenatalno
testiranje spola ilegalno (Kina i Indija).17 Detekcija
aneuploidija i uop}e bolesti ploda s prekidom trudno}e
kao krajnjom posljedicom dovodi porodni~are i one koji
se bave prenatalnom dijagnostikom u vrlo osjetljiv
polo`aj. Nedovoljna informiranost zbunjuje mnoge,
osobito mlade trudnice kada im samo predlo`imo da
pristupe jednom od testova probira na aneuplodije.
^esto je potrebno mnogo vremena da se trudnici, tj.
budu}im roditeljima pojasni ~emu testovi probira slu`e,
da bismo na kraju shvatili da uop}e ne znaju {to je zapravo sindrom Down. Ako se sami informiraju, slika
koju dobiju ovisi o izvoru informacija pa tzv. »balansirana« informacija mora uzeti u obzir i eti~ki, socijalni i
religijski okvir u kojemu trudnica `ivi,a posebno {to
zna~i i kakav je `ivot djeteta, ali i odrasle osobe koja
ima sindrom Down.56
Vrlo su neugodne situacije kada mladoj trudnici koja
je obavila tradicionalni prenatalni probir valja rastuma~iti {to zna~i »visokorizi~an test« i uvjeriti je da pristupi
npr. amniocentezi. Melissa Hill je, istra`uju}i preferencije trudnica i osoblja koje se bavi prenatalnom skrbi, a
u vezi s prenatalnim testovima na Downov sindrom,
ustanovila da su se trudnice nedvojbeno odlu~ile za, {to
se komplikacija, tj. spontanoga poba~aja ti~e, rani, a
siguran test kao {to je neinvazivno prenatalno testiranje
–NIPT, za razliku od osoblja koje se radije odlu~ilo za
invazivne postupke.57 Stoga valja NIPT ponuditi svima
koje su u visokome riziku da nose plod s trisomijom 21,
imaju}i na umu da za sada analiza ifDNK u komercijalnim testovima ne uspijeva ono {to je mogu}e npr.
kromosomalnom »microarray« analizom, tj. analizom
gena. Nakon takve analize koja mo`e rezultirati i informacijama koje zbunjuju trudnicu, jer ve}ina nije ~ula za
154
submikroskopske promjene kromosoma odgovorne za
tjelesne i funkcionalne abnormalnosti, geneti~ki savjet
mora biti potpun i opse`an (posebno ako je rije~ o varijantama bez sigurnoga zna~enja) i uz sna`nu emocionalnu potporu.58 Imperativ kvalitetnoga geneti~kog savjetovanja s informiranim pristankom pacijentice mora
se odnositi i na one koje pristupaju NIPT-u, posebno
stoga {to }e u perspektivi nove tehnologije omogu}iti i
nala`enje raznih polimorfizama i mutacija s razli~itom
ekspresijom bolesti.59
Uvo|enje NIPT-a u sada{nje postupnike kako bi se
smanjio broj nepotrebnih invazivnih zahvata svakako bi
bilo prihvatljivo. Na`alost, ve}ini je trudnica ovaj test u
nas nedostupan zbog cijene. Postupamo li mi koji nudimo takve testove stoga neeti~no jer si ih mogu priu{titi
samo bogatiji? Zasigurno ne, jer nam nije namjera ~initi bilo kakvu socijalnu segregaciju (ona ve} postoji).
Vardit Ravitsky, zala`u}i se za {to skorije uvo|enje
neinvazivnih prenatalnih testova, prema njemu dijagnosti~kih postupaka, smatra to eti~kim imperativom. Nije
rije~ samo o tome ho}e li `ena prekinuti trudno}u nego
o tome da `ena, tj. budu}i roditelji prihvate i pripreme
se za ro|enje djeteta s mogu}im pote{ko}ama u razvoju.60
Zaklju~ak
Mi koji se bavimo porodni{tvom (na svim razinama) trebamo ponuditi trudnicama sve {to prenatalna
dijagnostika mo`e. Vjerujemo da }e ova nova, visoko
pouzdana, a neinvazivna tehnologija pomo}u koje se
analizira izvanstani~ne fetalne nukleinske kiseline u
maj~inoj krvi (sada jo{ preskupa) u budu}nosti mo}i zamijenitii tradicionalne testove probira, ali i invazivnu
dijagnostiku.
Literatura
1. Sayres LC, Allyse M, Norton ME, Cho MK. Cell-free fetal
DNA testing: a pilot study of obstetric healthcare provider attitudes toward clinical implementation. Prenat Diagn 2011;31:
1070–6.
2. Walknowska J, Conte FA, Grumbach MM. Practical and
theoretical implications of fetal-maternal lymphocyte transfer.
Lancet 1969;1:1119–22.
3. Steele CD, Wapner RJ, Smith JB, et al.Prenatal diagnosis
using fetal cells isolated from maternal peripheral blood: a review. Clin Obstet Gynecol 1996;39:801–13.
4. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, et al. Presence of
fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997;350:
485–7.
5. Swanson A, Sehnert AJ, Bhatt S. Non-invasive prenatal
testing: Technologies, clinical assays and implementation strategies for women’s healthcare practitioners. Curr Genet Med Rep
2013;1:113–21.
6. Chan KC, Zhang J, Hui AB, et al. Size distribution of maternal and fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem 2004;50:
88–92.
7. Alberry M, Maddocks D, Jones M, et al. Free fetal DNA in
maternal plasma in anembryonic pregnancies: confirmation that
the origin is the trophoblast. Prenat. Diagn 2007;27:415–8.
Gynaecol Perinatol 2013;22(3):150–156
Gruji} Kora~in J., Modri} @. Izvanstani~ne nukleinske kiseline ploda u krvi majke…
8. Watanagara T, Metzenbauer M, Peter I, et al. Placental volume, as measured by 3-dimensional sonography and levels of
maternal plasma cell-free fetal DNA. Am J Obstet Gynecol
2005;193:496–500.
9. Birch L; English CA, O Donoghue K, et al. Accurate and
robust quantification of circulating fetal and total DNA in maternal plasma from 5 to 41 weeks of gestation. Clin Chem 2005;
51:312–20.
10. Poon LL, Leung TN, Lau TK, et al. Presence of fetal RNA
in maternal plasma. Clin Chem 2000;46:1832–4.
11. Tsui NBY, Chim SSC, Chiu RWK et al. Systematic micro-array based identification of placental mRNA in maternal
plasma: towards non-invasive prenatal gene expression profiling. J Med Genet 2004;41:461–7.
12. Bianchi DW. Circulating fetal DNA: its origin and diagnostic potential – a review. Placenta. 2004;25 Suppl A:S93–S101.
13. LoYM, Zhang J, Leung TN et al. Rapid clearance of fetal
DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet 1999;64:218–24.
14. Lo YM, Tein MS, Lau TK, et al. Quantitative analysis of
fetal DNA in maternal plasma and serum: implication for noninvasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet 1998;62:768–75.
15. Ashoor G, Poon LCY, Syngelaky A, et al. Fetal Fraction
in Maternal Plasma Cell-Free DNA at 11–13 Weeks Gestation:
Effect of Maternal and Fetal Factors. Fetal Diagn Ther 2012;
31:237–43.
16. Poon LCY, Musci T, Song K, et al. Maternal Plasma cellFree Fetal and Maternal DNA at 11–13 Weeks Gestation: Relation to Fetal and Maternal Characteristics and Pregnancy Outcomes. Fetal Diagn Ther 2013;33:215–23.
17. Sayres LC, Cho MK. Cell-Free Fetal Nucleic Acid Testing: A Review of the Technology and Its Applications. Ob Gyn
Survey 2011;66:431–42.
18. Hyett JA, Gardener G, Stojiljkovic-Mikic T, et al. Reduction in diagnostic and therapeutic interventions by non-invasive
determination of fetal sex in early pregnancy. Prenat Diagn
2005;25:1111–6.
19. Rinders RJ, van der Schoot CE, Bossers B, et al. Fetal sex
determination from maternal plasma in pregnancies at risk for
congenital adrenal hyperplasia. Obstet Gynecol 2001;98:374–8.
20. Zargari M, Sadeghi MR, Shahhosseiny MH et al. Fetal
Sex Determination using Non-Invasive Method of Cell-free Fetal DNA in Maternal Plasma of Pregnant Women During 6th10th Weeks of Gestation. Avicenna J Med Biotech 2011;3(4):
201–6.
21. Jin S, Lin XM, Law H et al. Further Improvement in
Quantifying Male Fetal DNA in Maternal Plasma. Clin Chem
2012;58(2):465–8.
22. Wright CF, Wei Y, Higgins JPT et al. Non-invasive prenatal
diagnosis test accuracy for fetal sex using cell-free DNA a review
and meta-analysis. BMC Research Notes 2012;5:476–86.
23. International Blood Group Reference Laboratory. Overview of IBCRL reference and diagnostic services. Available at:
http://ibgrl.blood.co.uk./ReferenceServices/RefServframes.
htm, pregled 24.7.2013.
24. ACOG Committee Opinion No. 360:Sex selection. Obstet
Gynecol. 2007;109:475–8. /Reaffirmed 2011./
25. Wright C. Cell-free fetal nucleic acids for non-invasive
prenatal diagnosis: report of the UK expert working group.
Cambridge, England: PHG Foundation, 2009.
26. Szczepura A, Osipenko L, Freeman K. A new fetal RHD
genotyping test: Costs and benefits of mass testing to target an-
tenatal anti-D prophylaxis in England and Wales. BMC Pregnancy and Childbirth 2011;11:5.
27. Amicucci P, Gennarelli M, Novelli G, et al. Prenatal diagnosis of myotonic dystrophy using fetal DNA obtained from maternal plasma. Clin Chem 2000;46:301–2.
28. Chiu RW, Lau TK, Cheung PT, et al. Non-invasive prenatal exclusion of congenital adrenal hyperplasia by maternal plasma analysis: a feasibility study. Clin Chem 2002;48:778–80.
29. Lun FM, Tsui NB, Chan KC, et al. Non-invasive prenatal
diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and
relative mutation dosage on DNA in maternal plasma. Proc Natl
Acad Sci USA. 2008;105:19920–5.
30. Nagaoka SI, Hassold TJ, Hunt PA. Human aneuploidy:
mechanism and new insight into an age-old problem. Nat Rev
Genet 2012;13:493–504.
31. Odibo AO, Gray DL, Dicke JM, et al. Revisiting the fetal
loss rate after second-trimester genetic amniocentesis: a single
center’s 16-year experience. Obstet Gynecol 2008;111:589–95.
32. Dey M, Sharma S, Aggarwal S. Prenatal screening methods for aneuploidies. North Am J Med Sci 2013;5:182–90.
33. Huderer-Duric K, Skrablin S, Kuvacic I, et al. The triplemarker test in predicting fetal aneuploidy: a compromise between sensitivity and specificity. Eur J Obstet Gynecol Reprod
Biol 2000;88(1):49–55.
34. Hrvatsko dru{tvo za perinatalnu medicinu Hrvatskoga lije~ni~kog zbora. Nacionalna stru~na preporuka za prenatalni
probir i dijagnostiku kromosomopatija. Gynaecol Perinatol
2010;19(2):125.
35. Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, et al. Non-invasive
diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from
maternal blood. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105:16266–71.
36. Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, et al. Non-invasive
detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal
blood: a study in a clinical setting. Am J Obstet Gynecol
2011;204:e201–e2011.
37. Sehnert AJ, Rhees B, Comstock D, et al. Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel
DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood.
Clin. Chem 2011;57:1042–9.
38. Bianchi DW, Platt LD, Goldbergh JD, et al.Genome-wide
fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing.
Obstet Gynecol 2012;119:890–901.
39. Sparks AB, Wang ET, Struble CA, et al. Selective analysis
of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy. Prenat Diagn 2012;32:3–9.
40. Palomaki GE, Deciu C, Kloza EM, et al. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy
13 as well as Down syndrome: an international collaborative
study. Genet Med 2012;119:890–901.
41. Ashoor G, Syngelaki A, Wagner M, et al. Chromosomeselective sequencing of maternal plasma cell-free DNA for firsttrimester detection of trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet
Gynecol 2012;206:322.e1–5.
42. Nicolaides KH, Syngelaki A, Ashoor G. Non-invasive prenatal testing for fetal trisomies in a routinely screened first-trimester population. Am J Obstet Gynecol 2012;207:374.e1–6.
43. Norton ME, Brar H, Weiss J, et al. Non-invasive chromosomal evaluation (NICE) study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy
18. Am J Obstet Gynecol 2012;207:137.e1–8.
155
Gynaecol Perinatol 2013;22(3):150–156
Gruji} Kora~in J., Modri} @. Izvanstani~ne nukleinske kiseline ploda u krvi majke…
44. Tounta G, Kolialexi A, Papantoniou N, et al. Non-invasive
prenatal diagnosis using cell-free fetal nucleic acids in maternal
plasma: Progress overview beyond predictive and personalized
diagnosis. EPMA Journal 2011;2:163–71.
45. Verweij EJ, van den Oever JME, de Boer MA, et al. Diagnostic accuracy of non-invasive detection of feta trisomy 21 in
maternal blood: A systematic review. Fetal Diagn Ther 2012;
31:81–6.
46. Benn P, Borrell A, Cuckle H, et al. Prenatal detection of
Down syndrome using massively parallel sequencing (MPS): a
rapid response statement from a committee on behalf of the
Board of the International Society for Prenatal Diagnosis, 24
October 2011. Prenat Diagn 2012;32:1–2.
47. Devers PL, Cronister A, Ormond KE, et al. Non-invasive
prenatal testing/non-invasive prenatal diagnosis: the position of
the National Society of Genetic Counselors. NSGC Position
Statements 2012. J Genet Couns.2013; doi: 10.1007/s10897012-9564-0.
48. American College of Obstetricians and Gynecologists.
ACOG Committee Opinion No 545, December 2012. www.
acog.org. Noninvasive Prenatal Testing for fetal Aneuploidy
49. Deutsche Gesellschaft fur Humangenetik e.v. 12.11.2012.
www.gfhev.de Stellungnahme der Deutschen Gesellschaft fur
Humangenetik (GfH) zur Analyse fetaler DNA aus dem mutterlichen Blut.
50. Garfield SS, Armstrong SO. Clinical and cost consequences of incorporating a novel non-invasive prenatal test into
the diagnostic pathway for fetal trisomies. J Managed Care Med
2012;15:34–41.
51. PrenaTest®. Information for health professionals. LifeCodexx, WM-1020-EN-002/March 2013
^lanak primljen: 08. 09. 2013.; prihva}en: 17. 11. 2013.
156
52. Sekizawa A, Farina A, Sugito Y, et al. Proteinuria and hypertension are independent factors affecting fetal DNA vaules: a
retrospective analysis of affected and unaffected patients. Clin
Chem 2004;50:221–4.
53. Zhong XY, Holzgreve W, Hahn S. The levels of circulatory cell free fetal DNA in maternal plasma are elevated prior the
onset of preeclampsia. Hypertens Pregnancy 2002;21:77–83.
54. Stein W, Muller S, Gutensohn K, et al. Cell-free fetal
DNA and adverse outcome in low risk pregnancies. Eur J Obstet
Gynecol Reprod Biol 2013,166:10–3.
55. Fan H, Quake S. In principle method for non-invasive determination of the fetal genome. Nature Precedings. 2010., dostupno na: http://dx.doi.org/10.1038/npre.2010.5373.1., pregled
24.7.2013.
56. Sheets KB, Best RG, Brasington CK, et al. Balanced information about Down syndrome: What is essential? Am J Med
Genet Part A 2011;155:1246–57.
57. Hill M, Fisher J, Chitty LS, et al. Women’s and health
professionals’ preferences for prenatal tests for Down syndrome:
a discrete choice experiment to contrast non-invasive prenatal
diagnosis with current invasive tests. Genet Med 2012;14:
905–13.
58. Bernhardt BA, Soucier D, Hanson K, et al. Women’s experiences receiving abnormal prenatal chromosomal microarray
testing results. Genet Med 2013;15:139–45.
59. Benn PA, Chapman AR. Ethical challenges in providing
non-invasive prenatal diagnosis. Curr Opin Obstet Gynecol.
2010;22:128–34.
60. Ravitsky V. Non-invasive prenatal diagnosis: an ethical
imperative. Nat Rev Genet 2009;10:73.
Adresa autora: Dr. sc. Jasenka Gruji} Kora~in, dr. med., specijalistica ginekologije i porodni{tva, Trg Ma`urani}a 3, 10000
Zagreb
© Copyright 2024 Paperzz
