Eισαγωγή στις Βασικές Τεχνικές της Μοριακής Γενετικής Π. Κόλλια Επίκουρος Καθηγήτρια, Τµήµα Βιολογίας, ΕΚΠΑ Βασικές τεχνικές των Μοριακών Βιοεπιστηµών Αποµόνωση νουκλεϊκών οξέων Περιοριστικά ένζυµα Διαχωρισµός µορίων νουκλεϊκών οξέων µε ηλεκτροφόρηση Φορείς, κλωνοποίηση Ιχνηθέτες, υβριδοποίηση Ταυτοποίηση γονιδίων: • DNA: Ανάλυση κατά Southern,Υβριδοποίηση in Situ, FISH • RNA: Στύπωµα Northern • Πρωτεΐνες: Στύπωµα Western, Ανοσοϊστοχηµεία Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης Αλληλούχιση DNA Μικροσυστοιχίες Ανάλυση Southern Υβριδοποήση Ιχνηθέτες • Ιχνηθέτης: τµήµα DNA ή RNA ποικίλλου µήκους (συνήθως 100-1000 bp) Χρησιµοποιείται σε δείγµατα DNA, RNA, κυττάρων ή ιστών για την ανίχνευση αλληλουχιών συµπληρωµατικών µε αυτόν, εποµένως, ο ιχνηθέτης υβριδοποιεί µε µονόκλωνα µόρια νουκλεϊκού οξέος (DNA ή RNA) των οποίων η αλληλουχία είναι τέτοια που να επιτρέπει το σχηµατισµό δικλώνου µέσω του ζευγαρώµατος των βάσεων. Χρήση του στυπώµατος κατά Southern Στην ταυτοποίηση γονιδίων και στη χαρτογράφηση καθώς και στην ανάπτυξη διαγνωστικών µεθόδων και τεχνικών. Για την ταυτοποίηση των γενετικά τροποποιηµένων οργανισµών το στύπωµα κατά Southern αποτελεί καθοριστικό τεστ που αποδεικνύει ότι ένα συγκεκριµένο τµήµα DNA έχει ενσωµατωθεί στο γονιδίωµα του οργανισµού- ξενιστή. Στην πρόγνωση του καρκίνου και στην προγεννητική διάγνωση. Πολυµορφισµοί τµηµάτων περιορισµού (RFLPs) • Ο Sir Alec Jeffreys ανέπτυξε την τεχνική των πολυµορφισµών τµηµάτων περιορισµού (RFLPs) Η τεχνική χρησιµοποιήθηκε ιδιαίτερα τη δεκαετία 1980 Η τεχνική των RFLP ήταν η πρώτη που επέτρεψε τη µοριακή γενετική ανάλυση του DNA. RFLPs H τεχνική των RFLPs περιλαµβάνει Πέψη των δειγµάτων DNA µε ένα ένζυµο περιορισµού το οποίο αναγνωρίζει µια συγκεκριµένη αλληλουχία DNA και την κόβει. Τα τµήµατα DNA που προκύπτουν από την πέψη διαχωρίζονται µε ηλεκτροφόρηση σε ένα πήκτωµα αγαρόζης Και στη συνέχεια µεταφέρονται σε µια µεµβράνη (στύπωµα κατά Southern). Η πρόοδος της µοριακής βιολογίας από την τεχνική RFLP στην PCR H αποµόνωση αρκετής ποσότητας DNA προκειµένου να χρησιµοποιηθεί στην τεχνική RFLP είναι χρονοβόρος και κοπιαστική. Η P C R χ ρ η σ ι µ ο π ο ι ε ί τ α ι γ ι α τ η ν ε ν ί σ χ υ σ η (πολλαπλασιασµό) µικρών ποσοτήτων DNA. Σε 2-3 ώρες, έχει συντεθεί η ποσότητα που απαιτείται για την RFLP Εποµένως, Περισσότερα δείγµατα και περιοχές αναλύονται σε µικρότερο χρόνο, Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης Polymerase Chain Reaction (PCR) Υβριδοποίηση in situ (ISH) • Εντοπισµός ειδικών αλληλουχιών DNA / RNA σε κύτταρα/ιστούς • Μόρια DNA / RNA ως ιχνηθέτες • Όταν οι ιχνηθέτες είναι φθορίζοντα µόρια: FISH Υβριδοποίηση in situ (ISH) Kυρίως για χρωµοσωµικές µετατοπίσεις Ανίχνευση CMV, HSV, VZV Υπότυποι του papilloma Ανίχνευση: Mycobacteria, µύκητες και άλλα παράσιτα Ανίχνευση Helicobacter pylori από βιοψίες γαστρεντερικού Legionella pneumophila Pneumocystis jiroveci Σε τοµές παραφίνης ή κρυοτοµές Αλληλούχιση DNA PCR σε συνδυασµό µε την µέθοδο Sanger (τερµατισµού αλυσίδας) Κάθε αντίδραση περιέχει µήτρα, εκκινητή, πολυµεράση, τα τέσσερα δεοξυνουκλεοτίδια και ένα διδεόξυνουκλεοτίδιο Τέσσερις αντιδράσεις- µια για κάθε βάσηδιδεόξυνουκλεοτίδιο Η ε π ι µ ή κ υ ν σ η τ ε λ ε ι ώ ν ε ι ό τ α ν έ ν α διδεόξυνουκλεοτίδιο ενσωµατωθεί στο DNA. Tα προϊόντα ηλεκτροφορούνται σε πήκτωµα πολυακρυλαµίδης µε διακριτικότητα µιας βάσης Ένα δείγµα τεσσάρων αντιδράσεων φορτώνεται στο πήκτωµα µε συγκεκριµένη σειρά A, T, C, & G Fig 16-18 Αλληλούχιση DNA Fig 16-18 Αλληλούχιση DNA • Α υ τ ο ρ α δ ι ο γ ρ ά φ η µ α µ ε τ ά α π ό αλληλούχιση (µη αυτοµατοποιηµένη) κατά Sanger • Κ ά θ ε λ ω ρ ί δ α π ε ρ ι λ α µ β ά ν ε ι µ ι α αντίδραση στην οποία έχει προστεθεί µόνο ένα δι-δεοξυριβονουκλεοτίδιο. • A-G-C-T • Η αλληλουχία έχει... (από κάτω προς τα πάνω- επέκταση εκκινητή) CCTACAGGAGG CTTTATGACTTAT..... Σύστηµα αυτόµατης αλληλούχισης DNA Μικροσυστοιχίες • Παλαιότερα: Ανάλυση ενός γονιδίου • Τώρα: χιλιάδες γονίδια ταυτόχρονα Γονιδιακή έκφραση Σχέση µε ανάπτυξη ασθενειών Αλληλεπιδράσεις γονιδίων Γονίδια µε κοινή ρύθµιση Ρυθµιστικά κυκλώµατα Μικροσυστοιχίες From: Shin-Mu Tseng [email protected] Μικροσυστοιχίες • Δείγµα από συγκεκριµένο όργανο/ιστό ανάλυση των γονιδίων που εκφράζονται σε αυτό. • Σύγκριση δειγµάτων από υγιή και ασθενή άτοµα συσχέτιση γονιδίων µε την ασθένεια. • Οι ιχνηθέτες µπορεί να είναι και οµάδες παθογόνων για την ανίχνευση µολυσµατικών παραγόντων.
© Copyright 2024 Paperzz
