Σχεδιασµός Εκκινητών Ελντέµ Σαδίκογλου, MSc Εργαστήριο Mοριακής Βιολογίας Ανάπτυξης και Μοριακής Νευροβιολογίας Τµήµα Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής Δηµοκρίτειο Πανεπιστήµιο Θράκης PCR & Εκκινητές ➔  Η PCR είναι µια απλή µέθοδος η οποία έχει συµβάλει αποφασιστικά στην πρόοδο των βιοεπιστηµών στον ερευνητικό τοµέα αλλά και στο τοµέα των εφαρµογών. ➔  Οι εφαρµογές της PCR αυξάνονται συνεχώς και αποτελεί πλέον µια απαραίτητη µέθοδο για ένα µεγάλο αριθµό επιστηµονικών πεδίων όπως π.χ : •  Μοριακή βιολογία •  Μικροβιολογία •  Γενετική •  Κλινική διαγνωστική •  Εγκληµατολογία •  Επιστήµες του περιβάλλοντος •  Κληρονοµικές µελέτες •  Τεστ πατρότητας PCR & Εκκινητές ➔  Η Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction) είναι µια µέθοδος που χρησιµοποιείται για τον πολλαπλασιασµό ενός συγκεκριµένου τµήµατος DNA in vitro. ➔  Μια τυπική αντίδραση PCR περιέχει τα παρακάτω συστατικά: •  Μήτρα DNA •  Εκκινητές •  Taq πολυµεράση •  dNTPs •  MgCl2 •  Ρυθµιστικό διάλυµα PCR & Εκκινητές ➔  Παρότι χρησιµοποιούνται εµπορικά διαθέσιµα υλικά υψηλής ποιότητας (η Taq DNA πολυµεράση, τα dNTPs και τα διαλύµατα), η PCR µερικές φορές αποτυγχάνει. ➔  Υποθέτοντας ότι όλα τα αντιδραστήρια έχουν προστεθεί στις κατάλληλες συγκεντρώσεις, δύο πολύ σηµαντικοί παράγοντες της PCR πρέπει να καθοριστούν από τον ερευνητή: •  Το νουκλεϊκό οξύ που χρησιµοποιείται ως µήτρα, το οποίο πρέπει να είναι συγκεκριµένης ποιότητας. •  Οι εκκινητές: Η διαδικασία επιλογής της αλληλουχίας των εκκινητών είναι ιδιαίτερα σηµαντική για την επιτυχία της PCR. Χωρίς κατάλληλους, λειτουργικούς εκκινητές δεν θα υπάξει προϊόν της PCR. Τι είναι οι Εκκινητές ➔  Οι εκκινητές είναι µικρές συνθετικές ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες που σχεδιάζονται βάσει της αλληλουχίας της περιοχής που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί. ➔  Είναι ζευγάρι στη περίπτωση των αντιδράσεων της PCR, ένας εµπρόσθιος και ένας ανάστροφος εκκινητής. Στη δε περίπτωση της αλληλούχισης µπορεί να είναι µόνο ο εµπρόσθιος ή ο ανάστροφος εκκινητής. ➔  Μετά το βήµα της αποδιάταξης του DNA και την µείωση της θερµοκρασίας οι εκκινητές προσδένονται στις δυο αλυσίδες του DNΑ. ➔  Αποτελούν το σηµείο έναρξης για τη λειτουργία της πολυµεράσης. ➔  Οι εκκινητές ορίζουν τη περιοχή της µήτρας που θα ενισχυθεί (αλληλουχία συµπληρωµατική µε τις ακραίες περιοχές της περιοχής που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί). Τι είναι οι Εκκινητές Υβριδοποίηση του εκκινητή στη συµπληρωµατική του αλληλουχία πάνω στη µήτρα Σχεδιασµός Εκκινητών Σηµαντικοί παράµετροι που πρέπει να ληφθούν υπ'όψη: 1. Μοναδικότητα 2. Μήκος Ειδικότητα: προσδένεται αποκλειστικά και µόνο στο στόχο 3. Σταθερότητα στο 3’ & 5’ 4. Σύσταση βάσεων 5. Θερµοκρασία τήξης 6. Θερµοκρασία υβριδοποίησης 7. Εσωτερική δοµή 8. Συµπληρωµατικότητα →  Σταθερότητα: σχηµατίζει σταθερούς δεσµούς µε τη µήτρα Συµβατότητα: οι δυο εκκινητές πρέπει να δουλεύουν στις ίδιες συνθήκες Σχεδιασµός Εκκινητών 1.  Μοναδικότητα: Για κάθε ζεύγος εκκινητών πρέπει να υπάρχει αποκλειστικά ένας στόχος στη µήτρα του DNA. Επίσης δεν πρέπει να υπάρχει στόχος για τους εκκινητές πάνω σε µόρια πιθανής επιµόλυνσης από άλλες πηγές όπως DNA ανθρώπου, αρουραίου κ.λ.π. 2.  Μήκος: το µήκος των εκκινητών επιδρά τόσο στη µοναδικότητα τους όσο και στη θερµοκρασία τήξης/υβριδοποίησης τους. •  Όσο αυξάνεται το µήκος του εκκινητή τόσο αυξάνεται η πιθανότητα να υβριδοποιεί µόνο µε το στόχο, ενώ επίση αυξάνονται οι θερµοκρασίες τήξης/υβριδοποίησης. •  Συνήθως οι εκκινητές έχουν µήκος 17 µε 35 ζεύγη βάσεων. Σχεδιασµός Εκκινητών 3.  Σταθερότητα: η επιµύκηνση από τη Taq πολυµεράση ξεκινά όταν η αλληλουχία στο 3’ άκρο του εκκινητή υβριδοποιηθεί σταθερά στη µήτρα DNA •  Αν το στο 3’ άκρο του εκκινητή εντοπίζονται τρείς ή παραπάνω βάσεις C/G µπορεί να προσδεθεί σταθερά σχεδόν σε όλες τις περιοχές της µήτρας µε τρεις συµπληρωµατικές βάσεις G/C. •  Για την αποφυγή υβριδοποίησης σε πολλαπλά ή σε λανθασµένα σηµεία λόγω πρόσδεσης του 3’ άκρου του εκκινητή, συνήθως στο σχεδιασµό προτιµώνται πολύ σταθερά 5’ άκρα και λιγότερα σταθερά 3’άκρα. •  Προτιµώνται 5’ άκρα µε µία ή δυο βάσεις G/C, και 3’ άκρα µε µία ή και καµία βάση G/C. Σχεδιασµός Εκκινητών 4. Σύσταση βάσεων: επηρεάζει την υβριδοποίηση, τη θερµοκρασία τήξης/ πρόσδεσης και τη σταθερότητα. •  Προτιµώνται οι αλληλουχίες τυχαίας σύστασης. •  Αποφεύγονται οι περιοχές πλούσιες σε A+T είτε σε G+C •  Προτιµάται µέση περιεκτικότητα σε G+C, περίπου 50-60% απαιτούνται ιδανικές θερµοκρασίες τήξης/πρόσδεσης και υβριδοποίησης. Σχεδιασµός Εκκινητών 5.  Θερµοκρασία Τήξης (Tm): είναι η θερµοκρασία κατά την οποία το 50% των µορίων του DNA είναι δίκλωνα µόρια. •  Εξαρτάται κυρίως από τη σύσταση της αλληλουχίας του DNA. Υψηλότερη περιεκτικότητα σε G+C έχει ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό περισσοτέρων δεσµών Η2 άρα υψηλότερο Tm. •  Απλή µέθοδος υπολογισµού Tm για ≤ ολιγονουκλεοτίδια 20 βάσεις : Tm=(A+T)x2oC+(G+C)x4oC •  Υπάρχουν και άλλες πιο ακριβείς µέθοδοι υπολογισµού. Σχεδιασµός Εκκινητών 6.  Θερµοκρασία υβριδοποίησης Ta: είναι η θερµοκρασία κατά την οποία οι εκκινητές προσδένονται στη µήτρα του DNA. Μπορεί να υπολογισθεί από το Tm. •  T a = T m ε κ κ ι ν η τ ή - 4 o C Ta=0.3xTmεκκινητή+0.7xTmπροϊόντος-14.9 •  Για την υβριδοποίηση των εκκινητών στη µήτρα του DNA πρίν την επαναδιάταξη των δυο αλυσίδων της µήτρας πρέπει: Tm προϊόντος-Tυβριδοποίησης > των 30oC Σχεδιασµός Εκκινητών 7.  Εσωτερικές δοµές: η απόδοση της αντίδρασης PCR µειώνεται δραµατικά στις περιπτώσεις που οι εκκινητές υβριδοποιούνται µεταξύ τους και σχηµατίζουν δοµές φουρκέτας ή οµοδιµερίζονται. Φουρκέτα Οµο-διµερές → Οι παραπάνω δευτεροταγείς δοµές πρέπει να αποφεύγονται Σχεδιασμός Εκκινητών 8.  Συµπληρωµατικότητα: Ο εµπρόσθιος και ο ανάστροφος εκκινητής πρέπει να είναι κατάλληλα σχεδιασµένοι ώστε να λειτουργούν στις ίδιες συνθήκες. → Τα ζεύγη των εκκινητών πρέπει να έχουν παρόµοιες θερµοκρασίες τήξης και οι Tm των δυο εκκινητών δεν πρέπει να διαφέρουν παραπάνω από 3-5 oC. →  Εκκινητής µε Tm υψηλότερη από τη θερµοκρασία υβριδοποίησης της αντίδρασης µπορεί να προσδεθεί µη ειδικά και να ενισχύσει λάθος περιοχή της αλληλουχίας του DNA. →  Εκινητής µε Tm χαµηλότερη από τη θερµοκρασία υβριδοποίησης της αντίδρασης µπορεί να µην προσδεθεί καθόλου και να µην αποδώσει προϊόν PCR. Σχεδιασµός Εκκινητών - Εργαλεία Ο σχεδιασµός και η επιλογή της αλληλουχίας των εκκινητών είναι αρκετά πολύπλοκος και ως εκ τούτου πραγµατοποιείται σχεδόν πάντα µέσω υπολογιστικών προγραµµάτων. Όλες οι παραπάνω παράµετροι είναι καθορισµένες και κωδικοποιηµένες τόσο σε εντολές προγραµµάτων on-line όσο και σε λογισµικά υπολογιστών. A. Εργαλεία προγραµµάτων •  Primer3: www primer tool http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi •  GeneFisher – Interactive PCR Primer Design http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/ •  Primer3Plus http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi •  OligoCalc : http://www.basic.northwestern.edu/biotools/OligoCalc.html Σχεδιασµός Εκκινητών-Εργαλεία •  NCBI Primer BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ Σχεδιασµός Εκκινητών Σχεδιασµός Εκκινητών B. Υπάρχουν επίσης και εµπορικά διαθέσιµα λογισµικά υπολογιστών για το σχεδιασµό εκκινητών. •  Oligo.net http://www.oligo.net/ •  Beacon Designer™ http://www.premierbiosoft.com/molecular_beacons/index.html •  ORFprimer http://www.proteinstrukturfabrik.de/ORFprimer/ Σχεδιασµός Εκκινητών µε το AmplifX http://ifrjr.nord.univ-mrs.fr/AmplifX Το κύριο παράθυρο του AmplifX είναι οργανωµένο σε τρείς καρτέλες: ➔  Στη καρτέλα Αλληλουχία (Sequence) µεταφέρεται η αλληλουχία-στόχος. •  Μπορεί κανείς να επικολλήσει την αλληλουχία-στόχο πάνω στην οποία θέλει να διερευνήσει την ύπαρξη συγκεκριµένων εκκινητών ή να σχεδιάσει εκ νέου εκκινητές •  Κατά την επικόλληση το AmplifX δεν αναγνωρίζει χαρακτήρες πέραν των: "A, T/U, C, G,”. •  Δεν διατηρεί τα εκφυλισµένα νουκλεοτίδια •  Ανανγνωρίζει άλλες µορφές φακέλων, όπως: ‘DNA Strider’, ‘GeneBank’, ‘Fasta’ Σχεδιασµός Εκκινητών µε το AmplifX http://ifrjr.nord.univ-mrs.fr/AmplifX ➔  Καρτέλα Αλληλουχία Σχεδιασµός Εκκινητών µε το AmplifX http://ifrjr.nord.univ-mrs.fr/AmplifX ➔  Η καρτέλα “Λίστα Εκκινητών” περιέχει τη λίστα των εκκινητών και συνδέεται µε το κύριο µενού των Εκκινητών. •  Για την εισαγωγή λίστας εκκινητών, χρησιµοποιείται το µενού των εκκινητών. Οποιοδήποτε αρχείο εισάγεται σε µορφή text •  Το αρχείο πρέπει να έχει προετοιµαστεί ανα στήλες µε τις αλληλουχίες, τα ονόµατα και τη περιγραφή των εκκινητών, σε Excel ή FileMaker. •  Επίσης υπαρχεί δυνατότητα εισαγωγής εκ νέου, αλληλουχίας εκκινητή σχηµατίζοντας ένα άδειο κελί µε το µενού “Add a new primer”. Σχεδιασµός Εκκινητών µε το AmplifX http://ifrjr.nord.univ-mrs.fr/AmplifX ➔  Πέραν της ανάλυσης των αλληλουχίων υφιστάµενων εκκινητών, όλες οι µεταγενέστερες εκδόσεις του AmplifX µετά την 1.1 παρέχουν τη δυνατότητα σχεδιασµού εκκινητών. •  Έναρξη από το µενού"Primers" - > "Design primers". •  Σε καινούριο παράθυρο ρυθµίζονται οι παράµετροι των εκκινητών (το µήκος, η διαφορά τωνTm, το ελάχιστο της ποιότητας κ.λ.π.) •  Οι παράµετροι της ποιότητας ρυθµίζονται από το µενού “Preferences” •  Επιλέγεται η περιοχή αναζήτησης και το µήκος του προϊόντος της PCR. •  Μετά την ολοκλήρωση της αναζήτησης οι εκκινητές µε διπλό κλίκ µεταφέρονται στη λίστα των εκκινητών.   τηρήστε µικρές περιοχές αναζήτησης (100-200 βάσεις)   ξεκινήστε µε υψηλή ποιότητα ( ~90). Εάν δεν βρεθούν κατάλληλοι εκκινητές συνεχίστε µειώνοντας. Σχεδιασµός Εκκινητών µε το AmplifX http://ifrjr.nord.univ-mrs.fr/AmplifX Σχεδιασµός Εκκινητών µε το AmplifX http://ifrjr.nord.univ-mrs.fr/AmplifX Ποιότητα: υπολογίζεται µε βάση διάφορα χαρακτηριστικά όπως: •  Η πολυπλοκότητα της αλληλουχίας (πολυX και επαναλήψεις τριπλέτας) •  Η σταθερότητα στο 3’ άκρο του εκκινητή και ο βαθµός οµοδιµερισµού •  Η θερµοκρασία Tm των εκκινητών •  Η περιεκτικότητα σε GC Η ποιότητα των εκκινητών κυµαίνεται µεταξύ του 100-0 Σχεδιασµός Εκκινητών µε το AmplifX http://ifrjr.nord.univ-mrs.fr/AmplifX Η θερµοκρασία ‘Tm’ των εκκινητών υπολογίζεται µε τρείς διαφορετικές µεθόδους: •  1η µέθοδος: η πιο απλή και κατά προσέγγιση Tm=81.5+0.41*GC-675/N •  2η µέθοδος: συνυπολογίζει τη συγκέντρωση της αλατότητας της αντίδρασης PCR Tm = 81.5 +16.6 X log10([Na+]+[K+])+0.41 x(%GC) - 675/N •  3η µέθοδος: είναι η πιο ακριβής "bases stacking method" Tm=dH/(dS+0.368xNxln[Na+]+ R x ln[Primer]/4) with R=1.987 Σύνθεσης Εκκινητών ➔  Η αποτελεσµατικότητα της σύνθεσης ολιγονουκλεοτιδίων είναι 98%. ➔  Σε κάθε κύκλο προσθήκης βάσης µόνο στο 98% των ολιγονουκλεοτιδίων θα προστεθεί η συγκεκριµένη βάση. ➔  Με την αύξηση του µεγέθους των ολιγονουκλεοτιδίων αυξάνονται και οι πιθανότητες να απουσιάζει κάποια βάση. ➔  Είναι ιδιαίτερα σηµαντικό στην περίπτωση της µεταλλαξιγένεσης ή της αντιδράσης κλωνοποίησης. ➔  Καθαρισµός µε HPLC ή PAGE σε κάποιες περιπτώσεις. Μήκος ολιγονουκλεοτιδίου Ποσοστό σωστής αλληλουχίας 10 βάσεις (0.98)10 = 81.7% 20 βάσεις (0.98)20 = 66.7% 30 βάσεις (0.98)30 = 54.6% 40 βάσεις (0.98)40 = 44.6%