lezione 15b

Identificazione dei geni
che causano malattia nell’uomo II
(importante sapere BENE mappatura fisica e genetica)
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Capitolo 16
1
Strategia posizionale
CLONAGGIO FUNZIONALE: le basi biochimiche della patogenesi sono note. Utile
in pochi casi
Strategia POSIZIONALE: si conosce solo la
localizzazione cromosomica del locus. Richiede la
costruzione di una mappa fisica e genetica della regione.
Lo scopo e’ definire una regione candidata il
piu’ limitata possibile
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2
Clonaggio posizionale
 CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo
la localizzazione cromosomica del locus. Richiede
la costruzione di una mappa fisica e genetica della
regione. Lo scopo e’ definire una regione candidata
il piu’ limitata possibile
  Definizione della regione candidata con analisi di linkage: ricostruzione degli aplotipi
studiando la segregazione nelle famiglie
  Anomalie cromosomiche: ricerca del coinvolgimento di una stessa regione in affetti
con lo stesso fenotipo
 
C o re a d i H u n t i n g t o n , d i s t ro f i a d i D u c h e n n e , f i b ro s i
cistica,neurofibromatosi, cancro colon-rettale.
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Identificazione posizionale: un bel labirinto
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Definire la regione piu’ piccola possibile!!!!
5
Linkage possibili inconvenienti ... vedi lezione
mappatura genetica
 Ci possono essere inconvenienti che complicano la possibilita’ di assegnare un locus
malattia a una regione definita da marcatori:
 Errori umani: errata lettura dei dati, scambio di campioni, paternita’……
 Errori diagnostici: un falso ricombinante.Se i marcatori sono molti e vicini
la presenza di un doppio ricombinante fa sospettare un errore
  Eterogeneita’ genetica: famiglie con fenotipo simile vengono accorpate e non si
riesce a trovare il linkage. Sclerosi tuberosa: due loci distinti.
Nelle recessive il problema e’ la necessita’ di utilizzare solo le famiglie piccole.
 E’ importante disporre di numerosi siti polimorfici e con un alto
grado di polimorfismo per poter costruire l’aplotipo di una famiglia
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Linkage: Malattia dominante della pelle (DarierWhite)
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Geni nella regione candidata
Quale scegliere?
1.  Espressione appropriata
2.  Funzione appropriata
3.  Omologie e relazioni funzionali
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Come si procede dopo?
 L’analisi dei ricombinanti e la mappatura genetica porta ad
individuare una regine genomica piuttosto ampia, per questo
motivo si “cercano” riarrangiamenti cromosomici che possano
essere CAUSALI della patologia in esame.
 Le anomalie cromosomiche possono a volte fornire uno
strumento per l’identificazione di geni-malattia alternativo al
linkage in particolare per le condizioni sporadiche dove
rappresentano l’unico modo per arrivare al gene candidato.
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Perche’ le mutazioni cromosomiche?
(traslocazioni, inversioni e delezioni)
 Le
mutazioni cromosomiche possono fornire indicazioni per la
localizzazione fisica di un gene. Se la presenza di un riarrangiamento si
associa ad un fenotipo patologico ci sono due possibili spiegazioni:
Il riarrangiamento non e’ bilanciato: c’e’ perdita o acquisizione di
materiale
Uno dei punti di rottura e’ causa del fenotipo patologico (le traslocazioni
nei tumori sono state fondamentali per lo studio dei geni coinvolti nella
tumorigenesi)
ATTENZIONE alla coincidenza e’ casuale
Molti geni patologici sono stati identificati grazie alle alterazioni
cromosomiche trovate in pazienti affetti
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I primi dieci anni di strategie di tipo posizionale
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Perche’ le mutazioni cromosomiche?
Una rottura cromosomica puo’ causare un fenotipo da perdita di
funzione se:
1. Distrugge la sequenza codificante di un gene
2. Distrugge la sequenza regolatoria
Una rottura cromosomica puo’ causare un fenotipo da acquisizione di
funzione se:
1. Assemblando regioni codificanti di geni diversi
2. Spostando il gene in regioni di cromatina “attiva”
Il punto di rottura (breakpoint) fornisce un’indicazione preziosa
sull’esatta localizzazione del gene implicato nella patologia.
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Walking chromosome per identificare il
punto di rottura di una traslocazione
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La FISH per identificare i breakpoint (molto usato nell’analisi
dei riarrangimenti cromosomici causali dei tumori)
A B
C D
16cen
23
22
D
13.3
11.2
12
13
21.1
13.1
11.2
11.2
12.1
13
21
22
23
24
21.3
22
C1 C1
D
24.3
der(8)
8, der(8)
A1
B
8, der(8)
B1
16,der(16)
C
8, der(8)
C1
D
8, der8
der(16)
16,der(8)
der(16)
D1
16,der(8)
E
8,der(16)
E1
16,der(8)
F
8,der(16)
F1
16,der(8)
G
8,der(16)
G1
16,der(8)
der(16)
der(8)
cen
16
der(16)
8p22
A B
16,der(16)
cromosoma16
cromosoma 8
cen
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16qter
A
12
8
F G
A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1
12
11.2
23
24.1
E
16q23
C1
D
21
8pter
8p22
8cen
16q23
C DC1 E1 F1 G1
16q23
8p22
A1 B1 C1D E F G
pter
qter
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Le delezioni
Oggi ci si concentra sulle microdelezioni, invisibili al microsocpio, ma
identificabili con le metodiche molecolari. Le microdelezioni sono
comunque nell’ordine di centinaia di chilobasi e possono essere originate
dalla presenza di sequenze ripetute che mediano riarrangiamenti genomici.
Se sono molto ampie: visibili al microscopio possono essere il punto di
partenza per identificare una regione candidata: PWS/AS, Cat eye. La
perdita di una regione ampia genera un fenotipo complesso, in cui poi
bisogna identificare la regione minima di interesse.
Le microduplicazioni dovrebbero essere ugualmente frequenti ma in
realta’ si osservano raramente. Spesso si osservano fenotipi associati a
microdup dovuti a rottura di geni in punti duplicati!
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Le delezioni come si identificano?
Mancata trasmissione di alleli marcatori
Analisi del dosaggio mediante PCR (quantitativa)
Mappaggio mediante FISH
Mappaggio di restrizione basato sull’ibridazione (PFGE)
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Le delezioni come si identificano?
Mancata trasmissione di alleli marcatori
eterozigote DELETO
A
A
B
C
D
eterozigote
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D
D
eterozigote
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Le delezioni come si identificano?
Mancata trasmissione di alleli marcatori
Analisi del dosaggio mediante PCR (quantitativa).
si puo’ fare mediante real-time PCR
DELETO
normale
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Le delezioni come si identificano?
Mancata trasmissione di alleli marcatori
Analisi del dosaggio mediante PCR (quantitativa)
Mappaggio mediante FISH
NORMALE
DELETO
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DELETO
NORMALE
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L’ibridazione genomica comparativa permette la ricerca
sistematica di microdelezioni e microduplicazioni
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Distrofia muscolare di Duchenne
(note l’ereditarieta’ recessiva X-linked)
una patologia letale relativemente frequente fra i maschi nati vivi (1:3500)
 Nel 1982 venne identificato il primo RFLP associato al locus DMD in
Xp21. Nel giro di poco tempo altri RFLP permisero di eseguire il gene
tracking. Non si trovarono pero’ polimorfismi con ricombinazione inferiore
al 5%.
 Nel 1985 la mappa della regione era stata in parte ricostruita mediante
mappatura genetica
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DMD e le traslocazioni X/autosomi
 Nel frattempo si erano raccolti i DNA di circa 20 ragazze affette da
DMD che presentavano traslocazioni X/autosomi.
 Tutte presentavano il breakpoint sulla X in Xp21 ed erano casi
sporadici.
 L’ipotesi era che il riarrangiamento avesse rotto il gene DMD e che
per effetto dell’inattivazione preferenziale del cromosoma X normale,
venisse manifestato il fenotipo Duchenne
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DMD ed inattivazione del cromosoma X
due copie Xp attive
parte autosoma inativa
gene DMD attivo
morte della cellula
DMD
Inattivazione
casuale dell’X
X X/A
A/X A
un cromosoma X attivo
due autosomi attivi
gene DMD non funzionante
Affetta da DMD
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DMD ed il caso XJ
1985 A Toronto un gruppo di ricercatori (Worton) utilizzando il DNA di
una donna DMD portatrice di una traslocazione X/21, riusci’ a clonare il
breakpoint, e individuo’ una serie di cloni (XJ) che, oltre ad essere
polimorfici, evidenziavano delezioni in alcuni pazienti DMD.
rDNA
rDNA
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DMD?
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Distrofia muscolare di Duchenne ed il
clonaggio per sottrazione
Approccio localizzando il punto di rottura di una
traslocazione, essenziale la scoperta di femmine affette
portatrici di traslocazione X-21
Approccio mediante clonaggio per sottrazione, essenziali per
questo approccio le delezioni
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DMD- Clonaggio per sottrazione
1986 A Boston il gruppo di Kunkel utilizzando il DNA di un paziente, BB,
portatore di un delezione citogenetica ed affettoda DMD, retinite pigmentosa,
ritardo mentale e malattia granulomatosa cronica riesce a clonare il gene DMD.
  La loro strategia si baso’ sul clonaggio per sottrazione: il paziente era deleto
per una grossa regione genomica, il suo DNA fatto riassociare con DNA normale
avrebbe lasciato in soluzione le sequenze normali non presenti nel DNA deleto.
 
Con quei cloni fu testata una libreria di cDNA di muscolo e vennero
clonaticirca 8 cDNA che, testati sui pazienti, misero in evidenza delezioni.
Lo zoo-blot confermo’ trattarsi di un gene conservato, la sequenza evidenzio’
nei pazienti mutazioni puntiformi di varia natura.
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Clonaggio per sottrazione
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Clonaggio per sottrazione
clonaggio
clonaggio
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Struttura della proteina distrofina
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DMD-Duchene e Becker
La distrofia di Becker in che relazione e’ con DMD?
Dall’analisi
alleliche
di linkage era gia’ emerso che avrebbero potuto essere
Dopo il clonaggio del gene DMD le stesse sonde sono state
testate sui pazienti affetti da BMD: sono evidenti delezioni e
mutazioni puntiformi. tutte le evidenze sperimentali confermano
che il locus e’ lo stesso.
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Distrofia muscolare di Becker e Duchenne
La distrofia di Becker in che relazione e’ con DMD?
Non e’ stato possibile individuare una regione critica specifica per le due forme.
Lo studio a livello di proteina ha evidenziato che in BMD la distrofina e’ sempre
presente anche se piu’ corta o in minore quantita’
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SRY e le anomalie cromosomiche
 Lo studio dei riarrangiamenti cromosomici restrinse la mappatura al
braccio corto del cromosoma Y e ha permesso di identificare SRY.
46,XY
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46,XYdel(q)
Maschio
46,XtXp/Yq
Femmina
46,XtXp/Yp
Maschio
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Clonaggio del gene CFTR
Per il clonaggio del gene della CF è stato sfruttato il linkage disequilibrium. Nel 1985 fu
dimostrato che il gene della CF era associato con il gene della paraossonasi, mappato sul
cromosoma 7.
AB
AC
CD
AC
Inizialmente furono identificati 2 marcatori, MET e D7S8, a monte e a valle del gene CFTR, che
distavano fra loro ~1600 kb.
Mediante mappaggio genetico furono identificati altri 2 marcatori (KM19 e XV2.c) che distavano
solo 500 bp.
Il gene per la fibrosi cistica (CF) è stato infine mappato in 7q31-q32.
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LINKAGE DISEQUILIBRIUM
Quando due alleli, di due loci associati, tendono ad essere
ereditati insieme con una frequenza superiore a quella attesa
sulla base delle singole frequenze di quei specifici alleli, tali alleli
si dicono in linkage disequilibrium.
L’identificazione di marcatori in forte linkage disequilibrium
all’interno della regione candidata consente di restringere
ulteriormente il campo di indagine.
Spesso trovare un marcatore in disequilibrium con il
locus responsabile della malattia indica aver trovato
il gene responsabile della stessa
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Il linkage disequilibrium si può spiegare con l’effetto fondatore: viene mantenuta la
stessa posizione degli alleli presente al momento in cui è avvenuta la mutazione sul
cromosoma ancestrale.
A1
N B1
A2
N B2
mutazione ancestrale (N -> CF)
A1
CF B1
A2
N B2
I loci CF e A sono distanti; alta
freq. di ricomb tra CF e A
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I loci CF e B sono
vicini; bassa freq. di
ricomb tra CF e B
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Dopo molte generazioni ci si attende questa situazione:
Linkage
equilibrio
tra A e CF
(CF può
trovarsi
sia in coupling
con A1
che con A2)
50% CF-A1
50% CF-A2
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A1
CF B1
A2
N B2
A2
CF B1
A1
N B2
Linkage disequilibrio
tra B1 e CF (CF si trova
sempre e solo in coupling
con B1)
100% CF-B1
Grazie al LD la regione in analisi fu ristretta, ma il gene resposnsabile
della patologia fu trovato difficilmente. Se c’e’ LD allora i cromosomi
mutanti condivideranno granparte della seq mutante derivata da un
ancestrale ... quale e’ quindi il reale rensabile in tutta lre gione in
disequilibrium?
La stessa DF508 (eterozigosi 3-4% popolazione) poteva essere in
semplice disequilibrium!
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Il gene responsabile della fibrosi cistica (CFTR)
La fibrosi cistica è una malattia monogenica autosomica recessiva. E’ una delle
malattie ereditarie più comuni nella popolazione caucasica. Nel Regno Unito la
frequenza della CF e’ 1/2000, valore molto alto soprattutto se si considera il normale (basso)
tasso di mutazione del gene. come mai???
VANTAGGIO ETEROZIGOTE
E’ causata da una mutazione nel gene CFTR (regolatore della conduttanza
transmembrana della fibrosi cistica) che codifica per un canale ionico
responsabile dell’esportazione degli ioni cloruro attraverso la membrana
plasmatica delle cellule epiteliali che tappezzano le vie respiratorie polmonari.
CFTR mantiene l’idratazione delle vie aeree attraverso l’escrezione di cloro ed
il blocco dell’ingresso del sodio. La sua mutazione provoca la formazione di
secrezioni viscose che impediscono le normali attività di peptidi antimicrobici
e generano un ambiente idoneo alla crescita di organismi patogeni e
all’ostruzione del flusso di aria.
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37
Gene CFTR
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38
Strategie di clonaggio posizionale con gene candidato (I)
Attualmente il clonaggio posizionale arriva a definire una regione candidata all’interno
della quale si ricercano i geni candidati. I criteri che si possono seguire per identificare un
gene candidato sono differenti:
1. Schema di espressione (modalita’ e funzione) compatibile con il fenotipo patologico.
Ricordare che spesso il fenotipo:
-  e’ sindromico
-  e’ tessuto-specifico (cio’ non significa guardare geni con espressione tessuto specifica!)
Esempi: rodopsina come gene (se mutato) responsabile della Retinite Pigmentosa (RP) che
mappa in 3q21 e fibrillina come gene (se mutato) responsabile della Sindrome di Marfan che
mappa in 15q21.1
In entrambi questi casi il mappaggio per linkage aveva ristretto la
regione da analizzare, la conoscenza della causa del fenotipo fa
restringere l’analisi ai geni candidati.
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Strategie di clonaggio posizionale con gene
candidato (II)
2. Omologia con un gene umano pertinente o con un EST:
- identificata la fibrillina come responsabile della Sindrome di Marfan dimostrata
l’esistenza di una seconda fibrillina (5q) il cui gene e’ divenuto candidato per le
sindromi Marfan-simili (aracnodattilia congenita);
- si riesce ad associare ad una sequenza genomica caratterizzata una EST
3. Omologia con un gene implicato in un modello animale della malattia. Esempio:
gene Lhx2, omologo di apterous di Drosophila m.
L’animale principalmente utilizzato per questo scopo e’ il topo di cui si ha a
disposizione la mappa genetica e fisica di tutti i marcatori polimorfici e relative
localizzazioni specifiche e i quadri fenotipici.
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Domande
Ma ho trovato il/i gene/i…e’ proprio quello giusto?
  Produzione di un modello murino: si puo’ cercare di ottenere per mutagenesi
mirata dopo l’identificazione del corrispondente gene murino (ortologo), il fenotipo
murino o costruire il topo transgenico
  Restaurazione in vitro
del fenotipo normale: se la mutazione provoca perdita di
funzione potrebbe essere possibile trasfettare la linea cellulare con il gene candidato
normale e osservare la scomparsa della deficienza. E’ necessario pero’ che le cellule
in vitro siano in grado di esprimere il gene e che sia possibile ottenere una coltura
  Ricerca delle mutazioni: la ricerca delle mutazioni puntiformi in ogni
metodo piu’ diffuso. Fornisce un evidenza forte che il gene
giusto, ma non e’ sufficiente
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affetto e’ il
candidato sia quello
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Ma ho trovato il/i gene/i…e’ proprio quello giusto?
MA TUTTI GLI APPROCCI DEVONO
CONVERGERE SUI TEST DI MUTAZIONI
SUI GENI CANDIDATI
IL GENE RESPONSABILE DELLA MALATTIA DEVE ESSERE
MUTATO NEGLI AFFETI E NON MUTATO NEI SANI
ATTENZIONE PERO’ …
ETEROGENEITA’ GENETICA, mutazioni in geni diversi danno lo stesso fenotipo
MUTAZIONI NON PATOGENE, esistono le varianti neutre!
MUTAZIONI DIFFICILI DA TROVARE, analizzare geni di grandi dimensioni
puo’ essere piu’ complesso o situazioni in cui c’e’ il LD
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E SE IL GENE E’ PIU’ DI UNO?
Le ricerche piu’ recenti hanno evidenziato la presenza di patologie
note come Sindromi da geni contigui. Piu’ geni nella stessa regione
sono coinvolti nella patogenesi (Sindrome di Prader-willi)
Anche l’orientamento sessuale e’ stato studiato e piu’ geni sembrano
coinvolti nella sua definizione
Prof. Mario Ventura
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Capitolo 16 dello Strachan
Altri esempi disponibili nel testo
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