lezione 2

Strumenti della Genetica Molecolare Umana (1)
Capitoli 6-7-8
Prof. Mario Ventura
Metodi generali per lo studio di sequenze che facciano
parte di una popolazione composita di DNA
Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura
Prof. Mario Ventura
Clonaggio del DNA
Tappe:
1. Isolamento del DNA
2. Taglio del DNA con enzimi di restrizione
3. Clonaggio in vettori
4. Introduzione dellla molecola ricombinante in una cellula ospite
(trasformazione)
CLONAGGIO MOLECOLARE
Prof. Mario Ventura
Clonaggio del DNA
Tappe:
1. Isolamento del DNA
2. taglio del DNA con enzimi di restrizione
3. Clonaggio in vettori
4. Introduzione dellla molecola ricombinante in una cellula ospite
(trasformazione)
CLONAGGIO MOLECOLARE
Prof. Mario Ventura
Enzimi di restrizione
1. Enzima che riconosce una specifica sequenza (sito di restrizione) che puo’ essere di
4bp, 6bp o 8bp che possiede un asse di simmetria e per questo e’ definita palindrome
2. Puo’ tagliare il DNA in corrispondenza del sito riconosciuto o produrre tagli lontano
dal sito riconosciuto (piu’ raramente)
3. I frammenti prodotti possiedono un’estremita’ 5’-P ed un 3’-OH
4. Vengono utilizzati per produrre un pool di frammenti di DNA che possono essere
clonati
  Principalmente trovati in alcuni batteri per cui rappresentano un sistema di
difesa da DNA estraneo. Il batterio protegge il proprio DNA metilando i siti di
restrizione che cosi’ non sono piu’ riconosciuti dall’enzima di restrizione.
Prof. Mario Ventura
Quanti siti di riconoscimento ci sono nel genoma?
Supponendo che il DNA abbia una composizione in basi uguale (50% GC) ed una
distribuzione delle basi e’ del tutto casuale....
la probabilita’ di trovare una qualsiasi sequenza e’ data dal prodotto delle probabilita’
delle singole basi costituenti.
5’-ACGG-3’
P( 3’-TGCC-5’ ) = 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 =1/256
In generale si puo’ ricavare la probabilita’ di un sito di restrizione considerando in
numero delle basi che lo compongono:
Basi nel sito di restrizione
Probabilita’ di trovare il sito di
restrizione
4
(1/4)4 = 1 ogni 256 basi
5
(1/4)5 = 1 ogni 1024 basi
6
(1/4)6 = 1 ogni 4096 basi
8
(1/4)8 = 1 ogni 65536 basi
nProf. Mario Ventura
(1/4)n
Piu’ e’ piccolo e’ il sito di restrizione riconosciuto piu’
e’ probabile trovarlo nel genoma!!!
 ma
il DNA di ogni organismo ha una propria
composizione in basi e la distribuzione delle basi
non e’ del tutto casuale
Enzimi di restrizione II
...quando il DNA viene tagliato con un dato enzima il risultato e’ un’ampia gamma di dimensioni
dei frammenti.
Gli enzimi posso tagliare il DNA in modo differente:
1. alcuni enzimi
piatte;
come HaeIII tagliano la molecola di DNA dando origine ad estremita’
2. altri come EcoRI producono tagli sfalsati producendo estremita’ coesive
a. 
b. 
5’
3’
l’estremita’ sporgente puo’ essere 5’ (EcoRI)
l’estremita’ sporgente puo’ essere 3’ (PstI)
CCCGGG 3’
GGGCCC 5’
5’
3’
Taglio con SmaI
5’
3’
CCC
GGG
GGG
CCC
piatte (blunt)
Prof.Estremita’
Mario Ventura
GGATCC 3’
CCTAGG 5’
5’
3’
Taglio con PstI
Taglio con BamHI
3’
5’
5’
3’
5’GATCC
G
G
CCTAG5’
Estremita’ 5’ sporgenti
CTGCAG 3’
GACGTC 5’
3’
5’
5’
3’
G
CTGCA 3’
3’ACGTC
G
Estremita’ 3’ sporgenti
3’
5’
Enzimi di restrizione III
Gli enzimi che producono estremita’ sfalsate (sticky ends) sono estrememente utili nel
clonaggio. Tagliando il DNA del vettore e quello che si desidera clonare, con lo stesso
enzima di restrizione, si generano estremita’ “appiccicose” che si riconoscono tra loro!!!
Gli enzimi che producono estremita’ piatte (blunt ends) sono utilizzati anche loro in
strategie di clonaggio molecolare, ma in questo caso devono essere utilizzati accorgimenti
tecnici particolari prima di mettere a contatto i DNA vettore e da clonare (come nel
clonaggio cDNA)
Se le estremita’ di due pezzi di DNA - il DNA di un vettore di clonaggio e il DNA che si
vuole clonare - prodotti dall’azione dello stesso enzima si incontrano in soluzione si ha
un appaiamento di basi (le due estremita’ a singola elica si riassociano)
Prof. Mario Ventura
TAGLIO E LIGASI TRA DUE DNA DIFFERENTI
3’ GAATTC 5’
5’ CTTAAG 3’
3’ GAATTC5’
5’ CTTAAG3’
Taglio con EcoRI (estremita’ coesive)
5’ G
3’ CTTAA
AATTC 3’
G 5’
Miscela dei digeriti 5’ G
3’ CTTAA
AATTC 3’
G 5’
LIGASI
5’ G AATTC 3’
5’ G AATTC 3’
3’ CTTAA G 5’
3’ CTTAA G 5’
5’ G AATTC 3’
3’ CTTAA G 5’
Prof. Mario Ventura
DNA RICOMBINANTE
5’ G AATTC 3’
3’ CTTAA G 5’
Clonaggio (e non clonazione) del DNA
Tappe:
1. Isolamento del DNA
2. Taglio del DNA con enzimi di restrizione
3. Clonaggio in vettori,
si tagliano e mescolano i due differenti
tipi di DNA (vettore e DNA da clonare) con lo stesso enzima o con enzimi
compatibili e si lascia agire la ligasi!
4. Introduzione dellla molecola ricombinante in una cellula ospite
(trasformazione)
CLONAGGIO MOLECOLARE
Prof. Mario Ventura
I vettori di clonaggio
I vettori sono molecole di DNA capaci di “trasportare” e replicare frammenti di DNA
estraneo e diversi da se stesso
Si distinguono per le proprieta’ molecolari e per la dimensione massima del DNA che
puo’ essere portata all’interno dal vettore (capacita’ del vettore):
vettori plasmidici (a bassa capacita’)
vettori basati sul fago lambda (a bassa capacita’)
vettori fosmidici (a bassa capacita’)
YAC, PAC e BAC (vettori ad alta capacita’)
Vettori di clonaggio
vettori plasmidici standard
vettori lambda di inserzione
vettori lambda di sostituzione
vettori fosmidici
vettori PAC
vettori BAC
vettori YAC
Prof. Mario Ventura
Dimensioni dell’inserto
fino a 10kb
fino a 10kb
9-23kb
35-42kb
130-150kb
fino a 300kb
02-2Mb
I vettori di clonaggio II
Prof. Mario Ventura
I vettori di clonaggio III
CARATTERISTICHE GENERALI:
1. Devono possedere la capacita’ di replicarsi (ori di replicazione) nel genoma della
cellula ospite
2. Siti unici di restrizione, il vettore deve essere tagliato solo in un sito del suo
genoma la cui localizzazione deve essere nota. Per questo motivo la maggiore parte
dei vettori e’ ingegnerizzata e munita di un polylinker
3. Marcatore selettivo di trasformazione. Devono presentare dei marcatori genici che
permettano di distinguere una cellula che porta il vettore da una cellula che non lo
porta
4. Marcatore della ricombinazione. Devono presentare dei marcatori genici che
permettano di distinguere se il vettore porta il frammento che si vuole clonare o se e’
tal quale (privo di inserto)
Prof. Mario Ventura
I vettori plasmidici
Il vettore plasmidico e’ costituito da:
a.  Origine di replicazione (ori)
b.  Polylinker
c.  Marcatore di trasformazione (la resistenza d un antibiotico, ampr)
d.  Marcatore della ricombinazione (gene per la β-galattosidasi)
Es. pUC19
Prof. Mario Ventura
Uno sguardo rapido sull’operone del lattosio
(in assenza di lac)
Prof. Mario Ventura
Uno sguardo rapido sull’operone del lattosio
(in presenza di lac)
Prof. Mario Ventura
Marcatore per il DNA ricombinante
LacZ e’ un gene che codifica per la βgalattosidasi un enzima che viene prodotto dalle
cellule batteriche se in presenza di lattosio
(induttore). Questo gene puo’ essere utilizzato
come marcatore della ricombinazione!
Il gene lacZ ha il polylinker localizzato all’interno “in frame” ed e’ in grado di codificare
per l’enzima funzionante
Se nel polylinker e’ inserito un frammento di DNA estraneo il gene lacZ non codifica per
l’enzima β-galattosidasi e perde la capacita’ di metabolizzare il lattosio e substrati
cromogeni come l’X-gal. Se si induce nelle cellule batteriche trasformate l’operone Lac
(utilizzando l’IPTG, isopropiltiogalattoside) le cellule capaci di colorarsi (blu) avranno il
gene β-galattosidasi integro e non saranno ricombinanti viceversa le colonie bianche
saranno le ricombinanti (quelle che stiamo cercando!!!!)
Prof. Mario Ventura
Marcatore per il DNA ricombinante II
Metodo della doppia resistenza ad antibiotici
In grassetto i siti di restrizione presenti in doppio
In relazione a quale enzima di
restrizione viene utilizzato si
presuppone che il batterio
ricevente il plasmide con l’inserto
perda una delle due resistenze
(ampicillina o tetraciclina)
pBR322
Prof. Mario Ventura
Come si
seleziona un
carattere
batterico?
1. Come si identificano e contano i mutanti batterici?
Sistemi di selezione
2. Quali sono i caratteri che si seguono?
-  biosintesi di aminoacidi
-  utilizzo di zuccheri
- resistenza ad antibiotici
I batteri si definiscono auxotrofi se sono incapaci di sintetizzare
molecole essenziali, ceppi che viceversa sono capaci di sintetizzare tutte
le molecole essenziali sono definiti prototrofi
Prof. Mario Ventura
Selezione per mutanti della biosintesi di aa
si cercano i mutanti aa- (esempio trp-)
Partiamo da
wild-type (trp+)
batteri trp-
replica plating
coltura
(109 batteri)
terreno con trp
crescono trp+/-
terreno minimo
crescono trp+
In questo modo dalla coltura di partenza
e’ possibile isolare cloni mutanti per il trp
Prof. Mario Ventura
Replica plating
Prof. Mario Ventura
Selezione per mutanti dell’utilizzo di zuccheri
si cercano i mutanti zucchero- (esempio lac-, lattosio-)
Partiamo da
wild-type
batteri lac+
replica plating
coltura
(109 batteri)
terreno minimo
crescono lac+/-
In questo modo dalla coltura di partenza
e’ possibile isolare cloni mutanti per il lattosio
Prof. Mario Ventura
terreno con lattosio
crescono lac+
Selezione per mutanti
della resistenza ad antibiotici
si cercano i mutanti antibioticor (esempio strpr, streptomicina resistente)
Partiamo da
wild-type
batteri strpr
replica plating
coltura
(109 batteri)
terreno minimo
crescono strpr/s
terreno con strept.
crescono strpr
In questo modo dalla coltura di partenza
e’ possibile isolare cloni resistenti alla streptomicina
Prof. Mario Ventura
Clonaggio con pUC19
EcoRI
ampr
Estrazione DNA
EcoRI
EcoRI
Digestione con EcoRI
APPAIAMENTO E LIGASI
Estremita’
appicicose
Solo le colonie bianche
hanno il DNA
RICOMBINANTE
Estremita’
appicicose
Isolamento
Crescono solo i batteri con il DNA del
vettore ricombinante e non
VETTORE
DNA
RICOMBINANTE
Piastra su terreno selettivo con
antibiotico e X-Gal
TRASFORMAZIONE
DIVISIONI
CELLULARI
Prof. Mario Ventura
Crescita in terreno con
sistema selezione amp
Nota pero’ che…
Il vettore si potrebbe richiudere su se stesso per questo motivo si puo’ minimizzare la
ricircolarizzazione:
1.  trattando il vettore con fosfatasi alcalina;
2.  operando una doppia digestione con due enzimi diversi che generino estremita’ non
compatibili sia sul DNA del vettore che del DNA da clonare (la stessa digestione con
gli stessi enzimi si dovra’ operare sul DNA che si vuole inserire nel vettore)
IN TUTTI I CASI COMUNQUE SI PUO’ PROCEDERE SELEZIONANDO PER IL
MARCATORE DI CLONAGGIO.
ES. β-GALATTOSIDASI e SISTEMA DELLE COLONIE BIANCHE/BLU
I vettori di clonaggio plasmidici consentono di clonare efficacemente in E.coli frammenti
di DNA fino ad alcune kilobasi, con un limite massimo di 5-10kb.
  Plasmidi che portano frammenti piu’ grandi sono spesso instabili e tendono a perdere
la maggior parte del DNA inserito.
Prof. Mario Ventura
Piccolo test: trova al differenza
Gel 2
Gel 1
Prof. Mario Ventura
Gel 1. digestione DNA genomico
Gel 2. Digestione inserto cloni genomici
I batteriofagi
I batteriofagi furono descritti per la prima volta intorno alla seconda decade del '900, come placche di lisi
osservabili su popolazioni batteriche cresciute a confluenza su terreni solidi. Ciscuna placca rappresenta
una popolazione clonale. Il fago l capace di integrarsi nel genoma batterico sfruttando delle integrasi virali,
o il batteriofago µ, che si integra a caso nel cromosoma batterico sfruttando l'enzima transposasi. Il
batteriofago l può utilizzare due percorsi alternativi all'interno del batterio: il ciclo litico e il ciclo lisogeno
Nel primo caso il batteriofago
replica il proprio corredo genetico, si
assembla in virione maturo e lisa la
cellula uccidendola. In altri casi
invece il fago é capace di integrare il
proprio DNA nel cromosoma
batterico, mantenendolo in uno stato
profagico inattivo e non dannoso
per l'ospite batterico .
Prof. Mario Ventura
Il DNA del fago l (lambda)
Geni per le proteine dell’involucro (8)
Geni per l’integrazione e ricombinazione (4)
Geni per regolazione, sintesi del
DNA del fago e lisi dell’ospite
sx Cos
Cos dx
45kb
att
cI cro
-  Estremita’ protrundenti 5’ lunghe 12 nucleotidi e complementari (coesive) cos destro e sinistro. Nella cellula in
cui il fago entra le cos si appaiano e saldano mediante l’azione delle ligasi cellulari e circolarizzano il DNA di λ.
Puo’ seguire due destini:
CICLO LITICO
CICLO LISOGENICO
(indotto dall’omologia tra il gene att sul fago e batterico)
1. DNA del fago viene indicato come provirus
2. La cellula e’ lisogena
- Due geni regolano il passaggio: cI domina nello stato lisogeno e cro domina nello stato litico (azione
antagonista, si reprimono a vicenda)
- In genere e’ favorito lo stato lisogeno
- Per i vettori derivati dal fago l non sono necessari i geni per la lisogenia (tratto giallo)
Prof. Mario Ventura
I vettori fagici (lambda derivati)
45kb
DNA genomico
Cos sinistro
Cos destro
Digestione con BamHI
Digestione parziale con Sau3A (estremita’ compatibili BamHI)
Isolamento braccia dx e sx
+
Isolamento frammenti 15kb
CONCATAMERO di molti DNA fagici ricombinanti
Impaccamento in vitro
Prof. Mario Ventura
(taglio del concatamero in siti cos)
Perche’ due enzimi diversi pur avendo
estremita’ compatibili?
Due ordini di problemi:
-  Perche’ non usare BamHI sul DNA genomico invece di Sau3A?
Ricorrenza del sito di taglio su genomico (Sau3A riconosce un sito di 4 basi e BamHI un
sito di 6 basi) per cui si preferisce un taglio piu’ frequente per avere frammenti piu’
piccoli (dipendenza dalla capacita’ del vettore);
- Perche’ non usare Sau3A sul vettore invece di BamHI?
Nel vettore al di fuori del polylinker potrebbero esistere siti riconosciuti da Sau3A non
desiderati che se riconosciuti dall’enzima suddetto potrebbero generare frammenti diversi
dall’atteso non utilizzabili nel clonaggio!
Prof. Mario Ventura
Tipi diversi di vettori lambda e suoi derivati
Vettori lambda di sostituzione, possono essere impaccate da 37 a 52 kb di DNA
estraneo. Il frammento di DNA contenente i geni del ciclo lisogeno vengono eliminati e
sostituiti dall’inserto.
Normalmente utilizzati per creare librerie di DNA genomico
Vettori lambda di inserzione, in questo caso la grandezza degli inserti e’ piu’ piccola
(fino a 10kb) dei precedenti in quanto il DNA estraneo e’ inserito nel gene cI
responsabile del ciclo lisogeno.
Normalmente utilizzati per creare librerie di cDNA
IN ENTRAMBI I CASI IL/I GENE/I PER LA LISOGENIA SONO ELIMINATI DAL GENOMA DEL FAGO
Vettori Fosmidici, contengono sequenze fagiche inserite in un piccolo vettore circolare.
Possono contenere grossi frammenti di DNA estraneo (30-45kb). Utilizza il sistema di
impaccamento (in vitro) del fago.
ALLA FINE DEL PROCESSO SI OTTIENE UNA LIBRERIA GENOMICA
Prof. Mario Ventura
Librerie fosmidiche
!
Prof. Mario Ventura
BAC, Bacterial Artificial Chromosome
Caratteristiche:
1.  Lungo 7-8kb
2.  Resistenti al cloramfenicolo (marcatore di
trasformazione)
3.  pUC-link rimosso durante il clonaggio e’
sostituito dal DNA esogeno
4.  Sistema selezione SacBII (marcatore DNA
ricombinante). Se si forma il gene integro
nella cellula si sintetizza un composto tossico
Vantaggi:
1.  Possibilita’ di clonare frammenti molto
grandi (fino a 200Kb)
2.  Stabilita’ dei cloni. Gene parB e il basso
numero di copie del vettore nella cellula
limitano il verificarsi di riarrangiamenti inter
ed intracromosomici e la formazione di cloni
chimerici (tipico degli YAC)
ESSENZIALI PER IL PROGETTO GENOMA UMANO
Prof. Mario Ventura
PAC, P1 Artificial Chromosome
Caratteristiche:
1.  Possono sopportare frammenti genomici
piu’ piccoli (fino a 100-120Kb)
2.  Resistenti alla kanamicina
ESSENZIALI PER IL
PROGETTO GENOMA UMANO
Prof. Mario Ventura
BANCHE DI DNA RICOMBINANTE
Collezione di cloni contente almeno una copia di ogni sequenza di DNA del genoma
che si vuole clonare.
Si distinguono in relazione al materiale che si vuole clonare in:
- genomiche se si utilizza il DNA genomico totale di un organismo (particolarmente
utilizzate nel Progetto Genoma Umano)
- cromosomiche si usa come DNA da clonare il DNA di un cromosoma e si ottiene
una libreria cromosoma-specifica
- cDNA si utilizza come acido nucleico da clonare il DNA ricavato da una serie di
molecole di mRNA per trascrizione inversa
Prof. Mario Ventura
BANCHE GENOMICHE
1.  Il DNA viene digerito parzialmente con opportuni enzimi di restrizione (in relazione
al motivo e al vettore di clonaggio)
2.  La scelta del vettore e’ cruciale (dipende dalla grandezza dei frammenti che si
vogliono ottenere)
3.  E’ importante definire la ridondanza o complessita’ (definita in termini di Genomi
Equivalenti, GE) di una libreria
Per una libreria di genomico umano con inserti di dimensioni medie di 40kb:
1GE = 3000 Mb (DNA totale)/ 40 kb (grandezza inserto medio) = 75.000 cloni
Se dopo clonaggio otterro’ 300.000 cloni la libreria sara’ ridondante 4 volte
IMPORTANTE PER EVIDENZIARE LE DUPLICAZIONI GENOMICHE
4.
Quelle piu’ recentemente costruite, utilizzano i BAC o PAC come vettori di
clonaggio (per indicare un BAC si indica il nome della plate e le coordinate nella
plate. Es. 143(plate)b2(coordinate))
Prof. Mario Ventura
RICERCANDO UN GENE NELLE BANCHE
GENOMICHE
Per trovare un clone di interesse e’ necessario testare la libreria con una data sequenza
Screening di librerie
Screening radioattvio
Screening mediante PCR
Si puo’ cercare anche il clone genomico che contiene un dato STS
Si puo’ cercare anche il clone genomico che contiene un gene
Si puo’ cercare il numero di copie di un dato gene (o STS)
Prof. Mario Ventura
Esempio di screening I
Marcatura
radioattiva
Ibridazione
Ogni Segmento e’ costituito da un
numero variabile di filtri (fogli di
nitrocellulosa dove sono depositati I
cloni BAC della libreria)
Prof. Mario Ventura
FILTRO 3
FILTRO 4
24
23
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
P
O
N
M
L
K
J
I
H
G
F
E
D
C
B
A
P
O
N
M
L
K
J
I
H
G
F
E
D
C
B
A
Pannello4
Pannello2
Pannello1
Pannello6
Pannello5
Pannello3
Esempio di screening II
Il BAC e’ 151P3
Prof. Mario Ventura
Dove vengono conservati i cloni?
I freezer a -80ºC sono utilizzati per conservare le plate in cui ogni clone (in glicerolo) e’
separato dagli altri e facilmente identificabile dagli altri (sistema delle coordiante)
Prof. Mario Ventura
Dove vengono conservati i cloni?
Prof. Mario Ventura
Dove vengono conservati i cloni?
Prof. Mario Ventura
Le piastre e i filtri
Prof. Mario Ventura
RICERCANDO UN GENE NELLE BANCHE
DATI GENOMICHE
Per trovare un clone di interesse e’ necessario testare la libreria con una data
sequenza
Screening di librerie
Si puo’ cercare il clone genomico che contiene un dato STS
(si amplifica il DNA genomico con i primer corrispodnenti all’STS e si ibrida sui
filtri il prodotto di PCR)
Si puo’ cercare il clone genomico che contiene un gene
(si puo’ utilizzare la stessa strategia amplificando un frammento di un gene)
Si puo’ cercare il numero di copie di un dato gene (o STS)
(e’ essenziale conoscere la ridondanza della libreria)
Prof. Mario Ventura
Banche cromosomiche
Tipo particolare di banca genomica dove il materiale di partenza e’ il DNA di un
cromosoma
Le strategie di costruzione di queste banche sono identiche alle genomiche classiche
l’unica differenza e’ come ottenere il materiale di partenza
TECNICA D’ELEZIONE SORTING CROMOSOMICO
(stessa tecnica del cariotipo FACS)
  Queste banche possono essere utilizzate per trovare il clone di un gene di cui e’
nota la localizzazione ottenuta da dati di mappatura genetica
(se non e’ nota la localizzazione del gene queste librarie sono troppo dispendiose da utilizzare e sono sostituite
dalle genomiche)
Prof. Mario Ventura
Sistemi di clonaggio progettati per
l’espressione genica
Finora metodi per lo studio del genoma dal punto di
vista strutturale , ma come si fa per studiare
l’espressione di un gene?
Sono utilizzati gli stessi sistemi?
NO!
E’ NECESSARIO OPERARE UN CLONAGGIO DI ESPRESSIONE
Ma ATTENZIONE alle proteine eterologhe!!!!
Prof. Mario Ventura
COME SI TROVA IL CLONE
CORRISPONDENTE AD UN GENE?
Esistono diversi metodi per screenare la libreria di cDNA, uno in particolare si adatta alla selezione di un
clone di cDNA che codifichi una particolare proteina. Si il cDNA in un vettore di espressione in questo modo
si induce l’espressione del gene e se ne puo ricavare la proteina corrispondente.
Promotore inducibile
(in genere di origine batterica)
Polylinker
Trascrizione
Promotore inducibile
(in genere di origine batterica)
Prof. Mario Ventura
VETTORE
Proteina estranea
prodotta nella cellula batterica
VETTORI DI ESPRESSIONE INDUCIBILE
I plasmidi della serie pET-3 contengono il
promotore del batteriofago T7. Sono
utilizzati in ceppi di E. Coli
geneticamente modificati che portano il
gene per la rna polimerasi del fago t7,
posto sotto controllo trascrizionale
inducibile del promotore lac.
Prof. Mario Ventura
Uso delle proteine di fusione
La serie di vettori pGEX-4T ha un promotore tac
(Ptac), un ibrido costituito da elementi del
promotore trp e di lac. La sua espressione è
normalmente repressa dalla proteina codificata da
LacI, ma e’ indotta dall’IPTG. Immediatamente a
valle del promotore tac, è situato il gene per la
glutatione S-transferasi (GST), seguito da un sito di
clonaggio multiplo (MCS). L’obiettivo è quello di
produrre una proteina di fusione fra la GST e la
sequenza codificante inserita nell’MCS, che si
troverà quindi ad avere al suo N-terminale la
proteina GTS stessa. Sfruttando la sua capacita di
legare il glutatione. la proteina di fusione può
essere purificata facilmente facendo passare gli
estratti proteici su colonnine con affinità per il
glutatione. nel sito MCS è anche inserita una
piccola proteina (trombina) in modo tale da la
proteina nella sua forma nativa può essere
purificata dopo la rimozione del glutatione.
Prof. Mario Ventura
Banche di cDNA
Le molecole clonate, cDNA, sono derivate da molecole di mRNA (presenti in un dato momento in
una popolazione di cellule)
Le molecole di mRNA estratte e purificate su colonna mediante catene oligo(dT) sono
trattate con trascrittasi inversa per ottenere le sequenze di cDNA
5’
AAAAA
TTTTT 5’
mRNA
Appaiamento primer
Trascrittasi inversa
+ dNTP
5’
mRNA
cDNA
AAAAA
TTTTT 5’
RNAsiH + DNApolI + DNA ligasi
5’
cDNA
Prof. Mario Ventura
cDNA
cDNA
5’
I frammenti di RNA degradato
AAAAA
TTTTT 5’ sono i primer della nuova sintesi
AAAAA
TTTTT 5’
cDNA a doppia elica
Ma le estremita’ sono inclonabili?
E se nella molecola di cDNA c’e’ un sito di restrizione BamHI?
Al posto del linker spesso si preferisce un adattatore di cui e’ nota la sequenza
GATCCAGAC
GTCTG
ADATTATORE
GTCTG
ADATTATORE
CAGACCTAG
TRATTAMENTO CON LIGASI
GATCCAGAC
GTCTG
Prof. Mario Ventura
GTCTG
CAGACCTAG
Saggio di una banca di cDNA
La banca dati riflette l’attivita’ genica di quel tipo cellulare al
momento in cui sono stati isolati gli mRNA (mRNA maturi!)
Si possono confrontare le attivita’ geniche in diversi tipi
cellulari dello stesso organismo o dello stesso tipo cellulare in
momenti diversi (durante lo sviluppo ed il differenziamento)
Il clone di cDNA puo’ essere utilizzato per screenare librerie
genomiche per ottenere un clone genomico del gene (con gli
introni e tutto cio’ che non e’ presente nell’mRNA)
COME SI TROVA IL CLONE CORRISPONDENTE AD UN GENE?
Prof. Mario Ventura
COME SI TROVA IL CLONE CORRISPONDENTE AD UN GENE?
Vettore di espressione
cDNA
Trasformazione di E.coli con
cloni di cDNA in vettori di
espressione
Piastramento su terreno di crescita
in cui il vettore e’ indotto ad
aprimere la proteina
Stampa su membrana
Lavaggio
dall’eccesso
di anticorpo
Autoradiografia
per evidenziare
i cloni positivi
Ibridazione con anticorpo marcato che
interagisce solo con le proteine prodotte
per cui c’e’ una specifica interazione
1. Si deve possedere un anticorpo per la proteina
2. Marcare l’anticorpo
Prof. Mario Ventura
3. Screenare la libreria di espressione con l’anticorpo marcato
PCR schema
Primers
antisenso
senso
denaturazione
Sintesi del DNA
fra i primers
annealing
Denaturazione
e annealing
1. 
2. 
.
.
1. 
.
1. 
.
2. 
.
Sintesi del DNA
fra i primers 2. 
.
1. 
22 molecole 2. 
dopo 2 cicli 3. 
.
.
.
4. 
Dopo 30 cicli ci sono piu’ di 109 molecole della sequenza di interesse
Prof. Mario Ventura
58
Gel di agarosio post amplificazione
Cosa stiamo
vedendo???
A sequence-tagged site (or STS) is a short (200 to 500 base pair) DNA sequence that has a single
occurrence in the genome and whose location and base sequence are known.
STSs can be easily detected by the polymerase chain reaction (PCR) using specific primers.
Prof. Mario Ventura
La stringenza di una PCR
Anche la PCR come le ibridazioni puo’ essere vincolata dalla
stringenza che in questo caso e’ definita dalla capacita’ dei primer di
legarsi al DNA target.
In questo caso la temperatura e’ il principale fattore influenzante la
stringenza e quindi specificita’ della reazione di PCR. Alte temperature
implicano maggiore stringenza, basse temperature minore stringenza.
A parita’ di temperatura e’ possibile avere piu’ bande ... come mai?
I primer possono legarsi oltre che al sito per i quali sono stati diseganti anche a
minore efficienza in altri loci del genoma e cio’ comporta che la PCR abbia bande
aggiuntive e non sia specifica.
Prof. Mario Ventura
PCR per la ricerca di delezioni (ΔF508)
PCR di una regione di 100pb che comprende la sequenza deleta e corsa su gel di
poliacrilammide
controllo
++
ΔF508/+
ΔF508/
ΔF508
ΔF508
61
Prof. Mario Ventura
PCR nella tipizzazione dei polimorfismi dei
siti di restrizione
questo metodo identifica anche SNPs (single nucleotide polymorfisms)
Prof. Mario Ventura
SNPs
La sostituzione di una base puo’ provocare la perdita o l’insorgenza di un sito di restrizione,
utilizzando PCR e digestione dell’amplificato si puo’ rapidamente evidenziare l’avvenuto
cambiamento senza utilizzare il southern, il radioattivo etc..
1241bp
750bp
491bp
X CX C X CX T X CX C X CX C
Prof. Mario Ventura
L’allele XT e XC
sono
distinguibili dopo digestione
con TaqI.
L’amplificato e’ di 1241 bp
dopo digestione se e’ presente
la sostituzione si hanno 2
bande
Utilizzo degli SNPs
• SNPs nella regione codificante di un gene, alterando la struttura di una proteina, possono
essere la causa di disordini monogenici ereditati in maniera dominante
sono routinariamente usati a scopo diagnostico
• 
SNPs che alterano la struttura primaria di una proteina coinvolta nel
metabolismo di un farmaco
bersagli dell’analisi farmacogenetica
•  SNPs nelle regioni non-codificanti del genoma, quindi senza impatto sul fenotipo
dell’individuo
markers usati in genetica di popolazione e negli studi di evoluzione
Prof. Mario Ventura
PCR allele specifica-ARMS (equivalente a ASO)
Trova applicazione per individuare
specifiche e NOTE mutazioni patogene
in un sistema che nel complesso e’
detto ARMS, Amplification refractory
mutation system)
Il sitema differisce dagli ASO per
la localizzazione del “nucleotide
rivelatore”
IMP. Il test ARMS puo’ essere inteso
semplicemente come la possibilita’ di
amplificare in modo specifico un allele,
non necessariamente deve essere inteso
come raffronto tra i due prodotti di PCR
Prof. Mario Ventura
Test per mutazioni note
Ricerca di mutazioni puntiformi: ARMS
(Amplification Refractory Mutation System):
si eseguono 2 reazioni di PCR in parallelo IN 2 PROVETTE
in una i primer sono entrambi per la sequenza normale,
nell’altra un primer e’ un ASO specifico per la mutazione.
Si ha la banda di amplificazione solo se entrambi i primer si
appaiano.
Di solito il test e’ multiplex utilizzando primer che permettano
di vedere piccole variazioni nella corsa elettroforetica.
Prof. Mario Ventura
PCR allele specifica-ARMS (equivalente a ASO)
Mutazione NOTA (C  T) in un gene voglio scoprire lo stato di eterozigosi o
omozigosi dei miei samples. Costruisco tre primers: Primer forward G (finisce al 3’
con una G); primer forward A (al 3’ A) e un primer reverse CON (che si lega in una
porzione non mutata del gene). Chiamo PCRG quella con la combinazione dei
primer G-CON e PCRA quella con combinazione dei primer A-CON.
Sample 1
Sample 2
Sample 3
PCRG
SI
SI
NO
PCRA
NO
SI
SI
Genotipo
C/C
C/T
T/T
IMP. Il test ARMS puo’ essere inteso semplicemente come la possibilita’ di amplificare
in modo specifico un allele, non necessariamente deve essere inteso come raffronto tra i
dueMario
prodotti
Prof.
Venturadi PCR.
Esempio di ARMS (multiplex)
per la ricerca delle mutazioni in
CF
• 3 pazienti (1,2,3)
• Primer normali APOB e OTC (controlli positivi)
• Primer ASO (11m.puntiformi,1ΔF508wt 1ΔF508m)
• In un sistema di PCR multiplex
Per il paziente1: provetta A con APOB+OTC+DF508m+ 5 mutazioni m1, m2, m3, m4,m5
Per il paziente1: provetta B con APOB+OTC+DF508wt+ 6 missenso m6, m7, m8, m9, m10, m11
quali sono i primer specifici di DF508N e quali quelli di DF508M?
68
Prof. Mario Ventura
ARMS per la ricerca delle mutazioni in
CF
PCR con primer multipli in ogni provetta e controlli per geni non correllati a
CF, l’amplificato viene caricato su gel di agarosio il DNA proviene da affetti
ApoB
A:
5 alleli
+ ΔF508
Mutato
+OTC
+ApoB
Mutaz
Mutaz
B:
6 alleli
+ ΔF508
Normale
+OTC
+ApoB
ΔF508 OTC
A
B
1
Prof. Mario Ventura
A
B
2
A
B
3
1 SANO
2 2 ALLELI CON MUTAZIONE PUNTIFORME
3 1 ALLELE DELETO E 1 CON MUTAZIONE PUNTIFORME
Microsatelliti o short tandem repeats (STRs)
Prof. Mario Ventura
PCR per la tipizzazione di STRs
(short tandem repeats)
Esempio di tipizzazione di unita’ CA
Nota: nelle cellule il sistema e’ instabile. Espansioni
a carico di questi loci avvengono con elevata
frequenza e cio’ comporta instabilita’ della regione
stesas. Nell’individuo troveremo cellule conun grado
diverso di amplificazione
Prof. Mario Ventura
Microsatelliti o short tandem repeats (STRs)
Prof. Mario Ventura
Esempio
utile per la
definizione
di aplotipo
73
Prof. Mario Ventura
Applicazioni pratiche del fingerprinting del DNA
1. Paternity and Maternity
Because a person inherits his or her VNTRs from his or her parents, VNTR patterns can be used to
establish paternity and maternity. The patterns are so specific that a parental VNTR pattern can be
reconstructed even if only the children's VNTR patterns are known (the more children produced, the
more reliable the reconstruction). Parent-child VNTR pattern analysis has been used to solve standard
father-identification cases as well as more complicated cases of confirming legal nationality and, in
instances of adoption, biological parenthood.
2. Criminal Identification and Forensics
DNA isolated from blood, hair, skin cells, or other genetic evidence left at the scene of a crime can be
compared, through VNTR patterns, with the DNA of a criminal suspect to determine guilt or innocence.
VNTR patterns are also useful in establishing the identity of a homicide victim, either from DNA found
as evidence or from the body itself.
3. Personal Identification
The notion of using DNA fingerprints as a sort of genetic bar code to identify individuals has been
discussed, but this is not likely to happen anytime in the foreseeable future. The technology required to
isolate, keep on file, and then analyze millions of very specified VNTR patterns is both expensive and
impractical. Social security numbers, picture ID, and other more mundane methods are much more likely
to remain the prevalent ways to establish personal identification.
Prof. Mario Ventura
PCR per espansione di ripetizioni
trinucleotidiche
Sca2/+
Sca2/+
+/+
SCA2
Gel di poliacrilamide
Primer della regione
fiancheggiante il sito di espansione
in SCA2
(Atassia spinocerebellare 2)
La tripletta e’ CAG, e’ in un esone
ed e’ mutazione piena da 41 a 81
espansioni.
Normale
Prof. Mario Ventura
Trasmissione: Autosomica
dominante
PCR per Corea di 60
Hungtinton (HD)
Gli alleli normali arrivano
fino a 29.
Ci sono raramente gli
intermedi fino a 35.
I patologici sono oltre 36.
46
48
44
42
40
33
19
18
Prof. Mario Ventura
18
17
Ricerca di Mutazioni
(sara’ approfondito in identificazione geni-patologici in uomo)
Spesso la ricerca di mutazioni non si avvale di un solo metodo ma di piu’ strategie
combinate tra loro. Alcuni esempi si possono trovare nell’identificazione di mutazioni
associate ad amplificazione di triplette.
PCR utilizzando:
sia fiancheggianti l’espansione (si puo’ non avere amplificazione e si ricorre ai
Southern blot)
sia primer nella sequenza trinucleotidica, la regione di espansione (si genera una
“ladder” per lo scivolamento durante la replicazione)
 
 
 La regione di espansione puo’ fornire indicazioni su: livello di espansione e quindi sull’insorgenza
del fenotipo patologico
 La PCR e’ risolutiva nel caso delle premutazioni in cui l’espansione e’ limitata o in quei casi in cui
anche la mutazione piena non raggiunge grande dimensioni (Corea, SCA...di solito quelle con CAG
poliglutamina).
ATT.NE Nel caso di espansioni molto ampie la Taq polimerasi puo’ non amplificare oppure la
sequenza rende difficile la costruzione di primer appropriato.In questi casi per avere conferma della
presenza della mutazione si ricorre al Southern blot di genomico digerito con enzimi di restrizione
Prof. Mario Ventura
DOP-PCR
PCR ideata per rendere possibile l’amplificazione di numerosi prodotti
anche a sequenza nucleotidica non nota.
Si puo’ utilizzare per amplificare l’intero genoma
Prof. Mario Ventura
In questo caso e’ nota la sequenza aminoacidica!

Download Report