Strumenti della Genetica Molecolare Umana (3) Capitoli 7-8 Prof. Mario Ventura Saggi di ibridazione Prof. Mario Ventura Metodi ed applicazioni dell’ibridazione molecolare dot-blot, gocce di DNA sono depositate sui filtri di nitro cellulosa colony hybridization, cloni batterici sono depositati sui filtri opportunamente trattati slot-blot, la deposizione del DNA e’ fatta mediante macchinari che depositano il DNA sui filtri passando da buchi (slot) a dimensione prefissata Sono la stessima cosa ... la scelta e’ in relazione all’economia del laboratorio Prof. Mario Ventura Ibridazione di ASO (allele-specific oligonucleotide) Fondamentale l’alta stringenza! Prof. Mario Ventura 4 ASO per la β39 N βN β39 Test per la mutazione β39 basato sul dot-blot. Ibridazione con oligonucleotide normale (N) e mutante (β39) Prof. Mario Ventura 5 Southern e Northern blot Si distinguono per il materiale target utilizzato s o u t h e r n Quando usare il southern? Quando usare il Northern? Prof. Mario Ventura 6 DNA genomico digerito con Enzimi di restrizione gel di agarosio colorato con EtBr Il righello serve per calcolare la lunghezza dei frammenti in funzione dello spazio percorso (cfr.foto succ.) Marker per sapere come si sono distribuiti i frammenti La luminosita’ nei pozzetti deriva da DNA non ben digerito e/o da impurita’ per una estrazione poco accurata Questa banda piu’ intensa e’ data da sequenze ripetute che essendo tagliate periodicamente e in frammenti sempre della stessa lunghezza si accumulano alla stessa altezza La intensita’ equivalente del DNA delle diverse corsie indica che le quantita’ caricate di DNA dei campioni sono le stesse. Il DNA a basso peso verso il fondo del gel si vede male perche’ sono meno rappresentati infatti la maggior parte del DNA e’ nella parte alta del gel Prof. Mario Ventura 7 Southern blot (digestione e ibridazione su filtro) DNA genomico digerito caricato su gel con EtBr Prof. Mario Ventura Lastra sviluppata dopo esposizione del filtro ottenuto dopo trasferimento su filtro (Southern blot) e ibridazione con sonda marcata radioattivamente (P32) 8 Gli RFLP come tutti i maracatori polimorfici permettono l’identificazione dell’aplotipo Definiti polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione Definizione di aplotipo Quali sono i vantaggi della PCR per identificare gli RFLP? Trova le differenze! Prof. Mario Ventura 9 Polimorfismo ed uso di RFLP Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. RFLP: La sonda riconosce il polimorfismo con un particolare enzima, ma non con altri. Quindi e’ la coppia sonda-enzima che evidenzia il RFLP!!! Enzima Enzima A B A1 B1 B2 A1 B1 B2 endonucleasi A Prof. Mario Ventura A2 A3 A3 mutazione elimina il sito di restrizione endonucleasi B Pattern su filtro 10 RFLP per distinguere lo stato degli alleli In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 2 frammenti di = lunghezza e’: 14 kb perche’ su entrambi i cromosomi in quella regione non e’ presente un altro sito QUINDI UNA SOLA BANDA 14Kb A1 A2 Omozigoti allele 14 14Kb A1 In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 4 frammenti 2 da 10.5 e 2 da3.5 kb perche’ su entrambi i cromosomi in quella regione e’ presente un altro sito che cade all’interno della regione identificata dal cDNA. QUINDI 2 BANDE In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 3 frammenti : 1 da 10.5 e 1 da3.5 kb originati dalla digestione di un cromosoma (perche’e’ presente un altro sito che cade all’interno della regione identificata dal cDNA) e 1 frammento da 14 originato dalla digestione dell’ altro cromosoma. QUINDI 3 BANDE Prof. Mario Ventura A2 10.5Kb 3.5Kb A1 A2 3.5Kb 10.5Kb A1 A3 Omozigoti allele 10.5,3.5 Eterozigoti alleli 14 e 10.5,3.5 A2 14Kb A1 3.5Kb A1 A3 A2 10.5Kb A2 11 RFLP in diagnostica: RFLP interno al gene di interesse Un esempio di malattia diagnosticabile attraverso gli RFLP e’ l’anemia falciforme. In questa patologia, a livello del gene della b-globina si verifica una sostituzione nucleotidica (A>T) nel codone 6. Questa alterazione porta ad una sostituzione amminoacidica glu > val e nello stesso tempo abolisce un sito di restrizione per l’enzima MstII. Come risultato, i diversi frammenti di restrizione per l’enzima MstII possono essere evidenziati con una sonda del gene della b-globina. Prof. Mario Ventura 12 Ibridazione in situ L’ibridazione in situ si esegue direttamente sul materiale biologico che sia tessuto o cromosomi. Permette di definire le localizzazione del materiale target in un esperimento. Anche in questo caso si possono usare DNA, RNA e cDNA come sonde Quando usare l’uno o l’altra? RNA antisensoper catena pesante di b-miosina Prof. Mario Ventura 13 cromosoma sul vetrino FISH sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo denaturazione doppia elica di DNA AT CGGT AT CCT A T A GG C A T A G G A T AT CGGT AT CCT A T A GG C A T A G G A T AT CGGT AT CCT A T A GG C A T A G G A T A ibridazione della sonda sui cromosomi denaturati sul vetrino denaturazione AT CGGT AT CCT A T A GG C A T A G G A T T A GG C A T A G G A T AT CGGT AT CCT A T A GG C A T A G G A T osservazione del vetrino Prof. Mario Ventura FISH Per la FISH si possono utilizzare: 1. Sonde puntiformi (fosmidi, cosmidi, BAC, PAC o YAC) 2. Sonde ottenute da ibridi (librerie totali e parziali) che colorano interamente o parzialmente i cromosomi 2. 1. Prof. Mario Ventura FISH PER IDENTIFICARE TRASLOCAZIONI E INVERSIONI Prof. Mario Ventura Principio della fluorescenza Spettri di assorbimento ed emissione Prof. Mario Ventura FISH : microscopio a fluorescenza Osservazione al microscopio filtro di emissione filtro di eccitazione Lampada a vapori di mercurio CCD camera obiettivo/ condensatore Prof. Mario Ventura fotografia Elaborazione al computer Filtri del microscopio a fluorescenza Prof. Mario Ventura FISH: metafase in DAPI Cromosomi 1. denaturati 2. colorati con DAPI Prof. Mario Ventura FISH: segnali Utilizzando sonde puntiformi (BAC) Prof. Mario Ventura FISH: merge Prof. Mario Ventura Tipologia di FISH La FISH in relazione alla tipologia di bersaglio si distingue in: 1. su metafasi (l’ibridazione si opera su vetrini con cromosomi metafasici); 2. su cromosomi stretchati 3. su fibre di DNA (fiber-FISH) 4. sui nuclei interfasici Tipologie piu’ recenti di FISH si sono studiate per la colorazione di tutto il cariotipo, sistema utile ed indiuspensabile per lo studio delle alterazioni cromosomiche dei tumori (principalemente solidi) IMP. distingui tra risoluzione e sensibilita’ del metodo! Prof. Mario Ventura Tipologia di FISH Prof. Mario Ventura FISH: merge Prof. Mario Ventura FISH nei tumori WCP, Whole Chromosome Paint (librerie cromosomiche totali) Prof. Mario Ventura FISH su cromosomi stretchati Prof. Mario Ventura DNA Fibers Prof. Mario Ventura FIBER-FISH Prof. Mario Ventura FISH in interfase Quando la uso? Perche’? Prof. Mario Ventura CARIOTIPO SKY Utilizzando sonde che colorano tutto il cromosoma Prof. Mario Ventura Cariotipizzazione multicolor • Cariotipizzazione mediante FISH con 2 o più fluorocromi che consente di identificare ciascuna delle coppie di omologhi in differenti colori, o sequenze di colori. Prof. Mario Ventura M-FISH Mix di 5 fluorocromi diversi per ciascun cromosoma OGNI CROMOSOMA PUO’ ESSERE DISTINTO IN MANIERA UNIVOCA DA UNA SPECIFICA COMBINAZIONE DI FLUOROCROMI Uno specifico software assegna una pseudocolorazione specifica a ciascun mix di fluorocromi per ciascun cromosoma Prof. Mario Ventura SKY (Spectral Karyotyping) un mix di piu’ fluorocromi eccitati simultaneamente attribuisce a ciascun cromosoma uno specifico spettro di fluorescenza OGNI CROMOSOMA PUO’ ESSERE DISTINTO IN MANIERA UNIVOCA DAL SUO SPETTRO DI FLUORESCENZA Uno specifico software assegna una pseudocolorazione specifica a ciascuno spettro Multicolor-FISH (M-FISH) • Per ottenere 24 colori simultaneamente è necessario utilizzare un cocktail di 5 fluorocromi: - FITC - DEAC - Cy3 - FITC - Cy3.5 - Spectrum Orange - Cy5 - Texas Red - Cy7 - Cy5 Prof. Mario Ventura SKY Ogni cromosoma è marcato con una combinazione unica di massimo quattro dei cinque fluorocromi utilizzati. SkyPaint Labeling Scheme chr Label 1 BCD chr Label 9 ADE 2 E 10 CE chr Label 17 C 18 ABD 3 ACDE 11 19 AC 4 CD 12 BE 20 A 5 ABDE 21 DE 6 BCDE 13 AD 14 B 22 ABCE 7 BC 15 ABC X AE 8 D 16 BD Y CDE A = Rodamina B = Texas Red C = Cy 5 Prof. Mario Ventura ACD Si ottiene così una specifica fluorescenza, o spettro, per ciascun cromosoma. D = FITC E = Cy 5.5 35 M-FISH/SKY Prof. Mario Ventura SKY: sequenza SKY (display colors) Prof. Mario Ventura d’analisi DAPI (inverted) DAPI (bands enhanced) Prof. Mario Ventura SKY: Studio Prof. Mario Ventura di marker cromosomici SKY: analisi di riarrangiamenti complessi Prof. Mario Ventura Multicolor Chromosome Banding (MCB) Tecnologia basata sull’impiego di prodotti di microdissezione cromosomica marcati con combinazioni differenti di 5 fluorocromi. Si possono analizzare 1-3 cromosomi per esperimento (Chudoba et al, 1999; Liehr et al, 2002;2003). Prof. Mario Ventura Multicolor banding Si realizza utilizzando frammenti di DNA ottenuti da genoteche genomiche in differenti vettori (YAC, PAC, BAC, cosmidi e plasmidi) o c o n p r o d o t t i d i microdissezione cromosomica Prof. Mario Ventura Comparative Genomic Hybridization (CGH) Prof. Mario Ventura CGH Comparative Genome Hybridization AUMENTI O DIMINUZIONI DEL NUMERO DI COPIE DI SEQUENZE DI DNA IN UN CAMPIONE “TEST” (spesso tumori) CONFRONTATO CON UN DNA “NORMALE DI RIFERIMENTO POTERE RISOLUTIVO 5-10MB DNA GENOMICO NORMALE ROSSO + DNA GENOMICO TUMORALE VERDE FISH COMPETITIVA SU METAFASI NORMALI DNA TUMORALE CON UNA REGIONE GENOMICA AMPLIFICATA DELEZIONI DI REGIONI SPECIFICHE NEL DNA TUMORALE Prof. Mario Ventura INCREMENTO DI FLUORESCENZA VERDE NELLA REGIONE AMPLIFICATA INCREMENTO DI FLUORESCENZA ROSSA NELLA REGIONE DELETA Prof. Mario Ventura Comparative Genomic Hybridization (CGH) 1. Normale: si lega tanto DNA “verde” quanto DNA “rosso”.Il rapporto dell’intensità della fluorescenza nei 2 colori è pari a 1. 2. Duplicazione: si lega più DNA “verde” del DNA “rosso”.Il rapporto dell’intensità della fluorescenza verde/rosso è > 1. 3. Delezione: si lega meno DNA “verde” del DNA “rosso”. Il rapporto dell’intensità della fluorescenza verde/rosso è < 1. Prof. Mario Ventura Prof. Mario Ventura Red=control DNA DEL DUP Prof. Mario Ventura Green=test DNA DEL Conventional CGH Array CGH ( aCGH ) RISOLUZIONE=<1Mb RISOLUZIONE=20Mb Label patient DNA Label control DNA with Cy3 with Cy5 Mix Label patient DNA Label control DNA with Cy3 with Cy5 Label patient DNA Label control DNA with Cy3 with Cy5 Mix Mix Hybridize DNA to genomic clone microarray Analyze Cy3/Cy5 fluorescence ratio of patient to control Cy3/Cy5 ratio >1 Duplication Prof. Mario Ventura Cy3/Cy5 ratio <1 Deletion Cy3/Cy5 ratio >1 Cy3/Cy5 ratio <1 Duplication Deletion Cy3/Cy5 ratio <1 Cy3/Cy5 ratio >1 Duplication Deletion ARRAY-CGH Prof. Mario Ventura MICROARRAY Prof. Mario Ventura Prof. Mario Ventura KCL19cy3 KCL19cy5 Raw data Normalized Combined data Gain: Chr.Y (p11.2-11.3) Actual array 400O10 112L19 414C23 115E20 Prof. Mario Ventura GS-62L8 671C15 628J24 547D24 89N1 GS-964M9 KCL164:1p36.3 deletion, 18qter gain Prof. Mario Ventura Gain: Chr.18q23-qter 90L3 Chr18:q23 91C19 Chr18:q23 89N1 Chr18:q23 GS-964M9 Chr18:qter Indicazioni per la CGH • Dismorfismi, ritardo mentale, anomalie congenite multiple con cariotipo normale. VANTAGGI • Combina analisi dei telomeri e delle regioni specifiche di malattie con un singolo esperimento • Rivela delezioni e duplicazioni LIMITI • Non rivela translocazioni bilanciate, inversioni, o bassi mosaicismi. Prof. Mario Ventura Il sequenziamento Prof. Mario Ventura Sequenziamento automatico Prof. Mario Ventura Lettura gel di sequenziamento Prof. Mario Ventura Next generation Sequencing The high demand for low-cost sequencing has driven the development of high-throughput sequencing technologies that parallelize the sequencing process, producing thousands or millions of sequences at once. High-throughput sequencing technologies are intended to lower the cost of DNA sequencing beyond what is possible with standard dye-terminator methods. Three major strategies: - 454 pyrosequencing - Illumina (Solexa) sequencing - SOLiD sequencing Prof. Mario Ventura
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