Esercitazione di citogenetica: few notes (1) Prof. Mario Ventura  Storia della citogenetica 1888 Waldeyer: termine “cromosoma” 1889 W.Fleming: immagini di cromosomi (cromatina) 1900 Riscoperta di Mendel. Sutton e Bovery: teoria cromosomica dell’ereditatarieta’ 1923 Painter: determinazione del sesso nell’uomo: XY Prof. Mario Ventura  Storia della citogenetica 1950 Studi su sezioni di testicoli (48 cromosomi) Prof. Mario Ventura 3   Storia della citogenetica 1952 Soluzione ipotonica (T.C.Hsu) (48 cromosomi) Prof. Mario Ventura  Storia della citogenetica 1955 Ford e Hamerton: colchicina Prof. Mario Ventura 5  Storia della citogenetica 1956 Prof. Mario Ventura Tijo e Levan: uso della colchicina e ipotonica: 46 cromosomi 6   Storia della citogenetica 1959 Sindromi: +21; X0; XXY 1960 P.Nowell: PHA per coltura linfociti 1960 Cromosoma Philadelphia Prof. Mario Ventura Immagine da microscopio a contrasto di fase Prof. Mario Ventura 8  Storia della citogenetica 1966 Conferenza di Chicago 1-2-3 gruppo A 4-5 gruppo B X-6-12 gruppo C 13-15 gruppo D 19-20 gruppo F Prof. Mario Ventura 16-17-18 gruppo E Y-21-22 gruppo G   Storia della citogenetica 1971 Quinacrine mustard:Q-banding (Caspersson) Prof. Mario Ventura   Storia della citogenetica: cariotipi a confronto Pre bande 1-3 gruppo A Post bande 4-5 gruppo B X-6-12 gruppo C 13-15 gruppo D 19-20 gruppo F Prof. Mario Ventura 16-18 gruppo E Y-21-22 gruppo G 1972  Storia della citogenetica G-banding con Giemsa •  Bande scure bande G, replicano tardivamente (cromatina più condensata), ricche in AT •  Bande chiare -Gnegative, replicano precocemente (cromatina meno condensata), ricche in GC Prof. Mario Ventura 12 Metodi colorazione differenziale   Colorano una regione specifica di alcuni o di tutti i cromosomi C-bande: tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabili dei cromosomi 1,9,16,Y   Creano un’alternanza di bande chiare e scure lungo l’asse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi. Prof. Mario Ventura Specificità delle regioni cromosomiche identificate dalle tecniche di bandeggio Prof. Mario Ventura QM-banding pattern Cromosomi vengono colorati con Quinacrina (fluorescente) e osservati in fluorescenza •  Bande fluorescenti = ricche in AT •  Bande spente = ricche in GC Prof. Mario Ventura DAPI e QM Prof. Mario Ventura L’ideogramma dei cromosomi umani Prof. Mario Ventura Prof. Mario Ventura Terminologia 46,XX - cariotipo normale Femminile 46,XY - cariotipo normale Maschile Questo modo di scrivere ci da’ due informazioni: -  numero totale dei cromosomi (46) -  sesso dell’organismo 47,XY,+21 Maschio con 47 cromosomi (invece di 46) ed un cromosoma 21 in piu’ (sindrome di Down) 46,XX,del(14)(q23) del=delezione 46,XY,dup(14)(q22q25) dup= duplicazione 46,XX,r(7)(p22q36) r=ring (cromosoma ad anello) Prof. Mario Ventura Analisi del cariotipo 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini Prof. Mario Ventura Allestimento del preparato fitoemoagglutinina (stimola la crescita) colchicina (ultimi 30’) Ipotonica (20’) sangue periferico proliferazione Prefissaggio con aggiunta fissativo (2ml) centrifugazione 48-96h terreno di coltura Centrifugazione pellet risospeso fissativo centrifugazioni (2-3) Prof. Mario Ventura risospensione in poco fissativo allestimento del preparato Analisi del cariotipo 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini Prof. Mario Ventura Colorazione QM 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine  Fluorocromi: QM, DAPI. Necessario un microscopio a fluorescenza Prof. Mario Ventura Colorazione Giemsa 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine G-banding con Giemsa dopo trattamento con tripsina. Microscopio in campo chiaro a luce trasmessa Prof. Mario Ventura 24 Analisi del cariotipo 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini Prof. Mario Ventura Selezione delle metafasi   Ottima ma….. Prof. Mario Ventura Selezione delle metafasi   Puo’ essere anche cosi’..  Cromosomi non ben riconoscibili, difficili anche da contare. Scartare! (potendo) Prof. Mario Ventura Selezione delle metafasi   .. O cosi’   Troppo contratti pero’ si puo’ usare per contarli. Scartare! (potendo) Prof. Mario Ventura Selezione delle metafasi  Sufficiente   Si possono contare Puo’ essere utile per analizzare i cromosomi non sovrapposti Prof. Mario Ventura 29 Come si fa il cariotipo? 1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL NUMERO CROMOSOMICO (non si conta una sola metafase!!!) 2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA’ 3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE Prof. Mario Ventura Fare il cariotipo 46 10 9 11 Prof. Mario Ventura 16 Cariotipo ordinato CARIOTIPO IN QM (specifico il bandeggio) Il cariotipo si puo’ fare anche a partire da colture cellulari, come ad esempio le colture ottenibili da materiale abortivo. Utilizzando questa strategia si possono avere informazioni sul cariotipo dell’aborto... Prof. Mario Ventura COLTURE CELLULARI colture di tessuto TIPI DI COLTURE CELLULARI colture di organo colture di cellule Prof. Mario Ventura COLTURE CELLULARI TIPI DI COLTURE Colture cell.ri primarie Colture cell.ri stabilizzate SI Cariotipo normale NO Cariotipo normale SI Inibizione da contatto NO Inibizione da contatto SI Senescenza NO Senescenza No Trasformazioni spontanee SI Trasformazioni spontanee Prof. Mario Ventura ALLESTIMENTO DELLE COLTURE DA MATERIALE ABORTIVO I CAMERA GESTAZIONALE CAMERA GESTAZIONALE E SACCO VITELLINO Prof. Mario Ventura ALLESTIMENTO DELLE COLTURE DA MATERIALE ABORTIVO II PRELIEVO DI UN PICCOLO FRAMMENTO DI MEMBRANA Prof. Mario Ventura ALLESTIMENTO DELLE COLTURE DA MATERIALE ABORTIVO III ELIMINAZIONE DEI VILLI Prof. Mario Ventura MEMBRANA PARZIALMENTE PRIVA DEI VILLI ALLESTIMENTO DELLE COLTURE DA MATERIALE ABORTIVO IV FRAMMENTAZIONE DI UN PICCOLO PEZZO DI CAMERA Prof. Mario Ventura ALLESTIMENTO DELLE COLTURE DA MATERIALE ABORTIVO V PRELIEVO DI PARTE DELLA MEMBRANA FRAMMENTATA Prof. Mario Ventura POSIZIONAMENTO DEI FRAMMENTI IN UNA CAPSULA PETRI PICCOLA ALLESTIMENTO DELLE COLTURE DA MATERIALE ABORTIVO VI DISTRIBUZIONE DEI FRAMMENTI NELLA CAPSULA PETRI PICCOLA Prof. Mario Ventura FRAMMENTI DISTRIBUITI UNIFORMEMENTE ALLESTIMENTO DELLE COLTURE DA MATERIALE ABORTIVO VII ELIMINAZIONE DELLE BOLLE D’ARIA POSIZIONAMENTO DEL VETRINO ROTONDO AGGIUNTA DEL TERRENO Prof. Mario Ventura 41 MICROSCOPIO INVERTITO Prof. Mario Ventura 42 ALONE DI CRESCITA FIBROBLASTI CRESCIUTI INTORNO AD UN FRAMMENTO DI TESSUTO Prof. Mario Ventura 43 ALONE DI CRESCITA FIBROBLASTI CRESCIUTI INTORNO AD UN FRAMMENTO DI TESSUTO Prof. Mario Ventura 44 FIBROBLASTI Prof. Mario Ventura 45 Tripsinizzazione Prof. Mario Ventura 46 CELLULE EPITELIALI Prof. Mario Ventura 47 LINFOBLASTI Prof. Mario Ventura 48