Biologia 15 – Ciclo cellulare, mitosi e meiosi Overview La divisione cellulare è il processo mediante il quale una cellula si divide in due cellule figlie (“morte senza cadavere”). In un uomo adulto avvengono circa 25 milioni di divisioni cellulari al secondo. Negli organismi pluricellulari esistono due tipi di divisione: la meiosi e la mitosi. La prima modalità (meiosi) consente all’organismo di riprodursi; le cellule coinvolte si chiamano cellule germinative e danno origine a cellule figlie con un corredo cromosomico di tipo aploide, cioè con un numero di cromosomi pari alla metà di quello della cellula madre. La seconda modalità (mitosi), invece, consente all’organismo di accrescersi nonché di sostituire le cellule danneggiate con cellule nuove; le cellule coinvolte si chiamano cellule somatiche e danno origine a cellule figlie con un corredo cromosomico di tipo diploide, cioè con un numero di cromosomi uguale a quello della cellula madre. Negli organismi unicellulari la mitosi rappresenta il mezzo di riproduzione dell’organismo (la meiosi interviene solo nei casi di riproduzione sessuata). Nei batteri la divisione cellulare è un processo semplice, non è una vera mitosi perché mancano tutti quei fenomeni complessi che caratterizzano la mitosi degli organismi superiori (apparato mitotico, spiralizzazione della cromatina, etc). Esso viene comunemente chiamato scissione binaria. In realtà, la meiosi e la mitosi sono processi di divisione del nucleo e non di tutta la cellula. Quest’ultima comprende, oltre alla mitosi e meiosi, anche la citodieresi, ossia la divisione del citoplasma. Mitosi La mitosi può essere suddivisa in 5 fasi: interfase, profase, metafase, anafase, telofase. Interfase L’interfase è detta (impropriamente) periodo di riposo. Rappresenta il periodo in cui la cellula si prepara alla mitosi. Negli organismi superiori le cellule possono rimanere in interfase per tutta la vita dell’organismo o per tempi lunghissimi (popolazioni statiche), oppure possono entrare in mitosi ad intervalli più o meno regolari e dividersi in due cellule figlie (popolazioni che si rinnovano). Nel primo caso il periodo di interfase è denominato stadio G0 o interfase quiescente (vero stadio di riposo mitotico). Nel secondo caso (cellule attivamente proliferanti), invece, l’interfase rappresenta lo stadio di preparazione alla mitosi vera e propria; durante questo stadio la cellula deve provvedere alla duplicazione di tutte le strutture cellulari (mitocondri, centrioli, ribosomi, DNA, etc) che saranno distribuite nelle cellule figlie. Essa rappresenta, quindi, la fase di più intensa attività della cellula (negli altri stadi deve avvenire solo la distribuzione nelle due cellule figlie). L’interfase si divide in tre sotto-fasi: G1, S e G2. Durante la fase G1 vengono prodotte le DNA-polimerasi e tutti gli enzimi e i fattori necessari alla sintesi del DNA. Nella fase S viene sintetizzato il nuovo DNA. Nella fase G2 vengono prodotte le proteine e gli enzimi che servono per spiralizzare il DNA e per formare il fuso mitotico. In conseguenza della produzione di tutti gli enzimi e le proteine che servono, la cellula aumenta di volume. La durata dell’interfase in una cellula metabolicamente attiva Biologia 15 – Ciclo cellulare, mitosi e meiosi 1 è di 12-30 ore (questo dato è relativo ai fibroblasti in coltura. Profase Durante questa fase la cromatina addensata (eterocromatina) e quella dispersa (eucromatina) si spiralizzano e si formano i cromosomi. Man mano che la profase procede, i cromosomi si spostano alla periferia del nucleo (verso la membrana nucleare), lasciando vuota la parte centrale del nucleo. Durante la profase avviene l’organizzazione dell’apparato mitotico. I centrioli sono il cuore dei questo apparato. Si replicano alla fine dell’interfase e migrano verso poli opposti della cellula in divisione. Da questa posizione generano diversi tipi di fibre: l’aster o astrosfera, un insieme di microtubuli che si irradiano a stella e raggiungono la membrana cellullare. Servono per ancorare i centrioli in una data posizione. Le fibre interpolari, che si dirigono verso il centro della cellula e si incontrano con la controlaterale. Queste fibre si fronteggiano e continuano ad accrescersi l’una contro l’altra. In questo modo spingono i centioli ad allontanarsi. Le fibre del cinetocore, che legheranno il centromero dei cromosomi. Verso la fine della profase, la membrana nucleare e i nucleoli scompaiono (perché si arresta la sintesi dell’RNA ribosomale). La membrana nucleare si frammenta in vescicole e la stessa sorte tocca anche al RER e al Golgi. Metafase Inizia quando i cromosomi si dispongono sul piano equatoriale della cellula. Termina quando le fibre del cinetocore reggiungono i centromeri dei cromosomi e si ancorano ad essi. Anafase Ha inizio quando i cromatidi fratelli che compongono ogni cromosoma si separano. Essi sono tenuti insieme di solito dalle coesine, delle proteine che uniscono i loro centromeri. All’inizio dell’anafase, l’enzima separasi si slega dal suo inibitore (securina) e degrada le coesine. Questo porta alla separazione dei due cromatidi fratelli. In seguito, ogni cromatide viene trasportato dalle fibre del cinetocore verso i due poli opposti della cellula. Il movimento dei cromosomi è possibile grazie ad un complesso enzimatico che si associa al centromero: la proteina motrice dineina trasporta il cromosoma lungo il microtubulo, mentre l’enzima catastrofina distrugge il microtubulo che rimane dietro al cromosoma. In questo modo, le fibre del cinetocore si accorciano e i cromosomi si spostano verso gli estremi della cellula (dove ci sono i centromeri). Telofase E’ caratterizzata dalla riscostruzione dei nuclei figli ed è accompagnata da una serie di processi che procedono in senso inverso a quelli della profase: i cromosomi si despiralizzano e formano l’eucromatina del nucleo interfasico, si riforma la membrana nucleare, ricompaiono i nucleoli. La telofase si conclude con la citodieresi. La cellula si divide al centro formando due cellule figlie identiche alla cellula madre ma più piccole. Questo avviene grazie ad un anello di actina creatosi al centro della cellula madre che contraendosi stringe la cellula al centro; a questo punto proteine specializzate operano la fusione e la separazione della membrana in punti specifici e le due cellule si separano completamente. Meiosi E’ un processo di divisione che riguarda solo le cellule germinali degli animali e le piante a riproduzione sessuata. La caratteristica principale della meiosi è la sequenza di 2 divisioni cellulari precedute da 1 sola duplicazione del DNA. Questo causa un dimezzamento del corredo cromosomico. La meiosi è necessaria per Biologia 15 – Ciclo cellulare, mitosi e meiosi 2 la formazione dei gameti che devono necessariamente essere aploidi per generare con successo uno zigote diploide. Prima divisione La prima divisione si suddivide in 5 fasi: interfase, profase, metafase, anafase, telofase. Interfase Durante questo stadio la cellula provvede alla duplicazione di tutte le strutture cellulari (DNA, mitocondri, centrioli, ribosomi, etc) che saranno distribuite nelle cellule figlie. La durata dell’interfase è di 20-30 ore. Profase Questa fase è simile alla profase mitotica per gli eventi che riguardano la membrana nucleare, il RER e il Golgi, ma differisce per i fenomeni che avvengono ai cromosomi nel nucleo: Leptotene: i cromosomi terminano la loro spiralizzazione. Zigotene: i cromosomi si accorciano, si ispessiscono e i due omologhi si appaiano longitudinalmente (punto per punto). Fanno eccezione i cromosomi X e Y che, non essendo omologhi, si uniscono in maniera termino-terminale (cioè appaiando solo le regioni estreme dei bracci). Pachitene: i cromosomi continuano ad accorciarsi ed ispessirsi e diventano evidenti sotto forma di “coppie di omologhi”, dove ogni coppia è formata da 4 cromatidi, due per ciascuno dei due omologhi. Durante questo stadio si verifica il “crossing-over”, ossia l’interscambio tra due cromosomi omologhi di ciascuna coppia. L’interscambio comporta traslocazione di parti di DNA (geni) da un cromosoma ad un altro. Diplotene: i cromosomi omologhi cominciano a separarsi, ma la separazione non è completa in quanto i cromosomi restano uniti nei punti in cui è avvenuto il crossing-over (chiasmi). Diacinesi: i cromosomi si separano completamente; scompare la membrana nucleare e si forma il fuso mitotico. Metafase Durante questa fase le coppie di cromosomi omologhi si allineano sul piano equatoriale, rivolgendosi coi centromeri verso i poli della cellula (dove sono i centrioli). E’ praticamente sovrapponibile alla metafase mitotica. Anafase Gli omologhi di ciascuna coppia si allontanano e migrano verso i poli opposti della cellula. Non avviene la separazione dei cromatidi fratelli, quindi ogni cellula figlia riceverà un cromosoma formato da due cromatidi fratelli (invece nella mitosi ogni cellula figlia riceve due cromatidi singoli). Telofase E’ sovrapponibile a quella della mitosi: riscostruzione della membrana nucleare, despiralizzazione dei cromosomi, ricomparsa dei nucleoli, etc. La telofase si conclude con la citodieresi (divisione del citoplasma). In questo caso, però, diversamente dalla mitosi, le due cellule figlie non hanno una copia identica del corredo cromosomico materno. Ad ognuna è toccato solo uno dei due omologhi della cellula di partenza (invece alla fine della mitosi ogni cellula figlia riceve un cromatide da ogni cromosoma della cellula madre). In questa fase perciò, le cellule sono ancora diploidi. Seconda divisione Si articola in 4 fasi: profase, metafase, anafase, telofase. L’interfase viene saltata e pertanto il DNA non viene replicato. Le due cellule figlie avranno perciò un corredo cromosomico aploide. Nell’anafase di questa divisione avviene la separazione dei cromatidi fratelli con un meccanismo analogo alla mitosi. Ciclo cellulare Il ciclo cellulare è la serie di eventi che avvengono, in una cellula eucariote, tra una divisione cellulare e quella successiva. Esso comprende due fasi essenziali: l’interfase e la fase di divisione cellulare (o fase M o fase della mitosi). L’interfase, a sua volta, comprende tre sotto-fasi: G1, S e G2 (descritte sopra). Quando la fase G1 si protrae a lungo viene definita G0, cioè fase di riposo (quiescenza) o di attesa. Biologia 15 – Ciclo cellulare, mitosi e meiosi 3 La fase M è a sua volta composta da due processi: la mitosi, durante la quale i cromosomi della cellula sono divisi tra le due cellule figlie e la citodieresi, che comporta la divisione fisica del citoplasma della cellula. La durata del ciclo cellulare è molto variabile (in un fibroblasto in coltura dura 24h). La fase più variabile del ciclo cellulare è la G1. Nelle prime fasi di sviluppo embrionale spesso i cicli sono rapidi con G1 e G2 quasi assenti: avviene solo una veloce alternanaza tra fase S e mitosi (oganelli, macromolecole e strutture cellulari sono già presenti perchè precedentemente accumulate nel citoplasma della cellula uovo). Popolazioni cellulari In base alla loro capacità di crescere e dividersi, le cellule possono essere distinte in: Cellule che hanno perso definitivamente la capacità di dividersi. Sono dette anche popolazioni cellulari statiche. Si tratta di cellule altamente differenziate, che hanno perso definitivamente la capacità di replicarsi. Appartengono a questa categoria le cellule nervose. Cellule che hanno perso temporaneamente la capacità di dividersi. Sono dette anche popolazioni cellulari in espansione. Si tratta di cellule che proliferano durante la fase di accrescimento corporeo ma cessano di farlo al termine di questo; nel caso, però, di eventi che portano a distruzione cellulare, queste cellule possono rigenerare. Appartengono a questa categoria le cellule del fegato, quelle dell’osso, delle ghiandole, etc. Cellule che continuano a dividersi. Sono dette anche popolazioni cellulari dinamiche. Sono cellule dotate di intensa attività proliferativa, allo scopo non di espandere il tessuto di appartenenza (come le cellule tumorali) ma di sostituire gli elementi che di esso vengono distrutti. Appartengono a questa categoria le cellule dell’intestino, della pelle, dei testicoli, le cellule staminali, etc. Cellule staminali Si dicono staminali le cellule che mantengono uno stadio costante di indifferenziamento (a meno che non subentrino fattori esterni) e che mostrano un’altissima frequenza di mitosi. Durante la vita embrionale sono la principale popolazione cellulare. Dopo la vita embrionale fungono da elementi di rimpiazzo. La divisione di una cellula staminale si dice asimmetrica: delle due cellule figlie, solo una rimane staminale, mentre l’altra inizia il percorso di differenziamento. Esistono varie classi di cellule staminali: Embrionali: sono isolate dalla blastocisti. Sono totipotenti (possono differenziarsi in qualunque tipo di tessuto). Indotte: sono generate artificialmente con la tecnica della clonazione riproduttiva (si ottiene una blastocisti con cellule totipotenti trapiantando il nucleo di un fibroblasto in un ovocita. Il problema principale è riattivare i 20'000 geni inattivi nel fibroblasto). Un altro modo in cui si può indurre plupripotenzialità in una cellula esprimendo 4 geni (Oct, Sox-2, c-myc e Kfl4). Il problema di questo metodo è che molte di queste cellule diventano tumorali (c-myc e Kfl4 sono oncogeni). Adulte: si trovano nei tessuti proliferanti. Generano cellule che si replicano velocemente (progenitori di transito), che subito perdono la capacità staminale differenziandosi in progenitori che daranno il via ad un’unica linea cellulare. Esempio: cellula mesenchimale pre osteoblasto osteoblasto. Biologia 15 – Ciclo cellulare, mitosi e meiosi 4 Regolazione del ciclo cellulare La progressione del ciclo è sottoposta ad un rigido controllo: la transizione da una fase alla successiva avviene solo dopo la verifica dei segnali boichimici indicativi di condizioni sia intracellulari che extracellulari (controlli intrinseci ed estrinseci). Negli organismi unicellulari conta soprattutto la condizione ambientale (nutrienti), mentre nei pluricellulari sono importanti anche segnali chimici da altre cellule (mitogeni, fattori di crescita, di sopravvivenza, …). I principali checkpoint del ciclo cellulare sono quattro: transizione G0 G1, transizione G1 S, transizione G2 M e il checkpoint dell’anafase. Il macchinario molecolare che regola il ciclo cellulare è un sistema indipendente che si basa sul ritmico alternarsi di sintesi e degradazione delle cicline. Si tratta di proteine regolatrici, prodotte in determinate fasi del ciclo che associandosi ad enzimi CdK (Cicline dependant kinase) formano il complesso MPF (maturation promoting factor). Tale complesso è la chiave per il superamento dei checkpoint: viene prodotto solo se tutte le condizioni sono soddisfatte e induce il passaggio alla fase successiva. Per ogni fase del ciclo cellulare si forma un determinato complesso CdK-ciclina. L’attività di CdK è regolata: Dai livelli di ciclina, infatti una CdK da sola non può funzionare se non viene prodotta la sua ciclina. Le CdK sono sempre presenti nella cellula, ma è la ciclina ad attivarle. Quindi anche se la CdK per una certa fase del ciclo viene prodotta continuamente, si attiverà solo quando verrà sintetizzata anche la sua ciclina. Da un pattern di fosforilazione/defosforilazione sulla CDK stessa operato da altri enzimi regolatori. Se defosforilato, il complesso è poco attivo. L’enzima CAK opera una fosforilazione su di esso portandolo allo stato monofosforilato completamente attivo. L’enzima Wee1 invece agisce iperfosforilando la forma attiva, causandone lo spegnimento. Tale reazione può essere invertita dall’enzima Cdc25. L’attivazione completa è favorita con meccanismo a feedback positivo innescato dalla formazione stessa del complesso CdK-ciclina (in altre parole ogni complesso creato andrà ad attivare altri suoi simili ancora inattivi). L’attività delle CdK-cicline può essere bruscamente spenta ubiquitina-proteasoma-dipendente della ciclina. La ubiquitinazione della ciclina è indotta da enzimi regolatori. Di solito, un complesso CdK ciclina provvede a far distruggere il complesso della fase precedente. Inibitodri delle ciclin-chinasi (CKI), si tratta di regolatori prodotti in seguito a segnali interni (lesioni al DNA) o esterni (ormoni, fattori di crescita, contatto fisico con altre celule) al fine di interrompere il ciclo se si presentano eventi avversi. Vengono prodotti di continuo, ma se non c’è danno vengono degradati in breve tempo (via ubiquitina-proteasoma). Biologia 15 – Ciclo cellulare, mitosi e meiosi 5 Transizione G0 G1 Questa transizione avviene in cellule momentaneamente quiescienti che decidono di entrare in mitosi (come nelle popolazioni cellulari dinamiche). La serie di eventi che avvengono è la seguente: 1. La cellula in fase G0 riceve fattori di crescita che legano recettori presenti sulla membrana. Molti di questi recettori sono delle tirosin chinasi (enzimi che attaccano un fosfato alla tirosina di una proteina bersaglio). 2. I recettori agiscono fosforilando una proteina trasduttrice chiamata RAS. Questa è normalmente legata ad una molecola di GDP, ma quando viene fosforilata, scambia il GDP con un GTP preso dal citoplasma. Questo scambio attiva RAS che agisce forsforilando una chinasi chiamata Raf. Subito dopo RAS si disattiva scambiando il GTP col GDP. 3. Raf attivata fosforila un’altra chinasi chiamata MEK. 4. MEK attivata fosforila un’altra chinasi chiamata ERK. 5. ERK attivata fosofrila due fattori di trascrizione chiamati c-fos e c-jun. 6. C-fos e c-jun formano un eterodimero che lega il DNA a livello del gene della ciclina D ed avvia la trascrizione e la traduzione di questa molecola. 7. La ciclina D lega le CdK4/6 e i suoi effetti causano l’avvio della fase G1. Nel loro insime le chinasi Raf, MEK ed ERK vengono chiamate anche MAP-chinasi (Mitogen Associated Protein kinase). Transizione G1 S Questa transizione viene operata dal complesso CdK4/6-ciclina D e rappresenta la sua ultima azione prima di essere degradato. 1. Il complesso CdK4/6-ciclina D verifica che il DNA sia integro e pronto per la replicazione e controlla che nell’ambiente extracellulare siano presenti i segnali giusti. Se questa verifica avviene con successo, il complesso fosforila la proteina pRB. 2. pRB (proteina del retinoblastoma) normalmente lega il fattore di trascrizione E2F e lo inattiva. Inoltre richiama la istone deacetilasi (HDAC) che spiralizza il DNA contente i geni attivati da E2F (ciclina E). Quando viene fosforilata, però, pRB si stacca da E2F. 3. E2F libero dall’inibizione di pRB può avviare la trascrizione dei geni per passare alla fase S. Il più importante è quello della ciclina E. 4. La ciclina E prodotta lega la sua CdK2 e forma con essa il complesso che guiderà la fase S. La sua prima azione è la degradazione del complesso CdK4/6-ciclina D. Transizione G2 M Questa transizione viene operata dal complesso CdK2-ciclina A attivando il complesso CdK1-ciclina B che inizierà gli eventi della mitosi vera e propria. Questo passaggio però avviene solo se si rispetta una condizione fondamentale: l’integrità del DNA appena prodotto. 1. La chinasi ATM verifica se ci sono delle errori nel DNA. ATM è un anello che viagga lungo tutta la doppia elica. Un eventuale errore nel filamento causa un non appaiamento delle basi e quindi uno slargamento della doppia elica. Se ATM va a sbattere contro uno slargamento, si attiva e fosforila la chinasi ChK2. 2. ChK2 (Checkpoint Kinase 2) agisce in due modi: a. Fosforila Cdc25 inattivandolo. Questo causa l’impossibilità ad attivare i complessi CdK2ciclina A spenti dalla fosforilazione. Come effetto, CdK2-ciclina A diminuisce in quantità. b. Impedisce la distruzione di p53, il guardiano del genoma. Normalmente p53 viene prodotta e distrutta in breve tempo, ma se c’è un errore nel DNA, la sua vita viene allungata proprio grazie a ChK2. Questa proteina ha molti effetti: Avvia la sintesi di p21 che blocca l’attività di CdK2-ciclina A fermando il ciclo cellulare. Avvia la produzione di enzimi per riparare il DNA. Se il DNA non viene riparato entro un certo tempo, p53 continua ad essere prodotta e si accumula nel nucleo. L’accumulo di p53 manda la cellula in apoptosi per via intrinseca. Biologia 15 – Ciclo cellulare, mitosi e meiosi 6 Se la chinasi ATM non riscontra errori nel DNA, la CdK2-ciclina A attiva la CdK1-ciclina B e comincia così la fase M. La verifica dell’integrità del DNA nella transizione G1S viene svolta da molecole simili ad ATM ed anche qui in caso di errore viene richiamata all’attività p53 che induce la morte cellulare se il danno non può essere riparato Checkpoint anafase All’inzio dell’anafase, la CdK1-ciclina B controlla l’integrità del fuso mitotico. Se il fuso non presenta problemi, il complesso enzimatico attiva il APC (Anaphase promoting complex) che slega la securina dalla separasi. In questo modo i cromatidi fratelli possono separarsi. Danno al DNA e sistemi di riparazione Le cellule possiedono dei sistemi di riparazione per limitare danni e allo stesso tempo garantire una certa variabilità genetica. Mutazioni del DNA sono particolari perchè se colpiscono le cellule germinali saranno trasmesse a progenie, mentre se avvengono nelle cellule somatiche possono dare neoplasie e/o invecchiamento cellulare cellulare precoce. Gli agenti in grado di causare mutazioni sono detti mutageni. Sono mutageni fisici le radiazioni ionizzanti (agiscono rompendo il DNA) e le radiazioni UV (agiscono formando dimeri di timina, cioè facendo legare due timine tra loro vicine invece che con le adenine sul filamento opposto). Sono mutageni chimici gli agenti alchilanti (aggiungono radicali alchilici alle basi), gli agenti idrossilanti (aggiungono radicali ossidrilici alle basi) e gli analoghi delle basi (molecole simili alle basi, ma che non sono basi, che si inseriscono nel DNA causando appaiamenti imprecisi). Tra i vari sistemi di riparazione i più importanti sono: La riparazione diretta dei dimeri di timina ad opera dell’enzima DNA-fotoliasi (attivato da luce) che riconosce dimeri di pirimidina indotti dalla luce ultravioletta e taglia l’anello ciclobutanicoche si forma tra le timine adiacenti. La riparazione diretta di basi alterate che avviene grazie ad enzimi che trasferiscono il gruppo alchilico o ossidrilico dalla base alterata su un proprio residuo di cisteina (omocisteina metionina). La riparazione per escissione di basi di cui esistono 3 varianti: o Riparazione mediata da glicosilasi: taglia via la base anomala si crea un sito apurinico/apirimidinico (AP), cioè senza base, riconosciuto come anomalo e tagliato da una AP endonucleasi si crea un vuoto colmato poi dalla DNA polimerasi III. o Incisione del DNA a monte e a valle del dimero di timina si crea una interruzione poi colmata da DNA polimerasi III e ligasi. o Riparazione delle rotture a doppio filamento sul DNA (causate da radiazioni ionizzanti, agenti chemioterapici e radicali liberi prodotti dal metabolismo cellulare) riparate da un sistema enzimatico specifico (NHEJ) che risalda le estremità appaiandole in modo corretto. Biologia 15 – Ciclo cellulare, mitosi e meiosi 7
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