DNA ... La scoperta 1869 La scoperta del DNA è stata attribuita al ricercatore svizzero Friedrich Miescher. La storia racconta che già nel 1869 il DNA fu isolato dallo svizzero Friedrich Miescher che osservò una sostanza microscopica in bende chirurgiche utilizzate, dandole il nome di nucleina, poiché tale molecola era stata localizzata nel nucleo. 1919 Phoebus Levene nel 1919 scoprì la struttura dei nucleotidi, formati da base azotata, fosfato e zuccheri. Levene sostenne per la prima volta che il DNA è un filamento di nucleotidi legati tra loro tramite fosfati. Levene maturò anche la convinzione che tale filamento fosse corto e che le basi fossero disposte secondo un costante ordine ripetuto. 1928 L'esperimento di Frederick Griffith del 1928 fu uno dei primi esperimenti a suggerire che i batteri sono in grado di trasferire informazioni genetiche attraverso un processo noto come trasformazione. In tal modo, esso aprì la strada alla determinazione di quale fosse la natura del materiale genetico. 1937 Trascorrono quasi venti anni prima che William Astbury, nel 1937, possa presentare alla comunità scientifica i primi risultati dei suoi studi sulla diffrazione a raggi X, i quali dimostrano che il DNA ha una struttura sistemica molto regolare. 1943 L'esperimento di Oswald Theodore Avery e dei suoi colleghi Colin MacLeod e Maclyn McCarty, rappresenta una delle esperienze fondamentali per l'avanzamento delle conoscenze nel campo della genetica e della biologia molecolare. Tramite l'esperimento gli scienziati riuscirono a dimostrare che il cosiddetto principio trasformante (ovvero il portatore di informazioni geniche) scoperto nel 1928 da Griffith in seguito al suo famoso esperimento era il DNA. 1952 L'esperimento di Alfred D. Hershey e Martha Chase prova definitivamente nel 1952 che il materiale genetico è costituito da DNA e non da proteine. In seguito a questi risultati incontrovertibili anche gli scienziati che avevano criticato esperimenti precedenti, si convincono dell'importantissimo ruolo biologico del DNA. 1951-52 Chargaff formula due regole: 1) Esiste un rapporto 1:1 tra le basi puriniche (A+G) e le basi pirimidiniche (T+C) contenute nel DNA di una cellula. Il rapporto è costante in tutte le specie. 2) in una molecola di DNA a doppio filamento la concentrazione di adenina eguaglia quella di timina e la concentrazione di citosina quella di guanina (%A = %T; %C = %G). Questa ultima semplice regola è stata uno degli elementi essenziali che hanno permesso la formulazione del modello di DNA da parte di James Watson e Francis Crick. Grazie anche a questa regola si sono dedotte le corrette forme di appaiamento delle basi tra i due filamenti del DNA. 1953 Nel 1953 i due scienziati ipotizzano che il DNA si componga di due catene di nucleotidi disposte a formare una doppia elica. Ciascuna purina, composta da due anelli, si trova di fronte ad una pirimidina, composta da un singolo anello. L'adenina (A) si lega alla timina (T) mentre la citosina (C) si lega alla guanina (G), in accordo con i risultati di Chargaff. I legami tra le basi puriniche e pirimidiniche avvengono tramite ponti idrogeno. Watson e Crick costruirono diversi modelli di DNA, con cartone e fil di ferro, cercando di far combaciare tutte le informazioni che avevano a disposizione. Costruirono il modello basandosi su un bozzetto di Odile Speed, moglie di Crick, che lo aveva disegnato seguendo le istruzioni del marito: il bozzetto compare sulla rivista scientifica Nature il 25 aprile del 1953 quando la struttura a doppia elica viene presentata per la prima volta. Estrazione del DNA dalle cellule di pomodoro L’obiettivo di questa esperienza è quello di osservare il DNA dopo averlo estratto dalla cellula. Il campione biologico di partenza è il pomodoro. Materiale occorrente: Pomodori Sale fino da cucina Detersivo per piatti Succo di limone Alcol per liquori L’esperienza si articola in tre fasi: 1. Demolizione struttura cellulare e digestione proteine: in questa prima fase sminuzziamo 100g di pomodoro in modo da rompere la struttura del frutto, quindi demoliremo pareti e membrane cellulari. Permetteremo al DNA di uscire dalla cellula e di srotolarsi senza perdere la struttura ad elica. Successivamente distruggeremo le proteine attorno alle quali il filamento di DNA si avvolge e che gli permettono di mantenere la sua struttura ( gli istoni). 2. Filtrazione del miscuglio per ottenere l’estratto di DNA in soluzione : in questa fase si deve filtrare il miscuglio cellulare per ottenere un estratto in cui il DNA è libero in soluzione. 3. Precipitazione del DNA disidratato : a questo punto il DNA sarà visibile sfruttando la sua proprietà di precipitare in alcool etilico. L’alcool etilico disidrata il DNA e lo rende insolubile. Il DNA si addenserà e apparirà come una gelatina trasparente o biancastra Procedimento 1. Demolizione struttura cellulare e digestione proteine: Frullare circa 100g di polpa di pomodoro o frutta Prepariamo la soluzione di estrazione del DNA mettendo nel barattolo più grande: Una punta di cucchiaino di sale 5ml di detersivo per piatti 25ml di acqua 20ml di succo di limone Il cloruro di sodio rompe il legame tra gli istoni e il DNA, il succo di limone distrugge le proteine, mentre il detersivo rompe le membrane cellulari e nucleare. Versare la soluzione di estrazione sul frullato e mescolare bene. Lasciare agire per 5/10 minuti. 2. Filtrazione del miscuglio per ottenere l’estratto di DNA in soluzione Filtrare con imbuto e carta assorbente la polpa (togliere eventuale schiuma) 3. Visualizzazione del DNA Prelevare 5 ml di filtrato con una pipetta contagocce e porlo in un barattolo Aggiungere 5 ml di alcool etilico 95% freddo (tenuto in frigo) facendolo colare lungo le pareti del barattolo molto lentamente: l’alcool e il filtrato non si devono mescolare, l’alcool meno denso si stratifica sul filtrato; si noteranno quindi due fasi, non scuotere ma agitare delicatamente. Si formeranno bollicine di gas al contatto alcool freddo/filtrato poi si osserverà la formazione di una sostanza trasparente gelatinosa che man mano aumenta e assomiglia a una medusa. L’alcool disidrata il DNA e lo trasforma in una sostanza gelatinosa e filamentosa.
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