26/03/14 14. I nucleosomi contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale Ogni cellula con,ene circa 2 metri di DNA Diametro nucleo = 5 – 8 μm Come organizzare il DNA? Il DNA nucleare si distribuisce nei CROMOSOMI 3,2 x 109 coppie di nucleo2di distribuite in 24 cromosomi 1 26/03/14 Compattamento del DNA nei cromosomi a) b) c) d) e) contenimento nel ristretto spazio cellulare (o virale) protezione da possibili danni maggiore stabilità per una corretta espressione dell’informazione Efficiente trasmissione alle cellule figlie organizzazione strutturale di ordine superiore: facilita l’espressione genica e la ricombinazione omologa, che genera la diversità individuale DNA + proteine (> parte istoni) = cromatina DNA viene compattato di ≈ 10.000 volte (da cm a μm) Diversi stadi 1) associazione DNA-‐istoni => nucleosoma 2) associazione fra nucleosomi vicini Compattamento => < accessibilità per le proteine => < metabolismo del DNA. 2 26/03/14 Le molecole di DNA sono fortemente compattate Vi sono 3 livelli di ripiegamento: 1. Nucleosomi (11 nm) 2. Filamenti da 30 nm 3. Anse radiali. Nucleosoma: Unità d’impacchettamento della cromatina 3 26/03/14 Gli ISTONI sono le proteine più abbondanti associate al DNA eucariotico 5 tipi: H2A, H2B, H3, H4 (core del nucleosoma) H1 (lega il DNA linker fra 2 nucleosomi) proteine basiche, cioè cariche positivamente (> 20% di lisina e arginina) PM 11-‐15 KDa (H1 è 20 kDa) formati da un dominio ben conservato, detto histone-‐fold, formato da 3 α-‐eliche separate da 2 loop non strutturati Coda N terminale Histone fold Tutto l’istone H1 può essere rimosso senza alterare la struttura del nucleosoma, il che suggerisce che si trova all’esterno della particella Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 4 26/03/14 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 Dei 6 nm di altezza del cilindro, 4 sono occupati dai due avvolgimenti di DNA (200 paia di basi). Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 5 26/03/14 • Ci vogliono 80 paia di basi per fare un giro attorno all’ottamero – due regioni di DNA che siano separate di 80 paia di basi nella doppia elica in soluzione si trovano invece una vicina all’altra sulla superficie del nucleosoma • conseguenze funzionali Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 I singoli nucleosomi possono essere ottenuti trattando la cromatina con ENDONUCLEASI MICROCOCCICA: taglia il DNA alla giunzione tra i nucleosomi Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 6 26/03/14 Il DNA è associato ai nucleosomi in maniera compatta Se il DNA fosse associato all’ottamero in maniera blanda una breve digestione con la nucleasi produrrebbe tutti frammenti da 200 paia di basi. Invece si genera una scaletta •+ del 95 % del DNA viene recuperato sotto forma della scala da 200 bp • Frazionamento su gradiente di saccarosio dimostra che monomeri, dimeri ecc. di istoni legati al DNA: nel nucleo c’è ben poco DNA libero tra un istone e l’altro. • La scaletta è considerata prova che il DNA è associato a istoni • + del 90% del DNA del nucleo è assemblato su istoni Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 Organizzazione dell’ottamero di istoni 7 26/03/14 H32*H42 Nocciolo centrale 1 dimero H2A*H2B Visibile dall’alto Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 8 26/03/14 Tramite le loro cariche + gli istoni si legano alla porzione zucchero-‐fosfato del DNA carico -‐ 9 26/03/14 Tutti e 4 gli istoni del nucleo stabiliscono contatti con il DNA: RIPIEGAMENTO ISTONICO Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 14 siti di contatto 140 legami idrogeno 10 26/03/14 Posizioni code non ben definite ma sembra comunque che code di H3 e H2B passano tra I giri della superelica di DNA coda di H4 sembra stabilire contatti con un dimero H2A-‐H2B Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 Le code N-‐terminali degli istoni sono modificate Transitorie ma in grado di cambiare le proprietà funzionali degli ottameri Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 11 26/03/14 La replicazione separa i filamenti di dna, quindi deve distruggere il nucleosoma, ma i nucleosomi si riformano immediatamente Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 1 2 In che modo gli istoni si associano al DNA per generare i nucleosomi? 2 vie Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 12 26/03/14 Non avviene Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 13 26/03/14 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 da 1,1 m X 2 nm a circa 16 cm X 11 nm 14 26/03/14 fibra da 10-‐11 nm E’ una fila continua di nucleosomi. • Si ottiene in condizioni di bassa forza ionica e non necessita della presenza dell’istone H1. • Non è chiaro se questo genere di struttura esiste in vivo (nel nucleo della cellula) oppure se si genera in vitro come conseguenza della procedura di estrazione della cromatina. POSIZIONAMENTO dei NUCLEOSOMI Disposizione dei nucleosomi su sequenze definite del DNA, anzichè in siti casuali rispetto alla sequenza Competizione tra gli istoni e le proteine sequenze specifiche 15 26/03/14 Il nucleosoma richiede almeno 146 bp per formarsi Alcune proteine legano il nucleosoma e ne condizionano il posizionamento Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 Esperimento per determinare la posizione rela,va di un punto ben definito del DNA rispeAo al nucleosoma 16 26/03/14 Se i nucleosomi non si trovano in un’unica posizione Sito di restrizione si trova in tutte le possibili posizioni nelle diverse copie del genoma Enzima di restrizione taglia in corrispondenza di un sito bersaglio (rosso) e nucleasi in corrispondenza delle giunzioni tra nucleosomi (Blu) Si hanno Diversi frammenti da 1,1 m X 2 nm a circa 16 cm X 11 nm 17 26/03/14 Nucleosoma ≅ 200 bp (146 DNA core+60 DNA linker) Ogni giro d’elica contiene 10,5 bp ñ 200 bp/10,5 bp = 20 passi d’elica Ogni passo d’elica = 3,4 nm ñ 20 x 3,4 nm = 68 nm 68 nm/ 11 nm = 6 ñ Fattore d’impaccamento Il ruolo dell’istone H1 L’H1 interagisce sia con una porzione centrale del DNA core che con ~20 bp di uno dei due DNA linker, facendo aumentare la lunghezza di DNA arrotolato. 18 26/03/14 L’H1 induce i nucleosomi a raggrupparsi in un insieme ripetitivo ed ordinato Per formare la fibra di 30 nm Il legame di H1 aumenta il compattamento del DNA sul nucleosoma, imponendo una costrizione sugli angoli di entrata e uscita del DNA dal nucleosoma. 19 26/03/14 L’istone H1 media la formazione della fibra da 30 nm L’aggiunta di H1 stabilizza una struttura cromatinica di ordine superione: la fibra da 30 nm Sono stati proposti due modelli alternativi per illustrare la formazione di questa struttura: i) modello a soleneoide 6 nucleosomi/giro DNA linker parte della superelica e non attraversa mai l’asse del solenoide. ii) modello a zig-‐zag differisce dal precedente per la diversa posizione del DNA linker, che attraversa l’asse longitudinale della fibra. fibra da 30 nm • In condizioni di maggiore forza ionica la cromatina appare come una fibra da 30 nm. • Per ottenere questa struttura è necessaria la presenza dell’istone H1. • La fibra si avvolge su se stessa, con una periodicità di 6 nucleosomi per ogni giro, che corrisponde ad un rapporto di condensazione di 40 • La fibra da 30 nm è la struttura di base sia della cromatina interfasica che di quella mitotica. Probabilmente l’orientamento dei nucleosomi All’interno della fibra è quello del solenoide: i nucleosomi sono ruotati di 60° uno rispetto all’altro. L’istone H1 è probabilmente localizzato all’interno. Non conosciamo in dettaglio le strutture di ordine superiore in cui la fibra da 30 nm si organizza nel nucleo interfasico e nel cromosoma mitotico. 20 26/03/14 Le code istoniche contribuiscono alla formazione della fibra da 30 nm mediando interazioni (legami a idrogeno) tra nucleosomi adiacenti. istoni del core privi di code non sono in grado di formare fibre da 30 nm Le proteine istoniche mostrano un elevatissimo livello di conservazione per tutta la loro lunghezza. 21 26/03/14 L’impaccamento della cromatina sui nucleosomi: 6 volte: da 1 m a 16 cm nelle fibre da 30 nm: 40 volte: 1 m a 2.5 cm molto lontano dall’impaccamento necessario (10.000-‐100.000 volte) per contenere il DNA nel nucleo. Strutture di ordine superiore della cromatina Il modello strutturale più accreditato realizza questo compattamento attraverso la formazione di anse (40-‐90 kbp) bloccate alla base da una struttura proteica denominata scaffold nucleare topoisomerasi II e proteine SMC (Structural Maintenance of Chromosome) sono componenti essenziali dello scaffold nucleare. 22 26/03/14 Il terzo meccanismo di compattamento del DNA prevede la formazione di domini ad anse radiali I filamenti da 30 nm si associano ad un’impalcatura di proteine non istoniche a formare le anse radiali. 23 26/03/14 il DNA di un cromosoma è quindi un filamento continuo, in piccola parte aderente allo scaffold proteico, in misura maggiore espanso lateralmente in loops. 24 26/03/14 5 avvolgimenti della doppia elica La compressione del DNA avviene a più livelli nucleosoma fibra da 30 nm fibra ad ansa fibra da 700 nm :cromatina si superavvolge (diametro dei singoli cromatidi) fibra da 1400 nm: livello di condensazione massimo (cromosomi mitotici) 25
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