Plasmidi 0- 10 kb Fago lambda (di inserzione) 0

Plasmidi
0-
10 kb
Fago lambda (di inserzione)
0-
15 kb
Fago lambda (di sostituzione)
9-
23 Kb
30-
45 Kb
Cosmidi
Batteriofago P1
PAC
BAC
70- 100 Kb
130- 150 kb
70-
200 kb
YAC
200- 2000 kb
MAC
~ 1000 kb
1
Vettori plasmidici
pBR322
pUC18
2
Cloning
3
Genoma di λ
le 4 forme del genoma di λ
4
Genoma di λ
Ciclo litico ⇒ cro ⇒ soppressore di cl
Ciclo lisogeno ⇒ soppressore cl ⇒ sopprime trascrizione
di altri geni di λ + cro
5
Clonaggio
6
Plasmide chimerico
7
Cosmide (Vettore ibrido)
* La miscela di concatenameri è complessa e può contenere:
» vettori senza inserto,
» inserti multipli consecutivi,
» vettori multipli senza
inserto.
 si possono ottenere false particelle fagiche  no DNA ricombinante
Per ciascuna infezione  104- 5x105 colonie infettate/µg DNA
8
di inserto utilizzato
Vettori Cosmidici
Del plasmide possiede:
  funzione replicativa,
  polylinker,
  marcatori che ne permettono la selezione.
Del fago λ possiede:
  Le estremità coesive cos ,
 ∼ 250bp assicurano la giunzione cos (sequenze necessarie per il legame e per il
taglio della terminasi)
Inserti fino a 45-50Kb
Vettori basati sul batteriofago P1
(plasmide Ad10 con vari elementi del genoma di P1)
 Impacca il suo DNA in un capside che può contenere
 115 Kb di DNA inserto
 usando sistemi di impaccamento in vitro del fago T4
 inserti fino a 122 KB
9
PAC (basato sul batteriofago P1)
Pac  sito di impacchettamento di P1
2 siti loxP  siti normalmente riconosciuti dalla ricombinasi del fago
Proteina cre  prodotta dal dal gene cre presente nel genoma di E. coli (cellula ospite)
Vettore digerito con due enzimi di restrizione  DNA genomico inserito nel sito
della tetraciclina (BamHI)
10
PAC  vettore plasmidico con elementi di P1
Impaccamento
Estratti di impaccamento di P1:
  pacasi  taglia il DNA ricombinante
nel sito pac
 coopera con l estratto (t+c),
inserendo il DNA nella testa, a partire
dal sito pac (max 115-120kb)
Si infetta un ceppo di E. Coli cre+:
 il prodotto del gene cre (ricombinasi)
agisce sui siti loxP, promuovendo la
circolarizzazione del plasmide.
Cloni ricombinanti  Kanamicina
11
Vettori BAC
(Bacterial Artificial Chromosome)
12
GENI REGOLATORI
  ori S e rep E: mediano la replicazione unidirezionale del fattore F
  par A e par B: mantengono il nr. di copie al livello di 1 o 2/genoma di E. coli
  Cos N e lox P  possono generare estremità (taglio specifico con terminasi di λ)
utili per:
 mappature di restrizione dell inserto,
 costruire contigui di cloni.
13
Vettori basati su YAC (Yeast Artificial Chromosome)
VANTAGGI:  si possono clonare sequenze eucariotiche con un organizzazione
genomica di tipo ripetitivo
 frammenti di DNA  2 Mb
SVANTAGGI:  possibili chimere
 scarsa amplificazione.
 1 YAC/cellula di lievito
Componenti essenziali dei cromosomi di S. cerevisiae (si divide per gemmazione)
a) 
b) 
c) 
centromero
telomeri
ARS  elementi di Sequenza a Replicazione Autonoma (del DNA cromosomico)
In totale  poche centinaia di bp di DNA
 sufficienti perché il cromosoma sia funzionale in vivo nel lievito.
Per costruire uno YAC  combinare 4 corte sequenze
 
2 telomeri
 
1 centromero
 
1 sequenza ARS
Queste 4 sequenze + DNA estraneo, lineare e di adeguate dimensioni
 cromosoma funzionale nel lievito S. cerevisiae
» S. pombe, schizomicete  si divide per fissione  centromero molto più complesso
 la sua funzionalità  assicurata da diverse Kb di DNA.
14
15
Costruzione di uno YAC
Cellule di lievito ospite
AB1380
AB1380
⇒
possiede una mutazione
nel gene ade-2 (cellule rosse)
e alleli recessivi
 per trp1 e ura3
(sistema di selezione)
amp: ⇒ gene per la resistenza all’ampicillina
ori: ⇒ origine di replicazione per la propagazione in E. coli
SUP4: ⇒ gene di un tRNA soppressore che annulla la mutazione
ade-2 (presente nel ceppo di lievito ospite)
TRP1 e URA3 ⇒ servono come sistema di selezione per identificare
le cellule che contengono il vettore YAC
16
Cellula di lievito ospite  AB1380  con gene mut. Ade-2
⇓⇓
colonie rosse (fenotipo mutante)
L introduzione di uno YAC con il gene SUP4 intatto (senza inserto)
 sopprime la mutazione ade-2  colonie incolori
L introduzione di uno YAC con il gene SUP4 interrotto dal DNA clonato
 ripristina il fenotipo mutante  colonie rosse
 Cloni BAC, PAC e YAC sono stati utili per clonare grandi regioni genomiche, per
generare la mappa fisica del genoma umano, identificare geni legati a malattie e per
generare topi transgenici e per studi di espressione.
Problemi per:
espressione genica a lungo termine in cellule umane e terapia genica somatica

potenziale mutazione inserzionale

silenziamento del transgene in seguito ad inserimento nei cromosomi dell ospite
17
HACs  offrono un approccio alternativo
(Human Artificial Chromosomes)
  Replicano e segregano come cromosomi normali, usano le
componenti funzionali della cellula ospite senza integrarsi,
evitando così il problema di un eventuale silenziamento genico
Es: gene di resistenza all igromicina in cellule ibride CHO
  Ci si aspetta un espressione regolata e a lungo termine di
piccoli e grandi loci e ridotti rischi di risposte immunitarie.
18
TOP-DOWN approach
TACF (telomere-associated
chromosome fragmentation)
Sviluppato nel 1991
α   DNA alfoide Y umano
 telomero umano
neo  marker (neomicina)
Usati per frammentare il braccio q
del cromosoma Y per ricombinazione
omologa, tra centr e il DNA alfoide
in cellule ibride uomo-hamster.
Selezione dei cloni + con G418 (antib).
Secondo ciclo di frammentazione con
un diverso vettore target con marker
gpi  guanina-fosforibosil-trasferasi
HAT: Hypoxantine-Aminopterin-Thymidine
Cloni + selezionati per la presenza dei
marcatori in terreno HAT
Usato per cromosoma: X  (0.5 Mb minicromosomi) e Y  (sequenza minima α satellite 100 kb).
Cellule DT 40 (linea di cellule pre-B indotte con virus leucosi)
19
BOTTOM-UP approach
Harrington 1997
Co-transfezione con mix
di sequenze alfoidi umane
sintetiche, telomeri, DNA
genomico e un marcatore in
HT1080 (linea cellulare di
fibrosarcoma).
- DNA alfoide umano è
clonato in un grande
costrutto con marker (neo)
- Cloni stabili neomicina R
selezionati con G418 e
analizzati per la formazione
di HAC
20
TACF (telomere-associated chromosome fragmentation)
a. Sonda  human Cot1
Sonda  EGFP transgene
b. Minicromosoma X umano (~ 500Kb)
in cellule di pollo DT40:
- α-satellite DXZ1
- CENP-C
c-d. HAC in cellule di topo LA-9
c. D17Z1 ibroda con HAC
satellite minor di topo ibrida solo
con centromero di topo.
d. CENP-C ibrida su HAC
21
Due tra i metodi usati per esprimere il gene HPRT
portato da un HAC per complementare cellule
mutate per il gene HPRT.
a.  costrutto di 440kb con αDNA del cr 17
 locus genomico HPRT1 da Xq26.2
 due marcatori neomicina e puromicina.
Usato per trasfettare locus genomico HPRT1
da Xq26.2.
b.  due diversi costrutti
 21 αDNA e locus HPRT1 da Xq26.2
co-trasfettati in locus genomico HPRT1
da Xq26.2
HPRT:
(hypoxhanthine guanine phosporibosyltransferase)
Efficienza 20-80%
HAC stabili per diversi mesi in assenza di selezione
Segregazione accurata nel 98% delle mitosi
22
Macnab and Whitehouse, Gene Therapy, 16:1180-1188, 2009
AC  Artificial Chromosome
BAC  Bacterial Artificial Chromosome
HAC  Human Artificial Chromosome
PAC  P1-derived Artificial Chromosome
YAC  Yeast Artificial Chromosome
23
Kazuki and Oshimura, Molecular Therapy, 19 9, 1591–1601, 2011.
Potential characteristics of human artificial chromosomes (HACs)
b The size
limits
depend on
each vector.
(c,d) Limitations and consequences of gene delivery with conventional vectors such as a virus or plasmid, and
with HACs, respectively.
24
Kazuki and Oshimura, Molecular Therapy, 19 9, 1591–1601, 2011.
An example for the construction of engineered human artificial chromosomes (HACs) via top-down approach
and subsequent gene delivery.
HAC ideale: NON
deve contenere
geni endogeni
del cromosoma
di partenza
Microcell-Mediated
Chromosome Transfer
The Cre-lox system is used as a genetic tool to control
site specific recombination events in genomic DNA.
chicken B cell line DT40  allows efficient gene disruptions due to its high
homologous recombination activity
25
Thus, the resulting 21HAC vector contains four useful features:
(i)  it has a well-defined genetic architecture;
(ii)  it is episomally present, independent of the host chromosomes;
(iii)  it is mitotically stable in human somatic cells in vitro and mouse cells
both in vitro and in vivo; and
(iv) it has a system for safeguarding against tumor formation.
Furthermore,
any desired gene could be cloned into the 21HAC using the Cre-loxP system in
Chinese hamster ovary cells, or by a homologous recombination system in
DT40 cells.
26
Kazuki and Oshimura, Molecular Therapy, 19 9, 1591–1601, 2011.
Schematic diagram of the human artificial chromosome (HAC) vector system for functional
analyses and for the treatment of genetic disorders.
(a) HAC construction with gene(s) of interest.
iPS: induced
pluripotent stem
HSC: hematopoietic
stem cell
MAB: mesoangioblast
mGS: multipotent
germline stem
MSC: mesenchymal
stem cell
27
  Kazuki Y. and Oshimura M.
Human Artificial Chromosomes for Gene Delivery
and the Development of Animal Models
Molecular Therapy, vol. 19 no. 9, 1591–1601 sep. 2011
 Macnab S. and Whitehouse A.
Progress and prospects: human artificial
chromosomes.
Gene Therapy, 16, 1180–1188, 2009
28

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