Università degli Studi di Palermo

Caratterizzazione dei fattori di crescita autologhi nel gel piastrinico
in matrice di fibrina Cascade (PRFM - Platelet Rich Fibrin Matrix)
Richard J. Carroll, PhD1, Steven P. Arnoczky, DVM2, Susan Graham MS, MT (ASCP), SH3 and Sean M. O’Connell, PhD1&4
INTRODUZIONE
I fattori di crescita, rilasciati da piastrine attivate da una lesione, promuovono i processi di guarigione iniziali (bFGF, PDGF, IGF) e tardivi (EGF,
VEGF, TGF-b, IGF) nell'osso e nei tessuti molli.
Sono stati sviluppati molti metodi per originare ed utilizzare questi fattori
di crescita nella forma di plasma ricco di piastrine (PRP) per accelerare i
processi di guarigione. Il PRP viene prodotto normalmente concentrando
le piastrine dal sangue del paziente dopo separazione da altri componeneti
del sangue. Il concentrato piastrinico PRP viene succesivamente mescolato a cloruro di calcio (CaCl2) e trombina bovina in eccesso per formare un
coagulo stabile.
Dosaggio dei fattori di crescita: i livelli dei fattori di crescita rilasciati da
ciascun gel sono stati misurati usando il sistema ELISA R&D Systems,
Minn., MN). Ciascun campione è stato valutato in duplicato e la concentrazione media dei fattori di crescita si è stata calcolata per ciascun intervallo di tempo. I fattori di crescita studiati sono stati: insulin-like growth
factor-1 (IGF-1), epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth
factor (bFGF), platelet-derived growth factor-AB (PDGF-AB) e vascular
endothelial growth factor (VEGF).
Human Growth Factor Expression Over Time – Non “Wash-Out”
250
bFGF
Il sistema Cascade PRFM (PRFM - Platelet Rich Fibrin Matrix) utilizza
una nuova strategia concentrando insieme piastrine e fibrina in una matrice densa senza l'uso di trombina bovina. La mancanza di trombina esogena in eccesso assicura l'integrità delle piastrine durante il processo di produzione evitandone l'attivazione e la degranulazione, ed evitando il rilascio
prematuro dei fattori di crescita. Mentre numerosi studi hanno documentato il rilascio di fattori di crescita da parte dei granuli piastrinici e la loro
efficacia nello stimolare la rapidità dei processi riparativi nell'osso e nei tessuti molli, questo studio (Studio I) è stato approntato per misurare in vitro
il numero, la quantità e la funzionalità nel tempo di specifici fattori di crescita rilasciati dal gel piastrinico (PRFM - Platelet Rich Fibrin Matrix) prodotto con il sistema Cascade.
Nel secondo studio (Studio 2), la cinetica dell'espressione dei fattori di crescita delle piastrine è stata esaminata nel corso dei sette giorni seguenti il
prelievo del sangue in un esperimento di “wash-out”.
Dato che le differenze nella stabilità dei fattori di crescita in soluzione
acquosa-salina poteva compromettere i risultati, lo studio temporale dell'espressione è stato svolto utilizzando a tempi determinati un lavaggio
(“wash-out”) al fine di valutare gli specifici fattori di crescita prodotti in
ciascun momento, senza il contributo dei fattori di crescita presenti prima
di quel momento (carry over).
MATERIALI E METODI (STUDIO I)
VALUTAZIONE IN-VITRO PER UN PERIODO DI SETTE GIORNI DELLE CONCENTRAZIONI DI FATTORI DI CRESCITA NEL
GEL PRFM.
Produzione di PRFM: E' stato usato il sistema Cascade (Cascade Medical
Enterprises, Wayne, NJ) per produrre circa 2cc di PRFM da 9cc di sangue
prelevato. Il procedimento prevede una centrifugazione della provetta separatrice per 6 minuti a 1100g per ottenere il PRP (Platelet Rich Plasma), il
trasferimento del contenuto della prima provetta in una seconda provetta
contente CaCl2. la seconda provetta viene seguente centrifugata per 15
minuti a 1450g per produrre PRFM (Platelet Rich Fibrin Matrix) e siero
residuo.
Progetto: dopo la seconda centrifugazione, alcuni campioni di PRFM vengono sminuzzati con un bisturi e posti in provette in polipropilene contenenti soluzione salina. I campioni vengono divisi in, tre gruppi che sono
incubati a temperatura ambiente rispettivamente per un'ora, 24 ore e 168
ore. Tutti i campioni sono raccolti all'intervallo di tempo appropriato e
conservati a -78° C per la successiva analisi ELISA (Enzyme-Linked
Immuno Sorbent Assay). Per questo studio sono stati utilizzati dieci campioni provenienti da un singolo donatore.
PDGF-AB
200
IGF1/10
VEGF
EGF/2
150
100
50
0
1 Hour
24 Hours
168 Hours
Time Post Second Centrifugation (15’, 1450 x g)
Nota: Le concentrazioni di IGF e EGF devono essere moltiplicate rispettivamente per
dieci e per due per ottenere i livelli reali. La misura della concentrazione di EGF a 168
ore non è stata fatta. Richard J. Carroll, PhD1, Steven P. Arnoczky, DVM2, Susan
Graham MS, MT (ASCP), SH3 and Sean M. O'Connell, PhD1&4
RISULTATI (STUDIO I)
Rilascio dei fattori di crescita nel tempo: la concentrazione degli specifici
fattori di crescita rilasciati in ai tempi staibliti è indicata nel grafico sottostante in picogrammi/mL.
DISCUSSIONE (STUDIO I )
Questi risultati dimostrano che i fattori di crescita rilasciati dal PRFM
(Platelet Rich Fibrin Matrix) sono misurabili nel tempo in-vitro. Sono stati
misurati livelli significativi dei fattori di crescita a partire da un'ora fino a
168 ore. Lo studio dimostra anche che la cinetica e la concentrazione totale varia tra i differenti fattori di crescita studiati.
Alcuni fattori prodotti hanno livelli alti dalla prima ora fino alle 168 ore
(IGF-1), mentre altri hanno livelli bassi inizialmente, per raggiungere livelli alti dopo 24 ore e mantenerli tali per sette giorni (PDGF, VEGF), o altri
sono andati da livelli bassi ad alti per scendere successivamente a livelli più
bassi (bFGF). In termini assoluti i livelli di fattori di crescita hanno variato da un minimo di 10.5 pg/mL (bFGF alla-prima ora) fino ad un massimo di 1.425 pg/mL (IGF-1, a 168 ore).
Questi risultati dimostrano che le piastrine all'interno del PRFM (Platelet
Rich Fibrin Matrix) rimangono funzionali e vitali per tutto il processo
Cascade ed evidenziano un rilascio di fattori di crescita continuo per almeno sette giorni.
Caratterizzazione dei fattori di crescita autologhi nel gel piastrinico
in matrice di fibrina Cascade (PRFM - Platelet Rich Fibrin Matrix)
Richard J. Carroll, PhD1, Steven P. Arnoczky, DVM2, Susan Graham MS, MT (ASCP), SH3 and Sean M. O’Connell, PhD1&4
MATERIALI E METODI (STUDIO 2):
VALUTAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DEI FATTORI DI
CRESCITA DOPO “WASH OUT” PER UN PERIODO DI SETTE
GIONI NEL GEL PRFM.
Progetto: Sono stati aggiunti 2 mL di soluzione salina sterile a ciascun gel
PRFM. che sono stati lasciati successivamente a temperatura ambiente per
un intervallo di tempo variabile. A ciascun intervallo di tempo, 2 mL di
soluzione sono stati rimossi e stoccati a -78° C per essere esaminati successivamente con il sistema ELISA, mentre una nuova aliquota di 2 ml di
soluzione salina è stata aggiunta al gel e incubata fino all'intervallo di
tempo successivo. Questo processo è stato ripetuto ad ogni intervallo di
tempo fino a 168 ore, tempo in cui la soluzione salina nella provetta #8 è
stata rimossa dal PRFM, dopo che è stato misurato il suo volume per porla
in tubi da criogenia e conservarla a -78° C fino all'analisi ELISA. In questa maniera possono essere misurati solo i fattori di crescita rilasciati dal
intervallo di tempo precedente (il “wash-out”).
Sono stati usati per questo studio otto campioni di sangue prelevati da un
singolo donatore.
Produzione del PRFM (Platelet Rich Fibrin Matrix): il PRFM è stato prodotto come descritto nello Studio 1.
Saggio dei fattori di crescita: I fattori di crescita specifici sono stati misurati come descritto nello Studio 1. In questo studio sono stati misurati anche
il livelli di TGF-b
DISCUSSIONE
In aggiunta a quanto confermato nello Studio 1, e cioè che tutti i fattori di
crescita esaminati erano presenti durante lo studio e che la cinetica e la concentrazione totale varia tra i differenti fattori, lo studio II dimostra che ,invitro, a temperatura amibiente, le piastrine all'interno del PRFM rimangono funzionali e vitali durante l'intero processo Cascade e che vengono
continuamente rilasciati tutti i fattori di crescita all'interno del PRFM per
sette giorni. Inoltre, la produzione di cinque dei sei fattori esaminati è
aumentata 72 ore dopo il prelievo di sangue.
L'eccezione è il IGF-I che ha mantenuto un livello realtivamente costante.
Tuttavia, IGF-I ha concentrazioni da 10 a 1.000 volte più alte degli altri
fattori esaminati.
In fine il confronto delle concentrazioni nello studio dove è stato fatto il
“wash-out” con le concentrazioni dello studio cumulativo ha dimostrato
un incremento da 5 a 10 volte per ciascun fattori di crescita nello studio
cumulativo.
Questi risultati suggeriscono che la stabilità dei fattori di crescita secreti nel
PRFM è maggiore di quanto potrebbe essere predetto basandosi su studi
della stabilità dei fattori di crescita in soluzione acquosa in-vitro, e che questi fattori di crescita possono essere disponibili per le cellule e i tessuti nella
sede di lesione per un periodo prolungato (maggiore di sette giorni) durante il processo di guarigione (Marx RE et al., 2001).
Questi risultati preliminari richiedono studi successivi per confermare queste osservazioni.
PRFM (Platelet Rich Fibrin Matrix) STUDIO 2: RIASSUNTO DEI
RISULTATI.
1. Cascade Medical Enterprise (Wayne, NJ)
2. Laboratory for Comparative Orthopaedic Research
Michigan State University (East Lansing, MI)
3. Department of Clinical Laboratory Sciences
SUNY Upstate Medical University (Syracuse, NY)
4. Department of Surgery Englewood Hospital
Mount Sinai School of Medicine (Englewood, NJ)
Platelet-Derived Growth Factor Concentration at Each Time Point
Growth Factor (pg/mL)
100,000
10,000
IGF-I
bFGF
PDGF-BB
EGF
TGF-b
VEGF
1,000
100
10
Distribuito da:
0
1
6
12
24
48
72
168
Hours Post Blood Draw
Growth Factor Concentration (pg)
Cumulative Platelet-Derived Growth Factor Production Over Seven Days
100,000
10,000
IGF-I
bFGF
PDGF-BB
EGF
TGF-b
VEGF
1,000
100
TissueLab spa - Uffici commerciali
Via Cascina Belcasule, 11
20141 Milano - Tel e Fax 02 5695845
[email protected]
10
0
1
6
12
24
48
Hours Post Blood Draw
72
168
125 May Street
Edison, NJ 08837
www.mtf.org
Plymouth 60-PL2 3EU
Devon, UK

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