Citologia 17 - Duplicazione del DNA

Citologia 17 – Duplicazione del DNA
La duplicazione (o replicazione) è il meccanismo attraverso cui il DNA produce una copia di sé. Ogni volta
che una cellula si divide, l'intero genoma deve essere duplicato per poter essere trasmesso (tramite mitosi
o meiosi) alle cellule figlie. Il meccanismo della replicazione è complesso e richiede l'intervento di numerosi
fattori.
Inizio
La duplicazione inizia in un ben preciso punto della molecola del DNA, detto punto di origine della replicazione,
caratterizzato da una sequenza di nucleotidi che contengono molte basi AT (…queste sequenze si aprono con relativa facilità). Negli eucarioti i punti di origine sono multipli (20-80, distanziati tra loro da 30-300.000 nucleotidi).
Nei procarioti, in corrispondenza di questa regione del
DNA si legano circa 20 proteine, dette DNA-A. Il DNA si
avvolge attorno alle proteine, formando un anello (loop),
e la doppia elica si apre per un breve tratto. Negli eucarioti, il processo di inizio è più articolato e vede coinvolto
un complesso di riconoscimento del punto di origine
(ORC) ed una serie di altre proteine.
Intervento dell’elicasi
Nella zona di apertura della doppia elica si innestano, una per ogni verso, molecole di elicasi, un enzima che
separa i filamenti del DNA mediante rottura dei legami idrogeno tra le basi azotate. Questo enzima avanza
alla straordinaria velocità di circa 1000 nucleotidi al secondo ed utilizza l’ATP quale fonte di energia.
L’intervento della elicasi determina il distacco delle proteine del processo di inizio (DNA-A nei procarioti e
ORC + altre proteine negli eucarioti) e l’aggancio di nuove proteine, dette proteine SSB (single strand binding, … che si legano al singolo filamento). Queste proteine servono a distendere e far mantenere distaccati
i due filamenti del DNA, per evitare che riformino l’elica o che si formi una forcina (… che interromperebbe
il processo di duplicazione).
Dopo l‘apertura del DNA, interviene la primasi, un enzima che si lega all’elicasi e viene attivato da essa. La
primasi sintetizza un piccolo frammento di RNA (primer), lungo 7-10 nucleotidi. Il primer ha un terminale 3’OH che serve da innesco alla DNA-polimerasi, per agganciarsi e copiare il filamento del DNA.
DNA-polimerasi III
L’enzima deputato alla duplicazione del DNA è la DNA-polimerasi III1. Questo enzima non è in grado, da solo, di copiare il DNA e formare un nuovo filamento ma riesce solo ad allungare un filamento già esistente
(come il primer prodotto dalla primasi) che gli fornisca un 3’-OH libero. Un’altra limitazione della DNApolimerasi è quella di poter procedere solo in direzione 5’3’. La direzione è riferita al frammento di DNA
da sintetizzare e non a quello d’origine. La DNA-polimerasi III è dotata di proof-reading, attraverso il quale
l’enzima esercita un controllo dei nucleotidi assemblati. Negli eucarioti opera una sola DNA-polimerasi III
per il filamento leading e diverse DNA-polimerasi III per la duplicazione del filamento lagging, e precisamente, una per ogni loop formato (vedi dopo).
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Oltre alla DNA polimerasi I e III, ci sono anche le DNA polimerasi II, IV e V che intervengono per riparare il DNA (per esempio piccoli buchi che bloccherebbero la DNA polimerasi III).
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I vincoli imposti dalla DNA-polimerasi III complicano notevolmente il processo di replicazione del DNA. Infatti, mentre uno dei due filamenti (complementare del filamento 3’5’ del DNA e chiamato leading) viene
sintetizzato in maniera continua (senza interruzioni), sull’altro filamento (complementare del filamento
5’3’ del DNA e chiamato lagging) essa avviene in maniera discontinua, cioè attraverso la formazione di
piccole catene di DNA (di 100-200 nucleotidi), dette frammenti di Okazaki. Il problema sta nel fatto che la
DNA polimerasi III, per sintetizzare il filamento lagging, dovrebbe muoversi in direzione opposta all’elicasi, e
questo non è possibile.
Le due DNA-polimerasi III si muovono nella stessa direzione (assieme alla elicasi). La sintesi contemporanea
dei due filamenti, in direzione 5’3’, può avvenire solo grazie alla formazione di un’ansa (loop) da parte del
filamento lagging.
Sintesi
Un complesso proteico (clamp) interviene per stabilizzare il legame della DNA-Polimerasi III col filamento
del DNA. Ci sono due clamp diversi, uno per la DNA-Polimerasi III del filamento leading ed uno per quella
del filamento lagging. Entrambi sono tenuti assieme da una proteina di sostegno (clamp loader). Grazie a
questo legame, le due DNA-Polimerasi III si muovono nella stessa direzione.
La DNA-polimerasi III traduce la sequenza di nucleotidi del filamento di DNA originario. Rispettando la complementarietà con il DNA originario, l’enzima unisce dei nucleotidi per formare il nuovo filamento.
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Successivamente, i primer di RNA vengono eliminati da un enzima chiamato RNasi-H e sostituiti da frammenti di DNA ad opera della DNA-polimerasi I. Essa si muove solo in direzione 5’3’ ed ha bisogno di un
aggancio 3’-OH per poter operare. La DNA-polimerasi I del segmento leading è sempre la stessa mentre
quella per il frammento lagging cambia per ogni nuovo frammento di Okazaki (a causa del loop).
Il primer dell’estremità 5’ del DNA neoformato non può essere sostituito dalla DNA-polimerasi I perché l’enzima non
avrebbe nessun aggancio 3’-OH su cui innestarsi. Tuttavia il
primer dell’estremità 5’ terminale corrisponde alla sequenza
nucleotidica dei telomeri (TTAGGG).
 Nelle cellule somatiche, il primer dell’estremità 5’
terminale non viene sostituito da un equivalente
frammento di DNA, per cui l’RNA che forma il primer
si degrada. Man mano che la cellula subisce nuove
divisioni, il filamento di DNA si accorcia (accorciamento dei telomeri caos genetico).
 Nelle cellule germinali, il primer dell’estremità 5’
terminale viene sostituito dalla telomerasi, un enzima particolare capace di sintetizzare DNA partendo da una sequenza interna di RNA, che appartiene alla categoria degli enzimi della trascriptasi
inversa.
Infine, i frammenti di DNA dei nuovi filamenti vengono
saldati dalla DNA-ligasi.
Topoisomerasi
Un ruolo importante nella replicazione del DNA è svolto dalle topoisomerasi. Lo svolgimento della doppia
elica da parte dell’elicasi porta il DNA
dell’apertura ad attorcigliarsi notevolmente
a valle e a formare delle anse secondarie
che possono causare problemi per l’intero
processo di replicazione. Per evitare avvolgimenti indesiderati, intervengono:
 Topoisomerasi I: agisce su uno dei
due filamenti del DNA, rompendo
una sola delle catene del DNA. Poi
ruota la catena interrotta attorno a
quella integra, per svolgere il DNA
a valle, e riunisce le estremità interrotte. Il punto dell’interruzione è
il legame tra gruppo fosfato e desossiribosio; sia la rottura che la
successiva cucitura avvengono senza dispendio di energia, in quanto l’energia ceduta nella rottura
di gruppi fosfato viene conservata e utilizzata dell’enzima nelle successive operazioni.
 Topoisomerasi II: agisce su entrambi i filamenti del DNA, per eliminare le anse secondarie. Lega due
segmenti di DNA intrecciati, rompe uno di essi e fa passare l’altro attraverso, così da svolgere
l’ansa. Il tutto richiede 2 molecole di ATP.
Caratteristiche generali della duplicazione
 Bidirezionale: avviene in entrambe le direzioni
 Semiconservativa: le molecole di DNA neoformate sono costituite ognuna da un filamento di DNA
della molecola originaria e da un filamento di nuova sintesi
 È estremamente preciso: la DNA-polimerasi fa un errore ogni miliardo di basi sintetizzate.
 È un processo rapido (50 nucleotidi al secondo).
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