技法セミナー 454GS シリーズを用いた 16S アンプリコンシークエンシングによる細菌叢構造解析須　田　亙 1．はじめに環境中には多くの難培養性細菌が存在していることから，細菌叢の菌種組成やその動態を把握するためには，培養を介さずに 16S リボソーム RNA 遺伝子（16S rDNA）の配列を解析する手法（16S 解析）が汎用されてきた。従来，16S 解析には，ユニバーサルプライマーを用いて PCR 増幅した 16S rDNA アンプリコンをクローニングし，回収したプラスミドのサンガーシークエンシングによって塩基配列を解析する手法が一般的であった。しかし，この方法は組み換え実験を行う必要があり，操作が煩雑であることから解析できる検体数や 1 検体あたりに読み取り可能なリード数に限りがあった。また，クローニングの過程でバイアスを生じる問題点も指摘されていた。一方で，2005 年に初めて次世代シークエンサー（Next-Generation Sequencer: NGS）が発表された。 NGS は，比較的短いリード長の配列読み取りを大量に並列処理することで，膨大な量の DNA 配列データを簡便に読み取る事が可能な技術であり，今日までに数種類の異なる特性を持った機種が発売されている。各種 NGS は現在でも半年から一年単位で装置の性能のバージョンアップが行われており，また， 1 分子から DNA 配列を読み取る事が可能な第 3 世代機も登場するなど，性能のアップデートが続いている。 NGS であるロシュ社の 454 GS シリーズシークエンサーは，他の NGS と比較して，長鎖の読取り（500 ～ 700 塩基／リード）が可能な特徴を有するため（例えばイルミナ社 MiSeq の場合は 250 塩基／リード）， 16S rDNA の広範囲を解析できる利点がある。筆者らは 454 GS シリーズシークエンサーを用い 63 てヒト常在細菌叢を解析する一連のパイプラインを構築し，これを公開している（http://www.rochebiochem.jp/prima/20130307.pdf） f 。また現在では，本パイプラインを様々な環境試料に応用している。本稿では，本パイプラインを用いた NGS による細菌叢の 16S 解析について，環境試料からの DNA 抽出からデータ解析に至る一連の流れを解説する。 2．環境試料からの菌叢 DNA の抽出細菌叢の構造の正確な解析には，試料から細菌叢の元の組成比を損なわずに網羅的に細菌のゲノム DNA を抽出することが重要である。この目的のため，図 1．複合酵素法を用いた菌叢 DNA の調製手順1) 細菌叢サンプルに対し，リゾチーム処理，アクロモペプチダーゼ処理を行うことでサンプル中の細菌群を網羅的に溶菌し，プロテアーゼ K 処理，PCI 処理，PEG 沈殿， RNase 処理を経て精製する。アクロモペプチダーゼは溶菌スペクトルが広く，リゾチームと組み合わせることでより広範囲の細菌を溶解することが可能である。 64 図 2．糞便検体を用いた菌叢 DNA 調製手法の評価 Handbook of molecular microbial ecology II2) より一部改変し転載。（A）ラット糞便検体から各種法で調製した菌叢 DNA の電気泳動結果。M：分子量マーカー，1：リゾチーム処理，2：複合酵素法（リゾチーム + アクロモペプチダーゼ），3：ガラスビーズ破砕（+SDS），4：ガラスビーズ破砕（−SDS），5： QIAamp DNA stool mini Kit. （B）ヒト糞便検体からの各種法による DNA 回収率の比較。1：リゾチーム処理，2：複合酵素法（リゾチーム + アクロモペプチダーゼ），3：ガラスビーズ破砕（+SDS），4：ガラスビーズ破砕（−SDS），5：QIAamp DNA stool mini Kit。（C）各種法で回収した DNA を用いた菌叢構造の UniFrac PCoA による比較。異なるヒト糞便検体の解析結果。1～5，6～ 10 および 11～15 がそれぞれ異なるヒト糞便検体からの回収した DNA の解析結果を示す。●：リゾチーム処理，○：複合酵素法（リゾチーム + アクロモペプチダーゼ），■：ガラスビーズ破砕（+SDS），□：ガラスビーズ破砕（−SDS）， ▲：QIAamp DNA stool mini Kit。QIAamp DNA stool Kit によって得られた DNA の菌叢フロットは他の手法と大きく離れていることから，菌叢構造の解析結果に影響していることがわかる。筆者らのグループではリゾチームおよびアクロモペプチダーゼを用いた複合酵素による DNA 抽出手法1) （図 1）を用いている。図 2 には，ヒトおよびラット糞便検体から様々な手法を用いて抽出した DNA を評価した結果を示した2)。複合酵素法で抽出した DNA は高分子で DNA 収量も高いことがわかる（図 2A，B）。最も注意しなくてはならないのは，特定の市販キットの中には使用することによって菌叢解析の結果に DNA 抽出によるバイアスが生じる可能性があるものが存在する点である（図 2C）。このようなキットは簡便性に特化しており，特定の細菌の迅速な検出等に用いるのには適しているが，菌叢全体を網羅的に調べる 16S 解析には向かない。以上の情報を考慮し，筆者らは複合酵素法をヒト，マウス，ラットなどの常在細菌叢（糞便，唾液，尿，表皮細菌叢）をはじめ，海洋水などの環境サンプルからの細菌叢 DNA の抽出にも応用している。 3．16S rDNA の PCR 増幅とパイロシークエンシング続いて，抽出した DNA から 16S rDNA の variable region を含む断片を PCR 増幅する。この目的のために，様々なユニバーサルプライマーセットが用いられてきた。筆者らは，27Fmod および 338R を用い， 454 シークエンサーで完全長を読みきれる塩基長である V1–2 領域（340 塩基前後）を増幅後，解析する手法（アンプリコン解析）を用いている（図 3）。 27Fmod は従来の 16S 解析で汎用されていた 27F の 65 図 3．454 GS シリーズを用いた 16S アンプリコン解析 V：Variable region（可変領域）。配列の 1 塩基をミックスに置き換え，菌叢の定量性を向上したものである（図 3A）。従来の 27F はヒト腸内細菌叢において，Bifidobacterium 属細菌とミスマッチを生じるため過小評価の原因になっていた3)。 NGS では大量のリードが得られるため，1 回の稼働で複数検体を同時解析するのが一般的である。ベンチトップ機である 454 GS junior を使用する場合，1 稼働で 10 万リード以上のリードが得られる。例えば，5,000 リード／検体のリード量を得るには，1 稼働当たり 20 検体を同時解析できる。このためには，パイロシークエンシングの鋳型となる PCR アンプリコンにサンプル毎にユニークな 10 塩基程度のバーコード配列を付加しておき，複数サンプルを混合後，一括でシークエンシングを行う。シークエンシングの後，得られたリードをバーコードに基づき分配し，個別に解析する（バーコードシークエンシング）。筆者らは，27Fmod および 338R に 454 GS シークエンサーによる反応に必要なアダプター配列を付加したフュージョンプライマーである 27Fmod-454A および 338R-454B を用いている（図 3B）。27Fmod-454A には，前述のバーコード配列が含まれているため，本プライマーセットを用いて PCR 増幅することで，バーコード配列を付加した V1–2 領域の PCR アンプリコンを簡便に作成可能である。バーコード配列を含むプライマーの詳細に関しては以下の URL を参照されたい（http://www. igsb.org/uploads/pdf/TCB-09013_AmpliconFusionPrim erDesignGuidelines.pdf） f 。各サンプルの PCR アンプリコンは精製後，インビトロジェン社の Picogreen dsDNA reagent kit を用いて定量し，等量ずつ混合することでライブラリを作成する。その後，ロシュ社から提供されているプロトコルに従いエマルジョン PCR により，クローニングを介さずに各 16S 断片をモノクローナルに増幅し，大規模並列シークエンシングに供する。筆者らは十数種の細菌ゲノム DNA をある組成比で人工的に混合した合成細菌叢 DNA を作成し，本手法における菌組成比の定量性評価を行った4)。図 4 は 27Fmod-338R を用いた V1–2 領域，従来の 27F-338R を用いた V1–2 領域，787F-1061R を用いた V5–6 領域の 454 GS シークエンサーによるアンプリコン解析，27F-1492R を用いた従来のクローニング解析（サンガー法），および構成菌種特異的な qPCR によって得られた合成細菌叢の菌組成 66 比に基づく主成分分析を行った結果を示している。 27Fmod-338R および 787F-1061R によるアンプリコン解析の結果は，qPCR と同程度に期待値に近く，正確に菌組成を反映していることがわかる。一方で，従来の 27F-338R を用いた方法は期待値から少し離れている。さらに従来のクローニング解析によって得られた結果は最も期待値から離れており，定量性・定性性ともに大きな問題があることがわかった。 4．シークエンシングデータの処理アンプリコン解析によって得られたリードには，一定割合で正確性の低いリードや短い（不完全な）リードが含まれている。このため，得られたリードのクオリティチェックの工程が重要である。図 5 は筆者らが構築したクオリティチェックの工程を示している。まず，配列の両末端にそれぞれ 27Fmod と 338R の配列を正確に持っているリードのみを選抜する。その後，選抜された配列の全体の平均クオリティ値（QV）が 25 以上のリードを選抜する。この過程で不完全長リードやクオリティの低い不正確なリードが除去され，解析に適した高品質リードのみが選抜される。その後，必要に応じてリードのキメラチェックを行う。図 4．合成細菌叢を用いた菌組成比の定量性評価 2 つの異なる菌組成をもつ合成細菌叢を作成し，各種手法で解析した菌組成比に基づく主成分分析の結果4)。●：期待値（合成菌叢を作成した混合比），○：構成菌種特異的 qPCR による定量。■：27Fmod-338R を用いた V1–2 の 454 アンプリコンシークエンシング，□：27F-338R を用いた V1–2 の 454 アンプリコンシークエンシング，▲：787F-1061R を用いた V5–6 の 454 アンプリコンシークエンシング，◇：27F-1492R を用いた V1–9 のクローニングライブラリ解析（サンガー法）。図 5．454 シークエンシングで得られたリードのクオリティチェック工程 67 5．Operational taxonomic unit（OTU）解析慣れていない場合，敷居が高い作業工程と思われがちである。筆者らはこれらの操作を Linux 環境下において簡便なコマンドのみで自動処理するパイプラインを構築し，ロシュ社からフリーで公開しているので，参考されたい（http://www.roche-biochem.jp/ prima/20130307.pdf） f 。上記のクオリティチェックを経て高品質リードを得た後は，OTU の作成を行う（図 6）。OTU 解析は，配列同士の相同性がある一定以上（96–97% が一般的）のリード同士をクラスタリングして，1 つの菌種（あるいはグループ）として定義して扱うための手法である。形成された OTU の数は，菌叢 6．菌叢構造の比較解析を構成する菌種の数を，各 OTU に含まれるリード OTU の菌種帰属の結果を集計することで，各系数はその種の存在量を表している。形成された各 OTU から選抜した代表配列をデータベースと照会統レベルでの菌叢の組成比を算出することが可能ですることで菌種帰属を行う。菌種帰属に用いるデーある。図 7A には疾患患者と健常者におけるヒト常タベースは，登録されている菌種の系統情報が正確在細菌叢の属レベルでの組成比を解析した例を示であることが重要である。公的データベースであした。菌組成比を求めることで，2 グループ間で有る Ribosomal Database Project（RDP）5)，Greengenes6)，意に増加あるいは減少している菌群を統計学的に SILVA7) などは，いずれも系統情報の正確な菌種の検出することが可能である（図 7B）。存在比の差の 16S 配列を提供している。また，Genbank で公開さ検定以外にも，異なるサンプル間での菌叢構造全れている細菌のコンプリートゲノムも系統情報が正体の比較を行う様々な手法が存在する。その中で UniFrac 解析8)（http://bmf2.colorado.edu/fastunifrac/）確で，16S 配列情報を含んでいる。筆者らは，RDP に登録されている単離菌由来の 16S 配列と，コンは，最も汎用されている解析手法である。UniFrac プリートゲノムから抽出した 16S 配列から構築しでは OTU の代表配列を用いて Tree を作成し，サンたデータベースを菌種帰属に利用している。プル間で共有する枝の長さとそれぞれのサンプルに上述したリードのクオリティチェックや，クラ固有な枝の割合から 2 サンプル間の菌組成の相違度スタリングによる OTU 作成，信頼性の高いデータを距離（UniFrac Distance）として求める。UniFrac Distance には，OTU に含まれるリード数を考慮しベースを用いた菌種帰属は，情報学的な解析手法に図 6：Operational taxonomic unit（OTU）解析 68 図 7．16S データにもとづく菌組成解析例それぞれ 10 名の健常者と疾患患者の常在細菌叢解析した結果の例。（A）属レベルでの菌組成比を示した例。（B）疾患患者グループと健常者グループで存在比に有意な差がある菌（属）の分布および平均値。アスタリスクは統計学的有意差を示す。た weighted とリード数を考慮しない unweighed の 2 種類があり，前者は菌叢の組成全体の類似性を，後者は菌叢の菌種メンバーのみの類似性を反映している。得られた距離マトリクスを用いた主座標分析（Principle Coordinate Analysis: PCoA）を行うことで，各サンプルの菌叢構造の類似性を視覚化することができる。図 8A には疾患患者および健常者のヒト常在細菌叢の UniFrac Distance に基づく PCoA の例を示した。2 群のプロットがそれぞれクラスタリングしており，菌叢構造の違いが明確に把握できる。また，図 8B は各サンプル間の UniFrac Distance を患者グループ間，健常者グループ間，患者―健常者グループ間に分けてまとめたものである。患者―健常者グループ間の UniFrac Distance が，患者グループ間および健常者グループ間よりも，統計学的に有意に大きければ，2 群間の菌叢構造の違いを強く示唆することができる。 7．終わりに本稿では，筆者らが構築し研究に応用している解析パイプラインを紹介させていただいた。NGS による大量の 16S リードの解析に対応したフリーツールとしては Mothur9) や QIIME10) などが既に公開されており，多用されている。こうしたツール群の開発により，以前はバイオインフォマティクス技術者以外には敷居が高かった NGS によるデータの解析が一般化してきている。上述してきたとおり，NGS を利用した 16S 解析は，従来用いられていたクローニングによる 16S 解析よりも，菌組成の定量が正確な高精細な解析手法になり得る。しかしながら，次世代シークエンサーを用いた 16S 解析においても，PCR による増幅を介するため，得られた結果にバイアスを生じている可能性は否定できない。また，16S 解析では，各菌種の系統分類に基づく菌叢構造の比較は可能であるが， 69 図 8．UniFrac distance を用いた菌叢構造類似性の解析例（A）UniFrac distance に基づく主座標分析例（principle coordinate analysis: PCoA）。黒は疾患患者検体，白は健常者検体を示す。（B）疾患患者および健常者グループにおける，グループ内とグループ間の UniFrac Distance の比較解析例。アスタリスクは統計学的有意差を示す。その菌叢が持っている機能に結びつく知見を得るのは難しい。これらの問題を解決するには，細菌叢から抽出した DNA の全配列に対し網羅的な配列決定（ホールゲノムショットガンシークエンシング）を行い，得られた遺伝子情報から菌叢の構造や機能を考察するメタゲノム解析を相補的に用いる必要がある。文　献 1) Morita, H. et al. 2007. An improved isolation method for metagenomic analysis of the microbial flora of the human intestine, Micorbes Environ. 22: 214–222. 2) Ueno, M. et al. Assessment and Improvement of Methods for Microbial DNA Preparation from Fecal Samples. pp. 191–198. In Edited by Frans J. de Bruijn. Handbook of molecular microbial ecology II. Published 2011 by John Wiley & Sons, Inc. 3) Hattori, M. and T. Taylor. 2009. The human intestinal microbiome: a new frontier of human biology. DNA Res. 16: 1–12. 4) Kim, S. et al. 2013. Robustness of gut microbiota of healthy adults in response to probiotic intervention revealed by high-throughput pyrosequencing. DNA Res. 20: 241–253. 5) Maidak, L.M. et al. 1997. The RDP (Ribosomal Database Project). Nucleic Acids Res. 25: 109–110. 6) DeSantis, T.Z. et al. 2006. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72: 5069–5072. 7) Pruesse, E. et al. 2007. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucl. Acids Res. 21: 7188–7196. 8) Lozupone, C. and R. Knight. 2005. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl. Environ. Microbiol. 71: 8228–8235. 9) Caporaso, J.G. et al. 2010. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat. Methods 7: 335–336. 10) Schloss, P.D. et al. 2009. Introducing mothur: Open-Source, Platform-Independent, Community-Supported Software for Describing and Comparing Microbial Communities. Appl. Environ. Microbiol. 75: 7537–7541.