Ⅲ．血清学的診断の方法１．抗血清の作り方動物はウイルスや細菌に感染すると、その病原体の表面に存在するタンパク質や多糖類（抗原）を認識して、その病原体に特異的に結合する抗体を産生して自らを守ろうとする免疫系を作動させる。この動物の免疫系を利用して、植物病原体に特異的に反応する抗体を得ることができる。具体的には、精製した植物ウイルスや、培養した細菌を抗原として、ウサギなどの実験動物に筋肉、皮下あるいは静脈に注射（投与）して一定期間経過後に血液を採取し血清を得る。この血清中には、注射した抗原（植物ウ抗体は免疫グロブリンと呼ばれる Y 字状のタンパク質で、H 鎖（重鎖）と L 鎖（軽鎖）計 4 個のポリペプチドからなる。H 鎖の先端は可変部と呼ばれ、決まった抗原の特定部位と結合する。この反応を抗原抗体反応と呼ぶ。抗体は血清中に含まれ、免疫グロブリン G（IgG）が多数を占める。イルスなど）に特異的に反応する抗体が含まれていて抗血清と呼ばれる。２．抗血清の利用この抗血清を利用して、植物の病原体を検出・診断する方法を血清学（免疫学）的診断法という。植物病原体の中では、ウイルスや細菌の検出・診断に主に用いられているが、糸状菌では疫病菌の診断に実用的に利用されている。血清学的診断法は、抗血清（抗体）を準備しておけば、大掛りな設備のない実験室においても、簡便、迅速、比較的安価に植物のウイルス病や細菌病などの診断ができるという特徴がある。植物病の血清診断法は多種多様であるが、大まかに分類すると、抗原抗体反応を、 ① 直接的に肉眼で観察する方法スライド凝集反応、ゲル内拡散法、リングテスト ② 顕微鏡や電子顕微鏡で拡大して観察する方法蛍光抗体法、免疫電子顕微鏡観察法 ③ ラテックス、酵素、放射性物質などを利用し反応を増幅して観察する方法ラテックス凝集反応、ELISA などに分類することができる。普通③の方法が最も高感度である。 1 ◆スライド凝集反応◆ スライドガラス上で抗原‐抗体の凝集反応の有無を観察する方法で、最も単純で簡易な方法である。ただ、貴重な抗血清を多量に消費するため、現在ではほとんど使用されないが、抗原抗体反応を直接、肉眼で見ることが出来る。材料：Xanthomonas oryzae pv. oryzae Pseudomonas syringae 抗 Xanthomonas oryzae ウサギ生血清方法：①スライドガラスに生理食塩水（0.85 % NaCl 水溶液）を 50 µl 乗せ、白金耳でかきとった菌体を懸濁する。 ②2 倍希釈した血清を一滴（50 µl）スライドガラスに乗せ、菌液と混合する。 ③凝集反応を確認する。図 12 凝集反応 ※抗原・抗体いずれかが過剰な場合、凝集反応が起こりにくいことがある。 ※1, 2 分以内に現れるものが陽性で、3 分以上過ぎて起こる凝集は目的とする抗原抗体反応によるものではないことがあるので注意する。図 13 左：陽性右：陰性 2 ◆ゲル内拡散法◆ ゲル平板の穴に抗血清と抗原を入れ、それらが拡散してゲル内で反応したときに生じる沈降帯を観察する方法。二重拡散法を用いると、形成される沈降帯パターンにより、血清学的に同種か近縁であるかが推定できる。図 14 ゲル内拡散例 A=抗原 S=抗 A 抗体ａ=A と同等の抗原 W=MQ 水材料：TMV（Tabaco mosaic virus）感染タバコ（Nicotiana tabacum cv. White Burley）健全タバコ（Nicotiana tabacum cv. White Burley）抗 TMV ウサギ生血清方法：①0.1 M Tris-HCl 緩衝液（pH 8.0）120 ml に、ゲランガム 0.36 g（0.3 %）と塩化マグネシウム六水和物（MgCl2・6H2O）0.24 g（0.2 %）を加え、電子レンジで溶解する。 ②溶解したゲル 10ml を熱いうちに駒込ピペットで 5 cm シャーレに流し広げる。 ③固まったら図 16 の上にシャーレをのせ、図に従ってコルクボーラー（No.3）で７か所打ち抜き、打ち抜いたゲルを柄付針で取り除き穴を空ける。 ④TMV 感染タバコ葉、健全タバコ葉を磨砕してサンプル液を調整する。約 5 図 15 穴の空け方 10cm 程度の葉を磨砕袋に入れ、リン酸バッファー 1ml を加える。乳棒でよく磨砕する。サンプル液は 2ml ずつ作製する。 ⑤磨砕液をピペットで 1.5ml チューブに回収し、15000rpm、室温（20℃）で 5 分遠心分離する。この上清をサンプル液として使用する。 ⑥図 16 を参考に、サンプルを 100 μl ずつ滴下する。血清(4 倍希釈)を中央の穴に 100μl 滴下する。図 16 3 ⑥シャーレは湿らせた紙をしいたタッパーに入れ、室温で静置する（調査作業室の 25℃ インキュベーターに入れておく）。4 日後（月曜日）に反応を観察する。 ◆ELISA◆（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, 酵素結合抗体法）ダブルサンドイッチ法 double antibody sandwich method: DAS-ELISA マイクロプレートにウイルスを抗原とする抗体を吸着させ（コーティング）、試料汁液を添加する。もしウイルスが存在すればウイルスは抗体に捕捉される。これにコンジュゲート抗体を添加し、捕捉されたウイルスに結合させ、基質を添加すると酵素によって基質が分解され、溶液の色が変化することでウイルスを検出することができる。図 17 ELISA 法の原理 ★コンジュゲート（酵素標識された抗体）抗体に酵素（アルカリフォスファターゼ）を結合させたもの。アルカリフォスファターゼは基質溶液（p-ニトロフェニルフォスフェート：無色透明）を分解し黄色に変化させる、これを波長 405 nm の吸光度で測定し分解された基質の量を計る。分解量は、試料中に含まれる抗原（ウイルス）の量に比例する。材料：蘭（カトレア、シンビジュウム、オンシジュウム、デンファレ、デンドロビウム、コチョウラン）抗 ORSV（Odontoglossum ringspot virus）DAS-ELISA キット（コーティング用抗体、コンジュゲート抗体）抗 CymMV（Cymbidium mosaic virus）DAS-ELISA キット（コーティング用抗体、コンジュゲート抗体）試薬：●10 PBS（0.02M リン酸緩衝液生理食塩水 pH 7.4） 300ml/班塩化カリウム（KCl）̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 0.6g リン酸二水素カリウム（KH2PO4）̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 0.6g リン酸水素二ナトリウム（Na2HPO4・12H2O）̶̶̶ 8.7g 4 塩化ナトリウム（NaCl）̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 24g 蒸留水 300ml に溶解する。300ml メディウム瓶に入れる。 ●PBS-T（PBS＋0.05% Tween 20） 10 PBS̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 100ml Tween 20̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 500μl 蒸留水̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 900ml 足りなくなったら随時作製し、専用の洗瓶に補充する。 ●磨砕用緩衝液 PBST-PVP（PBS-T＋2% PVP） 100ml/班 10 PBS̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 10ml Tween 20̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 50μl 蒸留水̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 90ml PVP（polyvinilpyrrolidone）̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 2g よく撹拌して PVP を溶解する（発泡注意）。100ml ボトルに入れる。 ●コーティング用緩衝液（0.05M 炭酸緩衝液 pH 9.6） 30ml/班炭酸ナトリウム（Na2CO3）̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 0.048g 炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 0.087g 蒸留水 30ml に溶解し、pH を確認する。50ml チューブに入れる。 ●10%ジエタノールアミン水溶液 30ml/班 ①ジエタノールアミン 3ml を蒸留水 20ml に溶解する。 ②HCl で pH 9.8 に調整する。 ③調整後、蒸留水で 30ml にメスアップする。 ④塩化マグネシウム六水和物 3mg を加える。 50ml チューブに入れる。 ●3N NaOH 水溶液 10ml/班 NaOH 1.2g を蒸留水 10ml に溶解する。15ml チューブに入れる。方法：１．コーティング（第 1 日目） ① コーティング液（抗体）を 0.05 M 炭酸緩衝液（pH 9.6）で 500 倍に希釈(6ml ＋12μl)し、マイクロプレートの各ウエルに 200 µl ずつ分注する。（ORSV、 CymMV をそれぞれ一枚のプレートに半分ずつ分注する。外周一列を除き、各 5 24 ウエルずつにコーティングする。液が混入しない様に注意すること） ② マイクロプレートを、濡らした紙を敷いたタッパーに入れて湿室に保ち、4℃で一晩静置する。第 1 日目ここまで・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ③ マイクロプレートを PBS-T（PBS＋0.05 % Tween 20）で洗浄する。バットにプレート内のコーティング液を捨て、キムタオルで水分を切ってから PBS-T をそれぞれのウエルいっぱいに注ぐ。1~2 分置いてから液をバットに捨て、キムタオルで水分を切る。PBS−T での洗浄は計 3 回おこない、最後に水分をよく切る。ラップに包んで-80℃で保存する。（金曜日に代表者が洗浄する）図 18 ELISA サンプル分注図２．試料処理（試料をウエルに入れる）（第 2 日目） ① 試料（約 1 cm 2 cm）を 20 倍量（約 3 ml）の PBST-PVP（PBS-T＋2 % PVP）中で摩砕し、上清を検定試料として各ウエルに 200 µl ずつ分注する。（分注の位置は図 18 参照。1 サンプルに 4 穴、コントロールは 2 穴使用する。何番のランサンプルをどのウエルに入れたか、必ずメモしておくこと） ② マイクロプレートを、濡らした紙を敷いたタッパーに入れて湿室に保ち、4 ℃ で一晩静置する。第 2 日目ここまで・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ③ マイクロプレートを PBS-T で洗浄する。バットにプレート内のサンプル液を捨て、キムタオルで水分を切ってから PBS-T をそれぞれのウエルいっぱいに注ぐ。 6 1~2 分置いてから液をバットに捨て、キムタオルで水分を切る。PBS−T での洗浄は計 4 回おこない、最後に Milli Q で 1 回洗浄する。水分をよく切ってラップにつつみ、‐80℃で保存する。（湿室中 4℃で保存も可）(金曜日に代表者が洗浄する) ３．コンジュゲート処理（第 3 日目）第 3 日目実習前に事前作業・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ① コンジュゲート液（抗体）を PBS-T で 500 倍に希釈 (6ml＋12μl) し、マイクロプレートの各ウエルに 200 µl ずつ分注する。 ② マイクロプレートを、濡らした紙を敷いたタッパーに入れて湿室に保ち、37 ℃ で 2 時間静置する。第 3 日目実習・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ③ マイクロプレートを PBS-T で洗浄する。バットにプレート内のサンプル液を捨て、キムタオルで水分を切ってから PBS-T をそれぞれのウエルいっぱいに注ぐ。 1~2 分置いてから液をバットに捨て、キムタオルで水分を切る。PBS−T での洗浄は計 5 回おこない、最後に水分をよく切る。４．基質溶液添加 ① 10 %ジエタノールアミン溶液に p-ニトロフェニルフォスフェート（基質、4℃ 保存）を 1 mg/ml (約 12ml に 12mg 溶かす) 溶解し、基質溶液とする。 ② 基質溶液を 200 µl ずつ各ウエルに分注する。 ③ 基質溶液の添加から 15∼30 分後に 3 M NaOH 水溶液を各ウエルに 50 µl ずつ分注し、反応停止を行う。 ④ プレートリーダーで 405 nm の吸光度を測定し、試料のウイルス感染の有無を判定する。感染の有無は肉眼でも判断することが可能である。注意点１．コーティング溶液、コンジュゲート溶液は必ず同じウイルス用を用いること。すなわち、ORSV 抗体でコーティングしたウエルには、必ず ORSV コンジュゲートを使用すること。誤って、ORSV 抗体を処理したウエルに、CymMV 用コンジュゲートを用いると結果は得られない。２．マイクロプレートの洗浄は丁寧に行うこと。 7 ◆イムノクロマト法◆ CMV Immuno Strip（金コロイド免疫クロマト法、Agdia 製）図 19 イムノクロマト原理材料： CMV 感染タバコ（Nicotiana benthamiana）健全タバコ（Nicotiana benthamiana） 8 方法：①抽出袋の上部をハサミで切り、袋をあける。磨砕液がこぼれない様に注意する。 ②サンプル（約 2 cm 2 cm）を抽出用袋に入れ、上からペンの先などで葉をすりつぶす。 ③テストストリップを抽出用袋の透明な部分に挿しこみ、そのまま 15 分程静置する。ストリップを挿しこみすぎると検出がうまくいかないので、かならずストリップの先端部分だけを抽出液に触れさせておく。 ◆電子顕微鏡における免疫染色（免疫電顕）◆ ウイルスなどの特定の抗原を、その特異抗体によってコーティングし、電子線の透過を妨げることで可視化させる方法。組織中の抗原（ウイルス）局在や、観察された抗原が目的の抗原であることを確認するために用いられる。ウイルス粒子に抗体がついた場合、ウイルス粒子の周りに暗い影ができる(図 19)。たとえば、形態では区別できない 2 種のウイルスが重複感染している試料の場合、一方のウイルスに対する抗血清を処理すれば 1 種類の粒子だけが修飾を受け、抗体が結合していないもう一方のウイルスと明確に区別ができるようになる。材料：Potato virus Y（PVY） Helleborus net necrosis virus（HeNNV）抗 HeNNV 抗体方法：パラフィルムに液滴をのせ、作業をおこなう。先に抗体とウイルスのどちらをグリッドに吸着させるかで、二種類の手法に分けられる。図 19 抗体結合した PPV 粒子 ●デコレーショントラップ法（今回使用した手法）グリッドにあらかじめウイルスを吸着させ、その周りに抗体を結合させる方法。 ①試料となるウイルス感染植物片を、生理食塩水中でカミソリを用いて刻む。この抽出液にグリッドを浸けて、15 分吸着させる。余分な水分は濾紙で吸い取る。 ②MQ 水の水滴にグリッドを浸けて、濾紙で余分な水分を吸い取る。この洗浄を 9 回繰り返す。 ③抗ウイルス抗体液にグリッドを浸けて、15 分吸着させる。余分な水分は濾紙で吸い取る。 ④MQ 水の水滴にグリッドを浸けて、濾紙で余分な水分を吸い取る。この洗浄を 5 回繰り返す。 ⑤洗浄後、PTA 1%液にグリッドを浸ける。すぐに濾紙で液を吸い取り、乾燥。 9 ●トラップ法まずグリッドに抗体を吸着させ、そこに抗原となるウイルスをトラップする方法。 ①抗ウイルス抗体液にグリッドを浸けて、15 分吸着させる。余分な水分は濾紙で吸い取る。 ②MQ 水の水滴にグリッドを浸けて、濾紙で余分な水分を吸い取る。この洗浄を 5 回繰り返す。 ③試料となるウイルス感染植物片を、生理食塩水中でカミソリを用いて刻む。この抽出液にグリッドを浸けて、15 分吸着させる。余分な水分は濾紙で吸い取る。 ④MQ 水の水滴にグリッドを浸けて、濾紙で余分な水分を吸い取る。この洗浄を 9 回繰り返す。 ⑤洗浄後、PTA 1%液にグリッドを浸ける。すぐに濾紙で液を吸い取り、乾燥。 10