MSの基礎1 ©2012 Nihon Waters K.K. 1 MSの基礎 MS の基礎1 1 -内容  マススペクトロメトリーとは？ペクトメトリとは  イオン化法  LC条件の検討 ©2012 Nihon Waters K.K. 2 MSの基礎 MS の基礎1 1 -内容  マススペクトロメトリーとは？ペクトメトリとは  イオン化法  LC条件の検討 ©2012 Nihon Waters K.K. 3 マススペクトロメトリーとは？マススペクトロメトリとは？  サンプルを気相イオンにする  真空中でイオンを質量電荷比 (m/z) に応じて分離する  m/z に対するイオン強度を記録する ©2012 Nihon Waters K.K. 4 分析対象物質  非極性  揮発性おおむねGC/MS （しばしば誘導体化が必要）  熱に対して安定  高極性  低揮発性おおむねLC/MS  熱に対して不安定 ©2012 Nihon Waters K.K. 5 MSの利点 MS の利点  検出感度が高い検出感度が高  選択性  広範囲なアプリケ広範囲なアプリケーションション  他の検出器と相補的他検出器相補的 ©2012 Nihon Waters K.K. 6 MSにおける制限 MS における制限  サンプルをイオン化しなければならないサンプルをイオン化しなければならな  イオン分離部を高真空に保たなければならない ©2012 Nihon Waters K.K. 7 MSの基礎 MS の基礎1 1 -内容  マススペクトロメトリーとは？ペクトメトリとは  イオン化法  LC条件の検討 ©2012 Nihon Waters K.K. 8 LC/MSで用いられている主なイオン化法 LC/MS で用いられている主なイオン化法  マトリックス支援レーザー脱離イオン化トリク支援レザ脱離イオン化 (MALDI) – 平面状のマトリックスに溶解した化合物のレーザーアブレーションによる  エレクトロスプレーイオン化 (ESI)  大気圧化学イオン化 (APCI)  大気圧光イオン化 (APPI)  大気圧固体試料イオン化 (ASAP) など・・・ 9 ©2012 Nihon Waters K.K. LC/MSで用いられている主なイオン化法 LC/MS で用いられている主なイオン化法  マトリックス支援レーザー脱離イオン化トリク支援レザ脱離イオン化 (MALDI) – 平面状のマトリックスに溶解した化合物のレーザーアブレーションによる  エレクトロスプレーイオン化 (ESI)  大気圧化学イオン化 (APCI)  大気圧光イオン化 (APPI)  大気圧固体試料イオン化 (ASAP) など・・・ ©2012 Nihon Waters K.K. 10 エレクトロスプレーイオン化エレクトロスプレイオン化（ESI ESI））の原理  ESIは液相のイオン化 ESIプローブ  イオン化は次の3段階キャピラリー – 帯電液滴の生成 – 脱溶媒と液滴の分裂 – 気相イオンの生成サンプルコーンイオン経路イオンの経路コーンガス ©2012 Nihon Waters K.K. 11 帯電液滴の生成キャピラリー酸化還元反応 LCフロ LCフロー +1 3 kV +1-3 ©2012 Nihon Waters K.K. 12 脱溶媒と液滴の分裂 + + + 溶媒の蒸発 + + + + + + + + + + + + + + + + + 不均一な液滴の分裂 + 高温のガス (DesolvationGas eso at o Gas) + + + + + ++ + ++ ... + 13 ©2012 Nihon Waters K.K. 気相イオンの生成イオン蒸発のモデル AH+ AH+ A AH+XAH+ AH+ AH+ A r < 10 nm AH+ AH+ AH+XAH+ AH+X- AH+X- AH+ AH AH+ A AH+ AH+XAH+ AH+ AH+ 半径 < 10 nmの液滴では、静電斥力による液滴表面からのイオン蒸発が起こるイオンは液相から気相へ ©2012 Nihon Waters K.K. 14 ESI法において感度に影響する因子 ESI 法において感度に影響する因子  移動相の種類 – 揮発性であることが必要 o 水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール o 添加剤（ギ酸、酢酸アンモニウムなどを低濃度で使用）ギ酸酸  移動相の流量 – 最適感度の得られる流量を使用 o イオン化法 o カラム内径  試料中の共存成分 – マトリックス効果 o イオン化阻害 o イオン化促進  カラムの汚れ 15 ©2012 Nihon Waters K.K. マトリックス効果 Blank Blank Injection H030312_CS_ES+_001 8.51 8.24 7.76 7.72 8.69 8.98 Urine Injection 1: TOF MS ES+ TIC 3.31e4 6.28 100 9.70 9.86 10.25 Urine H030312_CS_ES+_004 100 6.83 7.70 7.33 8.34 8.56 8.80 1: TOF MS ES+ TIC 3.33e4 9.63 10.20 6.69 6.36 6.38 6.29 10.54 6.01 10.45 6.23 5.93 5.82 5.73 % 4.85 4.49 10.87 10.74 5.58 5.30 11.17 10.84 11.76 % 4.94 10.96 11 26 11.26 11.37 49 2 00 2.00 4 00 4.00 6 00 6.00 8 00 8.00 10 00 10.00 Time 12.00 12 00 25 2 00 2.00 4 00 4.00 6 00 6.00 8 00 8.00 10 00 10.00 Time 12.00 12 00 Theophylline Caffeine Nortriptyline ©2012 Nihon Waters K.K. 16 マトリックス効果（続き）（http://www.waters.com/waters/promotionDetail.htm?id=10073265 より抜粋） ©2012 Nihon Waters K.K. 17 ESIの特長 ESI の特長  ソフトなイオン化 – [M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+、[M+K]+ など – [M-H]-、[M+CH3COO]-、[M+Cl]- など  中～高極性、イオン性、および低～高分子（蛋白質では 150 kDa 程度まで) と広い範囲の化合物を比較的高感度にイオン化できる  生体高分子、ポリマーでは多価イオンを生成 – [M+nH]n+,[M+(NH [M+(NH4)n]n+ – [M-nH]n-  熱に不安定な化合物もイオン化できる  非共有結合複合体もイオン化できる ©2012 Nihon Waters K.K. 18 LC/MSで用いられている主なイオン化法 LC/MS で用いられている主なイオン化法  マトリックス支援レーザー脱離イオン化トリク支援レザ脱離イオン化 (MALDI) – 平面状のマトリックスに溶解した化合物のレーザーアブレーションによる  エレクトロスプレーイオン化 (ESI)  大気圧化学イオン化 (APCI)  大気圧光イオン化 (APPI)  大気圧固体試料イオン化 (ASAP) など・・・ 19 ©2012 Nihon Waters K.K. 大気圧化学イオン化（APCI APCI））の原理  APCIは気相のイオン化 APCIプローブ  イオン化は次の3段階: – 急速な気化 – コロナ放電による試薬イオンの生成 – サンプル分子と試薬イオンの反応プローブ先端コロナニードル ©2012 Nihon Waters K.K. 20 APCI法におけるイオン化の過程 APCI 法におけるイオン化の過程 APCI Probe Heater (400 650°C) (400-650 C) Corona Discharge Corona Discharge Needle Sample Solution Flash Vaporisation Solvent S l t and d Analyte Vapour Nebulizer Gas ©2012 Nihon Waters K.K. Sample Cone 21 気相における化学イオン化（正イオン）プロトン移動イオンの付加電荷交換 ©2012 Nihon Waters K.K. 22 気相における化学イオン化（負イオン）プト移動プロトン移動イオンの付加電荷交換電子捕獲 ©2012 Nihon Waters K.K. 23 APCIの特長 APCI の特長  ソフトなイオン化 – [M+H]+、[M+NH4]+ など – [M-H]-、[M+CH3COO]-、[M+Cl]- など  一般的に一価イオンが生成  ESI でイオン化しにくい低極性化合物もイオン化  移動相とサンプルのプロトン親和力の差が感度に大きく影響  熱に非常に不安定な化合物の場合は熱分解の可能性も ©2012 Nihon Waters K.K. 24 イオン化法と極性の選択  1級～3級アミンどちらでも +  4級アミン ESI +  その他塩基性化合物どちらでも +  アミノ酸どちらでも +  ペプチド、蛋白質 ESI +  ヌクレオチド及び重合体 ESI -  ヌクレオシド ESI + 25 ©2012 Nihon Waters K.K. イオン化法と極性の選択（続き）  非イオン性界面活性剤どちらでも +  陽イオン性界面活性剤 ESI +  陰イオン性界面活性剤 ESI -  カルボン酸どちらでも -  スルホン酸、リン酸 ESI -  ニトロ基どちらでも -  ステロイド類 APCI + 多くの場合、まずESI を試してみるとよい ©2012 Nihon Waters K.K. 26 イオン化法 ESCiマルチモードインターフェイス ESCiマルチモ ESCi マルチモードインターフェイスマルチモドインタフェイス  ESCiは、標準のESIプローブとAPCIのコロナニードルを用いて、ESIとAPCIの両方の測定を同時に行うことができる機能 – MassLynxソフトウェアで、ESI/APCIの切り替えを行う。 – ESIモードではキャピラリーに、APCIモードではコロナニードルに電圧が供給される。 ESIモードではキャピラリーに APCIモードではコロナニードルに電圧が供給される – ESCiのAPCIモードはコンベンショナルなAPCIより低流速で使用でき、熱分解も少ない – 一回の注入でESI(+/-)、APCI(+/-)の測定が可能になるのでイオン化の確認に有効 ESIプローブコロナニードル (MSシステムによって形状が異なります) 27 ©2012 Nihon Waters K.K. LC/MSで用いられている主なイオン化法 LC/MS で用いられている主なイオン化法  マトリックス支援レーザー脱離イオン化トリク支援レザ脱離イオン化 (MALDI) – 平面状のマトリックスに溶解した化合物のレーザーアブレーションによる  エレクトロスプレーイオン化 (ESI)  大気圧化学イオン化 (APCI)  大気圧光イオン化 (APPI)  大気圧固体試料イオン化 (ASAP) など・・・ ©2012 Nihon Waters K.K. 28 APPI法におけるイオン化の過程 APPI 法におけるイオン化の過程 Vacuum UV V Source Sample Solution Probe Heater Repeller Electrode h Flash Vaporisation Solvent and Analyte Vapour Nebulizer Gas Sample Cone 29 ©2012 Nihon Waters K.K. イオン化法の適応範囲（ESI, ESI APCI, APCI APPIのまとめ） APPIのまとめ） 10,000 ESI APPI 質量 1,000 100 APCI 10 無極性高極性測定対象物質の極性 ©2012 Nihon Waters K.K. 30 LC/MSで用いられている主なイオン化法 LC/MS で用いられている主なイオン化法  マトリックス支援レーザー脱離イオン化トリク支援レザ脱離イオン化 (MALDI) – 平面状のマトリックスに溶解した化合物のレーザーアブレーションによる  エレクトロスプレーイオン化 (ESI)  大気圧化学イオン化 (APCI)  大気圧光イオン化 (APPI)  大気圧固体試料イオン化 (ASAP) など・・・ 31 ©2012 Nihon Waters K.K. ASAP (Atomospheric Solid Analysis Probe)  ガラスの棒の先に試料をこすり付けて付着させ（少量でよい、つけてから一度ふき取るくら取るくらいの量で十分、液体も可能）、脱溶媒ガスで試料を気化させ、コロナ放電に量十分液体も可能）脱溶媒ガ試料を気化させナ放電により化学イオン化  ASAP用のプローブをつけるだけで使用可  薬、尿中の薬物代謝物、インクの成分などの分析事例 ASAP ASAP Desolvation Gas (脱溶媒ガス) コロナニードルコロナニードル (MSシステムによって形状が異なります) ©2012 Nihon Waters K.K. ガラス棒に付着したサンプル 32 MSの基礎 MS の基礎Ⅰ Ⅰ -内容  マススペクトロメトリーとは？ペクトメトリとは  イオン化法  LC条件の検討 33 ©2012 Nihon Waters K.K. LC条件の検討 LC 条件の検討  LC条件の検討 – 測定したいイオンをもっとも効率よく発生させる移動相を選択します。 – 測定対象測定対象物質が適切な保持時間をもつカラム、移動相を選択します。 LCMSで使用する溶媒例：水有機溶媒添加剤その他メタノール 1～10 mM 酢酸アンモニウム 0.01～0.1%トリエチルアミン(TEA) アセトニトリル 0.01～0.2% 酢酸 0.01～0.1%トリフルオロ酢酸(TFA) 1～10 mM ギ酸アンモニウム 1～10mM 炭酸水素アンモニウム 0.01～0.2% ギ酸 ※アセトニトリル100%では使用しない ※100% アセトニトリルに酢酸アンモニウムは溶解しない ※TEA、TFAを使用する場合は、システムのメンテナンス頻度をあげること移動相は、揮発性のものを使用してください。有機溶媒の種類、移動相のpH、添加剤の有無、種類および濃度がイオン化効率に影響を与えます。 →移動相の最適化が必要！！ ©2012 Nihon Waters K.K. 34 MSの基礎 MS の基礎1 1 -まとめ  マススペクトロメトリーとは？ペクトメトリとは  イオン化法  LC条件の検討 ©2012 Nihon Waters K.K. 35