●［特集］TRC第10回医薬ポスターセッション D-13：HPLC分析におけるゴーストピーク及びキャリーオーバー低減に向けた検討表１［特集］TRC第10回医薬ポスターセッション HPLC分析条件 D-13:HPLC分析におけるゴーストピーク及びキャリーオーバー低減に向けた検討名古屋研究部安定性試験室竹澤川村正明俊明 1.はじめに 3.1. 水の影響市販のHPLC用水、自家製超純水及び超純水を用いて、近年、高い薬理活性を有する医薬品の開発が盛んに行わ移動相A （20 mmol/Lリン酸緩衝液）を調製し、表1の分析れている。そのため、低含量の製剤中の主成分及びその類条件で測定した時のクロマトグラムを図1に示す。この結縁物質並びに、不純物の定量には、高感度かつ選択性の高果、保持時間22.5分及び31分付近のピーク強度は、精製い分析法を開発する必要がある。一般的に、これらの医薬度が高い水ほど低く、高感度分析を行う際には精製度の品の分析には、液体クロマトグラフィー（HPLC法）やガ高い水を使用することが重要であることが確認できた。スクロマトグラフィー（GC法）、さらには質量分析計を利用したLC-MS︵-MS︶法やGC-MS法が利用されている。中でも、HPLC法は、UV、蛍光及び電気化学検出器など化合物の物性に基づいた選択的な検出が可能で、さまざまな分析カラムが市販されていることから、広範囲な対象物質の分析に利用されている。そこで、本稿では、HPLC分析で問題となるゴーストピークに着目し、移動相に由来するゴーストピークの低減化に向けた基礎的な検討を行ったので紹介する。あわせて、高感度分析を行う上で問題となるキャリーオーバーについて、塩基性化合物であるクロルヘキシジンを用いて検討したので紹介する。 2.HPLC分析のトラブル HPLC法は、「液体の移動相をポンプなどによって加圧図１各種の水を用いた時のクロマトグラム 3.2. 試薬の影響してカラムを通過させ、分析種を固定相及び移動相との相移動相Aについて、①超純水、②超純水＋リン酸（試薬互作用（吸着、分配、イオン交換、サイズ排除など）の特級）、③超純水＋リン酸二水素ナトリウム二水和物、④超差を利用して高性能に分離して検出する手法」1︶であり、純水＋リン酸二水素ナトリウム二水和物＋リン酸の各溶液医薬品の分析で最も汎用されている。そのため、HPLC分に置き替え、測定した時のクロマトグラムを図2に示す。移析でゴーストピークの出現やキャリーオーバーなどを含動相B のアセトニトリル（HPLC 用）からはゴーストピーむ、何らかのトラブルに陥った経験は誰しもお持ちであクが溶出されないことを確認後、測定した結果、比較的極ろう。一般的に、トラブルは①装置、②溶媒、試薬、器材、性の低いゴーストピークaは水やリン酸に由来しており、 ③ヒューマンエラー、④突発的な不測の事態に大別2︶する極性の高いゴーストピークb及びcは、それぞれリン酸及びことができるが、ゴーストピークの溶出は、移動相に使リン酸二水素ナトリウムに由来していることが確認できた。用する水や試薬に由来する場合が多い。そのため、試験また、リン酸二水素ナトリウム二水和物の試薬瓶を開封に用いる試薬のグレードや保管条件、使用する実験器具直後及び開封後4箇月間保管後に測定を行い、試薬保管によの汚染などに細心の注意を払わなければならない。るゴーストピークの変化を調べた。この結果、開封後4箇月間経過後のリン酸二水素ナトリウム二水和物の使用では、図3のcのピーク強度の増加が認められた。試薬瓶開封後は 3.移動相に使用する水及び試薬の影響冷暗所で保管していたが、高感度分析においては、より厳密な使用期限及び保管条件の管理が必要と考えられた。表1に示したHPLC測定条件において、ゴーストピー HPLC分析では緩衝液としてしばしばリン酸緩衝液がクの出現に対する、移動相に使用する水やリン酸緩衝液用いられるが、適切な品位の試薬を選択し、使用期限やの影響を検討した。保管条件を適切に管理することにより、ゴーストピーク・27 東レリサーチセンター The TRC News No.118（Mar.2014） ●［特集］TRC第10回医薬ポスターセッション D-13：HPLC分析におけるゴーストピーク及びキャリーオーバー低減に向けた検討 a ① 超純水 10000 ② 超純水＋リン酸（試薬特級） ① 0.020 キャリーオーバー率（%) 11000 ③ 超純水＋リン酸二水素ナトリウム二水和物 9000 ④ 超純水＋リン酸二水素ナトリウム二水和物＋リン酸 ② 8000 7000 ③ 6000 b 5000 4000 c c 3000 ④ キャリーオーバー率（%）＝ブランクのピーク面積値クロルヘキシジンのﾋﾟｰｸ面積値 × 100 0.015 A ﾀｲﾌﾟ 0.010 0.005 B ﾀｲﾌﾟ 0.000 1 2 3 C ﾀｲﾌﾟ注入回数 2000 図5 1000 各種オートサンプラーによるキャリーオーバー率 0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 保持時間（min）; 10～40 min拡大図2 各移動相によるクロマトグラム（ブランク） 5.まとめ 10000 9000 ① 開封直後 8000 ② 開封後約 4 ヶ月 7000 ゴーストピークが出現する原因の一つとして、移動相の調製に使用する試薬や水の品位が大きく影響する。ま ② 6000 c c 5000 4000 た、分析機器、分析カラムや実験器具からの汚染、測定環境など様々な要因が考えられるため注意を要する。 ① キャリーオーバーの低減化には、測定対象物質に応じ 3000 た洗浄条件（例えば、オートサンプラーの洗浄溶媒の種 2000 類、pHや洗浄時間など）を設定することが重要となる。 1000 定量分析においては、キャリーオーバーにより定量値の 0 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 min 保持時間（min）; 10～40min拡大図3 リン酸ニ水素ナトリウム試薬開封後の影響過大評価にも繋がるため、検量線の定量上限濃度を低濃度側へシフトさせ、試料を希釈後に測定するなども有効な対策となるであろう。を低減することができる。また、ゴーストピークの出現やバックグラウンドレベルは使用する水の精製度に影響 6.引用文献を及ぼすため、注意を要する。１）JIS K 0214：2011 4.キャリーオーバーの影響高速液体クロマトグラフィー通則、日本規格協会（2011）．２）中村洋：日本分析化学会液体クロマトグラフィークロルヘキシジン（図4）はきわめて吸着が生じやすい塩研究懇談会LC-DAYs 2012講演要旨集、p.1（2012）．基性化合物として知られている。3つの異なるオートサ 7.参考文献ンプラー（A～Cタイプ）を用いて、クロルヘキシンジン（1 mg/mL︶をHPLCに注１）川村俊明、浦嶋千裕、櫻井周、竹澤正明：日本分入し、その後、ブランク（ク析化学会液体クロマトグラフィー研究懇談会LCテロルヘキシジンを含まないクノプラザ講演要旨集、p.19 （2013）．溶媒）を3回連続して測定図4 クロルヘキシジンの構造式し、キャリーオーバー率を算出した。この結果、キャリーオーバー率はAタイプ＞Bタイプ＞C タイプの順に高く、Aタイプは3回ブランクを繰り返し注入 ■竹澤正明（たけざわ名古屋研究部まさあき）部長趣味：読書、小物集め。しても、高値であった（図5）。オートサンプラーの洗浄機構を理解し、測定対象物質の物性に応じた洗浄条件を適切に設定することがキャリーオーバーの低減化に繋がる。高感度分析機器である LC-MSのフロントとして、キャリーオーバーが少ない最新のオートサンプラーが開発されており、その洗浄機構を把握しておくことも有効な手段となる。 28・東レリサーチセンター The TRC News No.118（Mar..2014） ■川村俊明（かわむら名古屋研究部趣味：つりとしあき）安定性試験室研究員