785 海外旅行者下痢症例由来毒素原性大腸菌におけるフルオロキノロン系薬剤低感受性菌の出現状況東京都立衛生研究所微生物部松下秀小西典子河村真保畠山薫森田耕司渡辺高橋正樹甲斐明美横山敬子諸角聖杏林大学保健学部登金森政人工藤泰雄（平成 13 年 5 月 7 日受付）（平成 13 年 6 月 8 日受理） Key words： enterotoxigenic Escherichia coli, drug resistance, fluoroquinolone, DNA gyrase, traveler’ s diarrhea 要旨 1988∼1999 年に，海外旅行者下痢症患者から分離した毒素原性大腸菌（ETEC）における，フルオロキノロン系薬剤（FQ）耐性菌，あるいは低感受性菌の出現状況を調べた．検出該菌については，その諸性状，及び DNA ジャイレースサブユニット A 遺伝子上のキノロン耐性決定領域（QRDR）における，変異の有無について検討した． 1,318 株の ETEC について検討した結果，NA 耐性の 21 株（1.6％）は，NFLX，OFLX，CPFX 等今回検討した 6 種いずれの FQ に対しても，低感受性と判定された．FQ 高度耐性菌は認められなかった．年次別に検出状況をみると，1996 年に初めて検出され，1998 年は 10 株（6.9％），1999 年は 6 株（15.8％）と，最近急増してきていることが判明した．なお，21 株中 19 株は，インド亜大陸への旅行者から検出されたものであった．これら 21 株の，他薬剤と合わせた耐性パターンは 6 種認められ，そのうち 12 株（57.1％）は多剤耐性菌であった．毒素産生型は，易熱性エンテロトキシン（LT）単独が 4 株，耐熱性エンテロトキシン（ST）単独が 10 株，LT 及び ST 両産生が 7 株であった．また，これらは 16 種の血清型に分類された． QRDR の塩基配列解析の結果，83 位のコドンが TCG から TTG に変異し，それに伴いアミノ酸がセリンからロイシンに置換していたのが 19 株，87 位のコドンが GAC から TAC に変異，アミノ酸がアスパラギン酸からチロシンに置換していたのが 2 株であった．なお，全株とも単一部位だけの変異であった．〔感染症誌序文 75：785∼791，2001〕剤の一種であるナリジクス酸（NA）に高度耐性近年，各種腸管系病原菌においても，キノロンで，新キノロン剤と呼ばれるフルオロキノロン系別刷請求先：（〒169―0073）東京都新宿区百人町 3―24―1 東京都立衛生研究所微生物部松下秀を示す菌株の出現，増加が世界的規模で問題と平成13年 9 月20日薬剤（以下 FQ と略）にも耐性，あるいは低感受性なって来ている1）∼6）．著者らは，東京で分離された 786 松下秀他 Table 1 Drug resistance of enterotoxigenic E. coil isolated from overseas traveler's diarrheal cases in Tokyo, 1988―1999 No. of strains No. of resistants （%） CP TC SM KM ABPC 608 （46.1） 135 （10.2） 434 （32.9） 339 （25.7） 13 （1.0） 303 （23.0） ST NA FOM NFLX 235 （17.8） 21 （1.6） 15 （1.1） 0 1,318 No. of strains resistant to each drug （%）サルモネラにおける状況について検討し，1995 性 20 株については NA，NFLX 及び同様の FQ 年以降の海外旅行者下痢症例由来菌株において，であるオフロキサシン（OFLX），シプロフロキサこのような FQ 低感受性菌の検出率が急増していシン（CPFX），レボフロキサシン（LVFX），トス 7）ることを明らかにし，本誌に報告した．フロキサシン（TFLX）及びスパルフロキサシン今回は，我が国からの海外旅行者下痢症患者に（SPFX）に対する最小発育阻止濃度（Minimum in- おいて最も高頻度に分離される8），毒素原性大腸 hibitory concentration；MIC）を，NCCLS の標準菌（Enterotoxigenic Escherichia coli；ETEC）にお法10）に準拠した微量液体希釈法で測定した．ける薬剤耐性菌，特に FQ 耐性あるいは低感受性 3．血清型別試験菌の出現状況について検討した．検出された該菌 FQ 低感受性株については，市販（デンカ生研）については，他の薬剤と合わせた耐性パターン，の大腸菌診断用 O 及び H 抗血清を用いて血清型毒素産生型及び血清型を調べた．また DNA ジャ別を行った．イレースサブユニット A 遺伝子（gyrA）上のキノ 4．gyrA キノロン耐性決定領域の解析ロン耐性決定領域（Quinolone resistance deter- FQ 低感受性株について，gyrA の QRDR におけ mining regions；QRDR）における変異についてもる塩基配列を解析し，変異の有無を調べた．まず，検討を加えたので報告する． Ozeki ら11）の報告した方法に準じた Polymerase 材料と方法 chain reaction（PCR）法により gyrA の検出を行っ 1．供試菌株た．プライマーは，E. coli K-12 株の gyrA 塩基配 1988∼1999 年の 12 年間に，東京において海外 a（gyrA-s：5’ -CG 列12）を基に設計された gyrA-s，旅行者下痢症患者（散発事例）より分離された CGTACTTTACGCCATGAACGTA-3’ ，gyrA-a : 1,318 株の ETEC について検討した． 5’ -ATATAACGCAGCGAGAATGGCTGCGCC TAGCGGAC-3’ ）を用いた．これにより 164bp の 2．薬剤耐性試験米国臨床検査標準委員会（NCCLS）の抗菌薬 9） DNA が増幅される．なお，変異のスクリーニングディスク感受性試験実施基準に基づき，市販の感は，制限酵素 HinfI を用いた PCR-RFLP 分析11）で，受性試験用ディスク（センシディスク；BBL）を塩基配列決定は，PCR 増幅 DNA を直接使用した用いて実施した．供試薬剤は，クロラムフェニコーダイターミネーター法13）によった．ル（CP），テトラサイクリン（TC），ストレプトマ成績イシン（SM），カナマイシン（KM），アンピシリ 1．薬剤耐性菌出現状況ン（ABPC），スルファメトキサゾール・トリメト検討した 1,318 株の ETEC において，供試したプリム合剤（ST）， NA，ホスホマイシン（FOM）， 9 種薬剤に多剤あるいは単剤耐性を示したのは及びノルフロキサシン（NFLX）の 9 種薬剤であ 608 株で，耐性率は 46.1％であった．薬剤別耐性菌る．また，NA 耐性 21 株と対照に用いた NA 感受出現状況は Table 1 にまとめた．最も耐性頻度が感染症学雑誌第75巻第9号フルオロキノロン低感受性毒素原性大腸菌 787 Table 2 Minimum inhibitory concentrations of nalidixic-acid resistant and sensitive enterotoxigenic E. coli to fluoroquinolones No. of strains with MIC（µg/ml） Drug 0.008 0.016 0.032 0.063 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 1 11 11 7 9 3 NA resistant 21 strains NFLX OFLX CPFX 1 2 16 2 LVFX TFLX 2 18 2 1 11 8 SPFX 6 15 NA sensitive 20 strains NFLX OFLX CPFX LVFX TFLX SPFX 4 1 7 6 12 6 1 14 10 9 10 5 12 10 Table 3 Annual incidence of fluoroquinolone lowsensitive enterotoxigenic E. coli isolated from overseas traveler's diarrheal cases in Tokyo Year of isolation No. of strains FQ low-sensitive strains （%） 1988 198 0 1989 1990 155 134 0 0 1991 1992 1993 1994 105 79 84 87 0 0 0 0 1995 1996 106 89 0 （ 3 3.4） 1997 1998 1999 99 144 38 （ 2 2.0） 10 （ 6.9）（ 6 15.8） Total 1,318 21 （ 1.6） 4 9 Table 4 Drug resistance-patterns of fluoroquinolone low-sensitive enterotoxigenic E. coli isolated from overseas traveler's diarrheal cases in Tokyo Resistance-pattern＊ CP TC SM ABPC ST NA TC SM ABPC ST NA FOM TC SM ABPC ST NA SM ABPC ST NA SM NA NA Total ＊Drugs No. of strains （%）（ 2 9.5）（ 1 4.8）（ 5 23.8）（ 3 14.3）（ 1 4.8）（ 9 42.9） 21 （ 100） tested: CP, TC, SM, KM, ABPC, ST, NA, FOM, and NFLX NA 耐性菌について各種 FQ に対する MIC を測定した．検出された NA 耐性菌 21 株の NA に対する MIC は全株とも＞100 µg ml であった．これ高かったのは TC（32.9％）で，次いで SM（25.7 らの FQ に対する MIC の分布を，対照に用いた％），ABPC（23.0％），ST（17.8％），CP（10.2 NA 感受性菌 20 株（NA に対する MIC 1.56∼3.12 ％），NA（1.6％），FOM（1.1％），KM（1.0％）で， µg ml）と合わせて Table 2 に示した．NFLX では NFLX 耐性株は認められなかった． 2．ナリジクス酸耐性株のフルオロキノロン系薬剤に対する MIC 分布 NA 感受性菌の MIC 分布が 0.032∼0.125 µg ml なのに対して NA 耐性菌では 1.0∼4.0 µg ml と，全体的にみて 8∼128 倍高い範囲に分布していた． FQ 耐性あるいは低感受性菌は，旧キノロン剤同様に OFLX では 0.032∼0.125 µg ml が 0.25∼ とも呼ばれる NA には高度耐性を示すことより， 1.0µg ml，CPFX では 0.008∼0.032 µg ml が 0.125 平成13年 9 月20日 788 松下秀他 Table 5 Toxin producing type and serotype of fluoroquinolone low-sensitive enterotoxigenic E. coli isolated from overseas traveler's diarrheal cases in Tokyo Toxin type＊ Serotype＊＊ No. of strains LT 4 ST 10 O 25: H− （1）,O 167: H5 （1）,O UT: H33 （1）,O UT: H− （1） O 27: H20 （1）,O 27: H− （1）,O 78: H12 （1）,O 128: H1/12（1）, O 148: H28 （1）,O 148: H− （1）,O153: H31 （1）,O 169: H41（2）, O UT: H10 （1） LT＋ST ＊LT＝Heat 7 O 6: H16 （3）,O 6: H− （1）,O 8: H9 （2）,O 78: H12 （1） labile enterotoxin, ST＝Heat stable enterotoxin ＊＊H−＝None motility, O UT＝O untypable ∼1.0 µg ml，LVFX では 0.016∼0.032 µg ml が 0.125∼0.5 µg ml，TFLX では 0.016∼0.032 µg ml が 0.25∼1.0µg ml，SPFX では 0.008∼0.032 µg ml が 0.125∼0.25µg ml であった．いずれの FQ に対しても，NA 耐性菌は NA 感受性菌に比較してかなり高い範囲の MIC 分布を示しており，低感受性であることが判明した．なお FQ 高度耐性菌は認 Table 6 Country visited by travelers with fluoroquinolone low-sensitive enterotoxigenic E. coli Country visited No. of cases India Nepal 16 3 Cambodia Egypt 1 1 められなかった．次に，この FQ 低感受性菌の年次別検出状況を Table 3 に示す．検討を始めた 1988 年から 1995 年までは全く検出されなかったが，1996 年 3 株（3.4％），1997 年 2 株（2.0％），1998 年 10 株（6.9 ％），1999 年 6 株（15.8％）と，近年急増してきている． 3．フルオロキノロン低感受性菌の耐性パターン Table 7 Mutation in the quinolone resistance determining region of the gyrA gene of fluoroquinolone low-sensitive enterotoxigenic E. coli isolated from overseas traveler's diarrheal cases in Tokyo Mutation No. of strains Ser-83 （TCG）→ Leu （TTG） Asp-87 （GAC）→ Tyr （TAC） 19 2 FQ 低感受性菌 21 株における，他薬剤と合わせた耐性パターンを Table 4 に示した．全体で 6 パターン認められているが，NA 単剤耐性菌が 9 株両毒素産生が 7 株であった．血清型は，O 血清群（42.9％）と最も多かった．多剤耐性菌のパターンだけを見ても 11 種（O 群不明を除く），H 血清群は，TC・SM・ABPC・ST・NA が 5 株，SM・を加えると 16 種の血清型に型別された． ABPC・ST・NA が 3 株，CP・TC・SM・ABPC これらの FQ 低感受性菌が分離された旅行者の・ST・NA が 2 株，TC・SM・ABPC・ST・NA 旅行先を Table 6 に示した．その訪問国は 16 件が・FOM，SM・NA がそれぞれ 1 株であった．インド，3 件がネパール，及びカンボジア，エジプ 4．フルオロキノロン低感受性菌の毒素産生型と血清型 FQ 低感受性菌における，毒素産生型及び血清トがそれぞれ 1 件であった． 5．フルオロキノロン低感受性菌の gyrA キノロン耐性決定領域における変異型を Table 5 に示した．毒素産生型は，易熱性エン検出された FQ 低感受性菌 21 株について，テロトキシン（LT）単独産生が 4 株，耐熱性エン gyrA の QRDR における塩基配列を解析し，変異テロトキシン（ST）単独産生が 10 株，LT 及び ST の有無を調べた成績を Table 7 に示した．21 株中感染症学雑誌第75巻第9号フルオロキノロン低感受性毒素原性大腸菌 789 83 位のコドンが TCG から TTG に変異し，それれており2）15）16），その原因として畜産，養鶏等の現に伴いアミノ酸がセリンからロイシンに置換して場における本剤の使用があげられている17）．ヒトいたのが 19 株，87 位のコドンが GAC から TAC から分離される ETEC は，本来ウシやブタ等の家に変異し，アミノ酸がアスパラギン酸からチロシ畜が保有しており，当然ながら動物における各種ンに置換されていたのが 2 株であった．全株とも薬剤使用の影響を受けている．これらの環境で生単一部位だけの変異で，両部位とも変異しているじた薬剤耐性菌は，飲食物等を介してヒトに伝播株は無かった．なお，両置換群の耐性傾向に，有していくものと考えられている．なお，今回の FQ 意な差は認められなかった．低感受性菌は，21 株中 19 株がインド亜大陸への考察旅行者から検出されたものであった．また，スペ ETEC は，熱帯・亜熱帯地域の開発途上国におインからインドへの旅行者下痢症患者における調いては，下痢起因菌として最も検出頻度が高く，査でも，他の地域への旅行者に比較して，高頻度我が国等の開発国から，それらの地域を訪問したにキノロン耐性 ETEC が検出されると報告され旅行者が下痢症に罹患する，いわゆる旅行者下痢ている18）．近年インドでは，赤痢様疾患やチフス症の重要な原因菌となっている8）．また国内にお症の治療にキノロン剤が積極的に用いられるよういても，本菌による集団・散発食中毒事例が，毎になっている18）19）とのことで，その影響も受けてい 14）年かなりの数報告されている．ETEC による下るものと推察される．痢症でも，症状の激しい場合は，通常抗菌剤によ次に，これら FQ 低感受性菌の年次別検出状況る化学療法がなされる．現在本菌を含めた細菌性についてみると，1988 年から検討してきている下痢症の治療には FQ が汎用されているが，近年が，1996 年に初めて検出され，1998 年は全分離株 FQ に耐性あるいは低感受性を示す，各種腸管系の 6.9％，1999 年は 15.8％と，最近その検出頻度が病原菌の出現が問題となっている1）∼6）．急増してきている．著者らがサルモネラについて本報では，東京において，1988∼1999 年の 12 同様な調査をした成績7）でも，ほぼ同時期より FQ 年間に，海外旅行者下痢症例より分離された低感受性菌の検出が急増しており，ETEC におい ETEC における，FQ 低感受性菌の出現状況，更ても同じ状況にあることが判明した．に，検出された FQ 低感受性菌については，他薬剤旧キノロン剤とも呼ばれる NA 耐性株は，今回と合わせた耐性パターン，それらの毒素産生型と検討した 6 種類の FQ いずれに対しても低感受性血清型，及び QRDR における変異について検討しであり，交差耐性を示した．また，NA 単剤耐性のた成績について述べた． 9 株を除く 12 株においては，5 種類の多剤耐性パ NA 耐性菌 21 株の 6 種 FQ に対する MIC の分ターンが認められている．ある種のキノロン耐性布を見ると，対照として用いた NA 感受性菌に比は，すべてのキノロン剤に対する耐性をもたらす較して，いずれの薬剤に対してもかなり高い範囲が，分子構造の異なる他の抗菌薬に対する感受性に分布しており，低感受性であることが判明した．には，影響を与えないとされている20）ことを裏づ英国の Central Public Health Laboratory の Thr- けるものである．毒素産生型では，ST 単独産生が elfall et al . は，CPFX における MIC が 2.0 µg ml 10 株，LT 単独産生が 4 株，両毒素産生が 7 株で以上を高度耐性，0.125∼1.0 µg ml を Low-level- あった．また，これらは 16 種の血清型に型別され resistance（低度耐性）としているが，その基準でた．即ち FQ 低感受性 ETEC は，特定の毒素産生みると，この 21 株はいずれも低度耐性菌というこ型や，血清型に集約するものではなかった． 15）とになる．大腸菌，赤痢菌，サルモネラ等のキノロン耐性欧米諸国においても，各種腸管系病原菌におけ機序における主要機作は，DNA ジャイレースサる FQ 耐性菌，あるいはここに述べたような低感ブユニット A 遺伝子 gyrA の QRDR と呼ばれる受性菌（低度耐性菌）の出現頻度の増加が報告さ部所における 83 位，あるいは 87 位のコドンの変平成13年 9 月20日 790 松下異と考えられている3）11）12）21）22）．今回の FQ 低感受性 ETEC 21 株の成績では，83 位に変異が認められたものが 19 株，87 位に変異が認められたものが 2 株で，これらはいずれも単一部位における変異であった．片方の部位だけの変異では低感受性化，両部位ともに変異が起これば高度耐性化することが知られている．今回 FQ 高度耐性菌は認められなかったが，FQ 低感受性菌の増加は，高度耐性菌の出現頻度が高くなる素地が膨らんだことを示すものと考えられ，今後の動向には引き続き監視していく必要がある．文献 1）只野敬子，新垣正夫，斎藤香彦，高橋正樹，甲斐明美，柳川義勢，他：下痢患者由来 Campylobacter jejuni のニューキノロン薬に対する薬剤感受性の年次推移．感染症誌 1996；70：1227―33. 2）Herikstad H, Hayes P, Mokhtar M, Fracaro ML, Threlfall EJ , Angulo FJ ： Emerging quinoloneresistant Salmonella in the United States. 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Countries visited by travelers with the FQ low-sensitive ETEC were India（16 cases）,Nepal（3 cases） , Cambodia（1 case） , and Egypt（1 case） . Drug resistance-patterns of the FQ low-sensitive strains, including other drugs（CP, TC, SM, KM, ABPC, ST, NA, and FOM）tested, varied among the 6 types. Among those, multidrug resistant strains accounted for 57.1％（12 strains）. The enterotoxin producing types of strains were LT（4 strains）,ST（10 strains）, and both（7 strains）. The serotypes of the strains were classified into 16 types. The quinolone resistance determining regions（QRDRs）of the gyrA genes of the FQ lowsensitive strains were sequenced. The mutations of a Ser to a Leu at position 83（Ser-83→Leu）was found in 19 strains, and Asp-87→Tyr was found in 2 strains. 平成13年 9 月20日