アプリケーションノート高効率バフィーコート抽出 Freedom EVO®プラットフォームによる信頼性の高いヒト血液からバフィーコートの抽出はじめに近年の個人診断は、一人一人に合った治療法、引いては最先端診断に際し特に有用な体液はバフィーコートと呼ばれ、これは、凝の個人医療という恩恵をもたらすために進歩し続けている。新時固していない血液を遠心分離した際に、赤血球層と血漿との間に代の研究と次世代の医療のために構想、新設された独立系非営生じる白血球と血小板の層である。これまで多くの場において、全利バイオバンクであるIntegrated Biobank of Luxembourg 血由来のバフィーコートの分離は面倒で時間のかかる手仕事で (IBBL)は、そうした医療の進歩の最前線にある。今日の発見を未あった。 IBBLの研究者は、テカン社の Freedom EVO プラット来の個別医療の革新へとつなげるには、個別医療の研究にあたフォームでの自動化プロセスを用いたバフィーコート抽出の実行り、バイオバンクが多数の患者から収集する高品質のサンプル可能性と効率を試験し、評価した。（全血、各血液分画、唾液等の体液および組織）と臨床データが必要となる。世界的なEUのバイオバンクとして、IBBLは、臨床研究バフィーコート抽出の自動化は困難ではあるが意義ある挑戦であを加速し、公衆衛生を向上させるべく、最先端のテクノロジーと共る。それぞれの採血管内にある血液の体積が異なるのに加え、例に最高品質のサンプルを幅広く提供している。えば、感染状態にあれば白血球が増加する等、バフィーコート層自体の量、粘度、組成における個人差が認められる。テカン社 Freedom EVOプラットフォームは、チューブインスペクションユニット(TIU)を備え、自動化バフィーコート抽出のために最適化されており、手動でのプロセスに比べ、優れた結果を出している。 1 アプリケーションノート材料および方法血漿機器テカン社 Freedom EVO 200 リキッドハンドリングワークステーション、8 チャンネルリキッドハンドリング(LiHa)アーム付き上層の下限モジュールピック＆プレースアーム (PnP) チューブインスペクションユニット(TIU) ロボティックマニピュレータ (RoMa) Arm Xtr-96 フラットベッドスキャナ (FluidX) Xsd-96Pro (FluidX) モジュールの説明／利点採血管のハンドリング分注先チューブ（96 本）の蓋を外す・戻すかして、940µL のバフィーコートをゆっくりと吸引して、赤血球層を Xsd-48Pro (FluidX) BDK モジュール分注先チューブ（48 本）の蓋を外す・戻すワークテーブル上で HEPA フィルターを通した空気を提供自動化作業の流れバフィーコート分離層(実測による) 採取分画下層の上限血清と血液細胞の分離レベルを確認プレートを移動赤血球層図 2 分画血液の説明図分注先チューブラックを探知手動作業の流れ手動でのバフィーコート抽出は、ピペットを使い、円を描くように動ワークテーブルのレイアウトは図 1 に示す。かき混ぜないようにして実施。遠心分離した採血管の蓋を外して Freedom EVO 200 プラットフォーム上に置き、チューブインスペクションユニットに移動。そこでレーザー光線を使ってバフィーコート層の位置を確認。リキッドハンドリングアームがらせん状に動いて 940μL のバフィーコートを吸引(図 3)し、分画を分注先となるマイクロチューブへ移す。 Freedom EVO ワークステーションの構成とスクリプト作成を最適化し、バフィーコートの収率と質を最大化。24 サンプルのバフィーコート自動化抽出の所要時間はわずか 16 分(表 1)。図 1 Freedom EVO ワークテーブル、バフィーコート(BC)抽出用に最適化し、チューブインスペクションユニットを使用。サンプルの調整自動化プロセスでのサンプルスループットサンプル数 1〜24 サンプルバッチ処理時間 24 サンプルで 16 分前後表 1 バフィーコート抽出のサンプルスループットの概要もっと大きなバッチサイズでは、所要時間は比例して増大。 K2-EDTA (BD) 10ml 採血管の血液を 2,000g で 10 分間室温にて遠心分離して、血漿、赤血球、それらの間にできた白色の薄層（バフィーコート）に分離した(図 2)。 2 アプリケーションノート DNA 収量 Freedom EVO でのバフィーコートの自動抽出のためにスクリプトを慎重に最適化した後、バフィーコートから DNA を精製して抽出の効率を確認した。約 100 名のドナーから採取した 8mL の血液サンプルから、自動化した方法または手動の方法を用いてバフィーコート抽出し、DNA を精製した。自動化抽出プロセスは、手動の抽出法と比べて、DNA 収量が多かった(表 3)。血液 8mL 図 3 バフィーコートの自動採取は、ピペットをらせん状に上から下へ動かして実施。結果 DNA 収量(µg) 25 % 75 % 111.5 184.2 n 53 自動 BC 抽出 199.1 181.6 49 239.3 表 3 バフィーコートを自動抽出したところ、手動に比べて DNA 収量が増大。白血球数の検証自動化プロセスで抽出したバフィーコートの白血球(WBC)数が正常なレベルであるか確認するため、3 名の健常人ドナーから抽出したバフィーコートでフローサイトメトリー分析を実施(表 2)。WBC の正常なサブポピュレーション率が検出された。評価対象リンパ球 (全細胞に対する%) 単球 (全細胞に対する%) 顆粒球 (全細胞に対する%) CD3 T 細胞 (リンパ球に対する%) CD19 B 細胞 (リンパ球に対する%) 手動 BC 抽出中央値 145.2 バリデーションバフィーコート抽出の効率を確認するため、手動と自動両方の抽出プロセスで同量のバフィーコートを採取した後、採血管を目視確認した。バフィーコートは、自動プロセスの方がより完全に採取された(図 4)。自動 BC#1 自動 BC#2 自動 BC#3 33.9 39.4 37.1 6.5 6.7 9.8 59.6 53.9 53.1 66.7 72.9 67.1 11.1 10.9 14.3 表 2 自動プロセスで抽出したバフィーコート中の白血球のサブポピュレーションの割合は正常である。標準抗体を使ってフローサイトメトリーの実験を BD Influx™ サイトメーターで実施。手動 BC 抽出自動 BC 抽出図 4 同量のバフィーコート採取後の採血管を手動プロセス(左の 3 本の管)と自動プロセスで比較(右の 3 本の管)。 3 アプリケーションノートさらに定量的な方法でバフィーコート抽出の効率を確認するため、フィーコートと比較して、白血球数と血小板数が多くなり、赤血球バフィーコート中の血液細胞数を数え、全血の細胞数と比較したの混入が減り、ヘモグロビンのレベルが低くなった。 (表 5)。自動プロセスで抽出したバフィーコートでは、手動抽出バ全血測定パラメータ自動 BC 抽出手動 BC 抽出総細胞数総細胞数全血に対する総細胞数全血に対する／量／量回収率(%) ／量回収率(%) 平均平均 47.2 45.0 WBC (106) 6 平均 95 26.6 56 RBC (10 ) 36107 7405 21 9020 25 HGB (g) 1.088 0.225 21 0.271 25 1931 172 69 676 35 6 PLT (10 ) 表 5 全血の血球数、ならびにバフィーコート、WBC(白血球)、RB (赤血球)、HGB(ヘモグロビン)、PLT(血小板)の自動抽出と手動抽出。結論 Freedom EVO でのバフィーコート抽出自動化により、迅速で簡便御社検査室のニーズに合わせた Freedom EVO ワークステーショかつ再現性のある抽出が可能となる。ンのカスタマイズに関するさらなる詳細は、地区担当のテカン社コ  自動化した方法で抽出したバフィーコートからの DNA 収量は、ンサルタントまでご相談ください。手動での方法より高くなる。   自動化されたバフィーコート抽出方法によって、白血球の各バイオバンク利用に関する詳細は、www.tecan.co.jp/biobanking サブポピュレーションを確認できた。まで。バフィーコートの手動抽出と比べて、自動化によって高いスループットと再現性が保証され、操作者による差もなくなり、サンプルトラッキングが自動的に行われて確実に確認するこ謝辞とが可能となる。 IBBL（所在地：6 rue Nicolas Ernest Barblé, L-1210 Luxembourg, Luxembourg）の Conny Mathay、Wim 柔軟性を最大に高め、変化する検査のニーズに答えるため、テカ Ammerlaan、Fay Betsou の各氏にはデータをご提供いただき感ン社 Freedom EVO ワークステーションは多数の拡張モジュール謝申し上げます。の装備が可能。 Tecan Group Ltd.では本文書において正確かつ最新の情報をご提供するよう最善の努力を尽くしておりますが、誤謬や脱漏が生じる可能性があります。したがって、 Tecan Group Ltd.では明示的または暗示的にかかわらず、本文書における情報の正確性または完全性につき、何らの表明または保証を行うものではありません。また、本文書は予告なく変更する場合があります。記載された商標はすべて法律によって保護されています。本文書に記載された仕様書の技術的詳細および詳しい手順については、テカンの担当者までご連絡ください。本文書で取り上げたアプリケーションおよび製品は一部の市場で入手困難な場合がありますので、営業担当者にお問い合わせください。 Tecan、Freedom EVO は主要諸国における Tecan Group Ltd.（スイス、Männedorf）の登録商標です。 ©2012 ＴｅｃａｎＴｒａｄｉｎｇスイス、著作権所有 www.tecan.com www.tecan.co.jp 397507J V1.0, 02-2013 Austria +43 62 46 89 33 Belgium +32 15 42 13 19 China +86 21 2206 3206 Denmark +45 70 23 44 50 France +33 4 72 76 04 80 Germany +49 79 51 94 170 Italy +39 02 92 44 790 Japan +81 44 556 73 11 Netherlands +31 18 34 48 174 Singapore +65 644 41 886 Spain +34 93 490 01 74Sweden +46 31 75 44 000 Switzerland +41 44 922 89 22 UK +44 118 9300 300 USA +1 919 361 5200 Other countries +41 44 922 8125 4