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博士 (医 学) 和 田 真一郎 学位論文題名 ーnducti。n 。f Macr。phage

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博 士( 医 学 ) 和田 真 一 郎
学 位論文 題名
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in Human Ovary by Human ChorionCGOnadotrophin
( ヒ ト 卵巣 に お け る ヒト 絨 毛 性 ゴ ナド ト ロ ピ ン によ る
マ クロフ ァージ 遊走 阻止因 子の誘 導)
学 位 論 文 内容 の 要 旨
目的
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inhib
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tor(MIF
) はマ ク口フアー・ジの機能に関与するサイト
カイ ンとして知られていたが、近年ては様々な特徴を有していることが解ってきている。
ヒ ト MIFは 115アミ ノ酸 残基 より なる 12
kDaの蛋 白質 で、 従来 ac
Iiva
LedT・cel
lて の存 在が 証明
され ていたが、近年ではいろいろな組織においてその存在が知られており、卵巣顆粒膜細
胞も 例外ではない。一方、卵巣機能には内分泌系のみならず免疫系が深く関与しており、
そ の 中 で も 最 も dynamicな stageで あ る 排 卵 期 に お け る サ イ ト カ イ ン の 役 割 も 明 ら か に な り
つ っ あ る 。 し か し そ の 詳 細 に つ い て は い ま だ 不 明 な こ と も 多 く 、 MIFの 卵 巣 機 能 へ の 関 与
も 知 ら れ て い ない 。本 研究 は、 主に 体外 受 精‐ 胚移 植( I
VF一ET)の 患 者よ り得 られ た血 清・
卵 胞 液 中 の MIF濃 度 を 把 握 し 月 経 周 期 と の 関 連 を 考 察 す る と と も に 、 顆 粒 膜 細 胞 の 培 養 系
に お け る humanchorionicgonadotrophin( HCG) に よ る M1F分 泌 へ の 影 響 を 解 析 し て 、 HCG
に よ り 誘 導 さ れ る 排 卵 の 過 程 と MIFと の 関 連 を 検 討 す る こ と を 目 的 と し た 。
対象と方法
IVF-ET施 行 の 患 者 の 血 清 、 IVF-ET及 び 手 術 の 際 得 ら れ た 卵 胞 液 、 卵 胞 液 中 に 含 ま れ る
顆 粒 膜 細 胞 を 材 料 と し て 用 い た 。 卵 巣 刺 激 法 に よ る IVF-ETの 方 法 は 、 卵 巣 刺 激 周 期 の 場
合 、 前 周 期 の 黄 体 期 中 期 よ り GnRH analogue
を 用い るlong pro
toco
lで 下垂 体の ゴナ ドト 口ビ
ン 分 泌 を 抑 制 し 、 human menopausaJ cionadotrophin( HMG)の 連 日 投 与に より 十分 な卵 胞成
熟 が 見 ら れ た 後 HCGを 投 与 し 、 そ の 35時 間 後 に 経 腟 超 音 波 ガ イ ド 下 に 卵 胞 穿 刺 ・ 吸 弓 1
を 行 い 、 卵 を 採 取 し た 。 症 例 に よ り 同 時 に 卵 胞 液 ・ 顆 粒 膜 細 胞 を 採 取 し た 。 2日 後 の 胚 移
植 の 後 、 HCG製 剤 及 び ブ 口 ゲ ス テ 口 ン 製 剤 を 黄 体 機 能 維 持 の た め 投 与 し た 。 自 然 周 埼 J法
に よ る IVF-ETは 、 趨 音 波 r断 層 法 に て 卵 胞 成 熟 を 確 認 し HCGを 投 与 し て 3511寺 問 後 に 卵 胞
液 を 吸 弓 Iし 卵 を 採 取 し た 。 MIFの 定 量 に 用 い る 抗 体 は 、 recombinant h
uman MIF
を 免疫 され
た ウサ ギの J
rIL清を 精製 して 得ら れた po
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抗 体を 用 いた 。抗 体の s
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tiLにて 確認 され た。 その ウサ ギ抗 ヒト MI
F抗 体を 一次 抗体 とし て、 EL
ISA法にて |f
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J.
卵胞液.j畠養上淌のM
IF
濃度 の測定を行った。
本 研 究 で は 、 以 下 の 4つ の 実 験 系 を 行 っ た 。 ( 1) 8名 の 卵 巣 刺 激 法 によ るIVFET: li析よ
り 、 H MGI)"rl出台 より d
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与 「 :1をclay
0と する )、 ◎clay
-5∼0、 ◎day
1( H
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投 与 後 35‖ 1川 後 ) 、 @ LI: ツ 2∼ 14、 の 4lgjに 分 け て 採 IrILし 、 MIF濃度 を測 定し た。 (2
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3名の卵巣刺激法によるI
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彬.の卵胞液、および r
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度 を 測定 し た。
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92.6ng/ml@ 8.2ng/ml、 と ◎ の 排 卵 期 に お い て 他 の 期 間 よ り 有 意 に 高 か っ た (P<O.OOl) 。 実
験 (2)の 血 清 中 の MIF値 ( 中 央 値 ) は 72.Ong/ml、 卵 胞 液 中 は 113.4ng/mlで あ り 、 卵 胞 液 中 で
有 意 に 高 か っ た ( Pく 0.01) 。 実 験 (3)て は 、 卵 胞 期 後 期 に お け る 卵 胞 液 中 MIF濃 度 ( 中 央 値 )
は 13.8ng/ml、 HCG投 与 後 の 排 卵 期 で は 51.6ng/mlで あ り 、 排 卵 期 に お い て 有 意 に 高 か っ た
( 尸 く 0.01) 。 実 験 (4)の 顆 粒 膜 細 胞 の 培 養 上 清 中 の MIF値 ( 中 央 値 ) は 、 HCGを 添 加 し た 群 は 、
添 加 前 の 3.2ng/mlか ら 添 加 後 7.2ng/mlに 上 昇 し ( Pく 0.05)、 HCGを 添 加 し な か っ た コ ン ト 口 ー
ル 群 で は 2.4ng/mlか ら 1.2ng/mlと 有 意 な 変 化 は な か っ た 。 HCG添 加 群 で は 、 コ ン ト 口 ー ル
群 に 比 し て 有 意 に MIF
の 産 生 が 亢 進 し た (P
く 0.
05)
。
考察
本 研 究 で は 、 IVF-ETの 患 者 に お い て 、 排 卵 誘 発 に よ る 卵 巣 内 の 環 境 の 変 化 に 伴 う 血 清
MIF値 の 変 化 を 検 討 し 、 HCG投 与 翌 日 の 排 卵 期 に お い て 顕 著 に 増 加 す る こ と が 初 め て 示 さ
れ た 。 ま た 、 排 卵 期 に お い て 血 清 中 よ り 卵 胞 液 中 の MIF値 が 高 < 、 卵 胞 液 中 の MIF値 が
HCG投 与 に よ り 増 加 し 、 さ ら に 培 養 実 験 よ り HCGの 刺 激 に よ り 顆 ・ 粒 膜 細 胞 で の MIF産 生
が亢進した。
す で に 培 養 顆 粒 膜 細 胞 に お い て 、 Western blot法 、 RT-PCR法 に よ り MIFの 存 在 と 発 現 が
証 明 さ れ て い る 。 さ ら に 、 卵 巣 は HCGの 主 な 標 的 臓 器 で あ り 、 HCGが 卵 巣 の 顆 粒 膜 細 胞
や 自 血 球 な ど の 浸 潤 細 胞 を 刺 激 す る こ と か ら 、 MIFの 産 生 が 促 さ れ 、 血 中 濃 度 が 上 昇 す る
ことが示唆される。
近 年 、 MIFbsT-cellの 他 、 macrophage、 脳 下 垂 体 前 葉 な ど の 細 胞 よ り 、 様々 な炎 症や 生理
学 的なス トレスに反応して分泌されていることが明らかになってきている。また、排卵は
成 熟 卵 胞 に luteiniZlng hormone (LH). HCGが 作 用 し て 惹 起 さ れ る が 、 そ の際 様々 な免 疫反
応 が見ら れ、排卵は一種の炎症であると言われている。従って、排卵期に卵巣の細胞が刺
激 さ れ 、 そ の 免 疫 反 応 の 過 程 で MIFが 産 生 さ れ 、 血 中 濃 度 の 上 昇 が 認 め ら れ る こ と が 推 測
さ れる 。加 えて 、MIF
は tum
or n
ecro
sis fact
or-ば(TNF
-ぱ )に 反応 して 発現 する こと が知られ
て お り 、 TNF-aが 排 卵 の 重 要 な medialorで あ る pr
osta
glan
dinを誘 導す るこ とか らも 、排 卵と
の 関 係 が 示 唆 さ れ る 。 一 方 で 、 MIFが 、 HCG処 理 に 反 応 し て 卵 巣 内 の macrophageて 発 現 さ
れ るnit
ric oxid
e sy
nthas
eを 誘導 する こと も報 告さ れて おり 、複 数の pa
ihxv
ayで M
IFが排卵の
mediaiorと な っ て い る 可 能 性 が あ る 。 排 卵 の 一 行 程 で あ る 卵 胞 破 裂 に 関 し て は 、 LHの 刺 激
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rなどの活性化が
不 可 欠 で あ る 。 MIFに よ り plasminogcnが 活 性 化 さ れ る こ と か ら 、 卵 胞 破 裂 の mcdiatorと な
っている可能性カiある。
以 上 、 MIFと 排 卵 との 関係 につ いて 考察 を 述べ たが 、現 時点 では その 詳翁 lH
ま 不叨 であ り、
ま た HCGが ど の よ う な機 序で MI
F産 生を 刺激 する かも |リ ]ら かに され て おら ず、 今後 の剛 f
究
課題である。
学 位 論 文 審 査 の要 旨
主 査 教 授 石 橋 輝
雄
副 査 教 授 本 間 研
一
副 査 教 授 藤 本 征 一 郎
学位論文題名
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in Human Ovary by Human Chorionlc Gonadotrophin
(ヒト卵 巣におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンによる
マクロファージ遊走阻止因子の誘導)
ヒ トmacr
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MI
F)
は11
5アミノ酸残基よりなる12
kD
aの蛋白
質 で あ る が 、 MIFの 卵 巣 機 能 へ の 関 与 は 知 ら れ て い な い 。 本 研 究 は 、 主 に 体 外 受 精 ‐ 胚 移
植 (IVF-ET)の 患 者 よ り 得 ら れ た 血 清 ・ 卵 胞 液 中 の MIF濃 度 を 把 握 し 、 月 経 周 期 と の 関 連 を
考 察 す る と と も に 、 顆 粒 膜 細 胞 の 培 養 系 に お け る hum
an ch
orio
nic gona
dotr
ophi
n(HCG
)に よ
る MIF分 泌 へ の 影 響 を 解 析 し て 、 HCGに よ り 誘 導 さ れ る 排 卵 の 過 程 と MIFと の 関 連 を 検 討
することを目的とした。
IVF-ET施 行 の 患 者 の 血 清 、 IVF-ET及 び 手 術 の 際 得 ら れ た 卵 胞 液 、 卵 胞 液 中 に 含 ま れ る
顆 粒 膜 細 胞 を 用 い た 。 卵 巣 刺 激 法 に よ る IVF-ETの 方 法 は 、 前 周 期 の 黄 体 期 中 期 よ り GnRH
analogueを 用 い る long pr
otoco
lで 下垂 体の ゴナ ドト ロビ ン分 泌を 抑制 し、 hu
man menop
ausa
l
gonadotrophin(HMG)の 連 日 投 与 に よ り 十 分 な 卵 胞 成 熟 が 見 ら れ た 後 HCGを 投 与 し 、 そ の 3
5時 間 後 に 経 腟 超 音 波 ガ イ ド 下 に 卵 胞 穿 刺 ・ 吸 引 を 行 い 、 卵 を 採 取 し た 。 症 例 に よ り 同 時
に 卵 胞 液 ・ 顆 粒 膜 細 胞 を 採 取 し た 。 自 然 周 期 法 に よ る IVF-ETは 、 超 音 波 断 層 法 に て 卵 胞
成 熟 を 確 認 し HCGを 投 与 し て 35時 間 後 に 卵 胞 液 を 吸 引 し 卵 を 採 取 し た 。 MIFの 定 量 に 用
い る 抗 体 は 、 recombinant human MIFを 免 疫 さ れ た ウ サ ギ の 血 清 を 精 製 し て 得 ら れ た
p
olycl
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抗 体を 用い た。 抗体 の s
peci
tici
tyはWest
ern blot法にて確認され た。そのウサギ抗
ヒ ト MIF抗 体 を 一 次 抗 体 と し て 、 ELISA法 に て 血 清 ・ 卵 胞 液 ・ 培 養 上 清 の MIF濃 度 の 測 定
を行った。
本 研 究 で は 、 以 下 の 4つ の 実 験 系 を 行 っ た 。 (i)8名 の 卵 巣 刺 激 法 に よ る IVF-ET患 者 よ
り 、 @ HMG開 始 よ り dayー 6(HCG投 与 日 を dayOと す る ) 、 ◎ day− 5∼ 0、 ◎ dayl(HCG投 与
後 35時 間 後 ) 、 @ day2∼ 14、 の 4期 に 分 け て 採 血 し 、 MIF濃 度 を 測 定 し た 。 (2)13名 の
卵 巣 刺 激 法 に よ る IVF-ET患 者 の 卵 胞 液 、 お よ び 同 時 に 採 取 し た 血 液 の MIF濃 度 を 測 定 し
た 。 (3)9名 の 自 然 周 期 に お け る 卵 胞 期 後 期 の 患 者 よ り 手 術 の 際 得 ら れ た 卵 胞 液 、 お よ び
8名 の 自 然 周 期 に お け る IVF-ET患 者 よ り 、 HCG投 与 35時 間 後 の 排 卵 期 に 得 ら れ た 卵 胞 液
に つ い て MIF濃 度 を 測 定 し た 。 (4)5名 の IVFー ET患 者 よ り 得 ら れ た 卵 胞 液 中 の 顆 粒 膜 細 胞
を Ham-F 10に お い て 2群 に 分 け て 24時 間 培 養 し 、 一 方 に HCG 0.5 IU/Lを 添 加 し 、 非 添 加 群
を コ ン ト 口 ー ル と し て さ ら に 24時 間 培 養 し , 培 養 上 滴 中 の MIF濃 度 を 測 定 し た 。
デ ー タ の 統 計 学 的 解 析 は、 実験 (1
)で はKru
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実験(1
)のIV
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患者 の周lg
J別の血 清M
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(中 央値)は 、@12
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l、◎ 1
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卵 におい て他の! 卵間より有意に高かった(卩く0
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)
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験(2)の血 清 中 のMIFt
ll(中央 f直 ) は72.O
ng
/m
l、卵胞 液中は 1
13
.4
ng
/m
lであり 、卵胞液 中で有
意に 高 か った (P<
O.Ol
) 。 実 験(3)で は、 卵 胞 期後 ! 卵 にお け る 卵胞 液 中M
IF濃度(中 央他)は
13. 8ng/m1、 HCG投 与 後 の 排 卵 j明 で は 51
.6ng
/mlであ り 、 排卵 ! 弸 にお い て 有意 に 高 か った
(′)〈 0
.01)。実験 (4
) の顆粒膜細胞の培養上消中のM
IF
他(中央他)は、HC
G
を添加した群で
は、添カ‖前の3
.2
n
g
/m
l
から添加後7
.2
n
g
/ml
に上昇し(P
・〈0
,0
5
)、H
C
G
を添加しなかったコント
口ー ル 群 では 2.4n
g/
m1から1.2
n〆ml
と 有意な変 化はなか った。 H
CG
添加 群(24
時 間後)で は、
コントロール群に比して有意にM
I
Fの産生が亢進した(P
l
く0
.05
)。
本 研 究 で は 、 IVF一 ETの 患 者 に お い て 、 排 卵 誘 発 に よ る 卵 巣 内 の 環 境 の 変 化 に 伴 う 血 清
MIF値 の 変 化 を 検 討 し 、 HCG投 与 翌 日 の 排 卵 期 に お い て 顕 著 に 増 加 す る こ と が 初 め て 示 さ
れ た 。 ま た 、 排 卵 期 に お い て 血 清 中 よ り 卵 胞 液 中 の MIF値 が 高 く 、 卵 胞 液 中 の MIF値 が
HCG投 与 に よ り 増 加 し 、 さ ら に 培 養 実 験 よ り HCGの 刺 激 に よ り 顆 粒 膜 細 胞 で の MIF産 生 が
亢進することが初めて示された。
公 開 発 表 に 際 し 、 副 査 の 本 間 教 授 か ら 、 自 然 周 期 の 排 卵 期 の 血 清 MIF濃 度 、 自 然 周 期 の
排 卵 期 卵 胞 液 中 の MIF濃 度 の 上 昇 の 理 由 、 培 養 系 で の HCGに 対 す る dose一 response、 MIFが
排 卵 に 関 与 す る 機 構 な ど に っ い て 質 問 が あ っ た 。 副 査 の 藤 本 教 授 か ら 、 培 養 実 験 の HCG
添 加 濃 度 設 定 の 背 景 、 排 卵 期 に お け る 血 清 中 と 卵 胞 液 中 の MIF濃 度 比 が 性 ス テ ロ イ ド ホ ル
モ ン 濃 度 比 と 大 き く 異 な る 理 由 、 HCGが 顆 粒 膜 細 胞 以 外 の 組 織 な ど に 作 用 す る こ と の 可
能 性 、 卵 胞 数 と MIF濃 度 と の 関 係 な ど に つ い て 質 問 が あ っ た 。 最 後 に 主 査 の 石 橋 教 授 か
ら 、 卵 胞 成 熟 度 と 血 清 中 、 卵 胞 液 中 の MIF濃 度 と の 関 係 、 排 卵 期 に お い て MIFの 上 昇 は
HCG投 与 の 前 か 後 か に っ い て 、 ま た 卵 胞 液 中 と 血 清 中 の MIFの 分 子 構 造 の 差 異 の 有 無 に つ
いてなどの質問があった。
い ず れ の 質 問 に 対 し て も 、 申 請 者 は 、 対 象 症 例 の 統 計 学 的解 析 結 果、 文 献 的情 報 、 自身
の臨床経験をもとに概ね妥当な回答をなしえた。
審 査 員 一 同 は 、 ヒ ト 排 卵 機 構 の 解 明 に MIFの 関 与 の 可 能 性 を 初 め て 示 唆 し た 本 研 究 の 成
果 を 高 く評 価 し 、申 請 者 が博 士 ( 医学 ) の 学位 を 受 け るの に 十 分な 資 格 を有 す る もの と 判 定
した。
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