博士（医学）和田真一郎学位論文題名 I ndu cti on of lV Ia c ro ph ag el VI ig ra t io n In hi b it or yF ac to r in Human Ovary by Human ChorionCGOnadotrophin （ヒト卵巣におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンによるマクロファージ遊走阻止因子の誘導）学位論文内容の要旨目的 macr opha gc m igra tlon inhib itor yrac tor（MIF ）はマク口フアー・ジの機能に関与するサイトカインとして知られていたが、近年ては様々な特徴を有していることが解ってきている。ヒト MIFは 115アミノ酸残基よりなる 12 kDaの蛋白質で、従来 ac Iiva LedT・cel lての存在が証明されていたが、近年ではいろいろな組織においてその存在が知られており、卵巣顆粒膜細胞も例外ではない。一方、卵巣機能には内分泌系のみならず免疫系が深く関与しており、その中でも最も dynamicな stageである排卵期におけるサイトカインの役割も明らかになりつっある。しかしその詳細についてはいまだ不明なことも多く、 MIFの卵巣機能への関与も知られていない。本研究は、主に体外受精‐ 胚移植（ I VF一ET）の患者より得られた血清・卵胞液中の MIF濃度を把握し月経周期との関連を考察するとともに、顆粒膜細胞の培養系における humanchorionicgonadotrophin（ HCG）による M1F分泌への影響を解析して、 HCG により誘導される排卵の過程と MIFとの関連を検討することを目的とした。対象と方法 IVF-ET施行の患者の血清、 IVF-ET及び手術の際得られた卵胞液、卵胞液中に含まれる顆粒膜細胞を材料として用いた。卵巣刺激法による IVF-ETの方法は、卵巣刺激周期の場合、前周期の黄体期中期より GnRH analogue を用いるlong pro toco lで下垂体のゴナドト口ビン分泌を抑制し、 human menopausaJ cionadotrophin（ HMG)の連日投与により十分な卵胞成熟が見られた後 HCGを投与し、その 35時間後に経腟超音波ガイド下に卵胞穿刺・吸弓 1 を行い、卵を採取した。症例により同時に卵胞液・顆粒膜細胞を採取した。 2日後の胚移植の後、 HCG製剤及びブ口ゲステ口ン製剤を黄体機能維持のため投与した。自然周埼 J法による IVF-ETは、趨音波 r断層法にて卵胞成熟を確認し HCGを投与して 3511寺問後に卵胞液を吸弓 Iし卵を採取した。 MIFの定量に用いる抗体は、 recombinant h uman MIF を免疫されたウサギの J rIL清を精製して得られた po lycl onal 抗体を用いた。抗体の s pcci tIc ity はWc sl cr n blo tiLにて確認された。そのウサギ抗ヒト MI F抗体を一次抗体として、 EL ISA法にて｜f It l' J．卵胞液．j畠養上淌のM IF 濃度の測定を行った。本研究では、以下の 4つの実験系を行った。（ 1） 8名の卵巣刺激法によるIVFET: li析より、 H MGI)"rl出台より d ciy6（ H CG4x 与「：1をclay 0とする）、 ◎clay -5∼0、 ◎day 1（ H CG 投与後 35‖ 1川後）、＠ LI：ツ 2∼ 14、の 4lgjに分けて採 IrILし、 MIF濃度を測定した。 (2 )1 3名の卵巣刺激法によるI VF -ET :l I 彬．の卵胞液、および r 司‖寺に採取したf f Il i 俊のMI F 濃度を測定した。(3 )9 彩のI！I 然JI f 4！りH こおける卯j l di g ] 後！明の患者より手術の際得られた卵胞i 皮、および8彩のI -然J II Hj tJ JにおけるIV FET - I: 街より、HC G投与35 11 :川後の剖！9 Hi U Jに得られたりI J 讐られた 9 ‖ 胞i伐rl i の馳 ’！粒J l i ; ll J亅笹 ff攵について MI FoTi¥度を測定した。（ ↓ ） 5 彩のI VF-ET -L:者より f ‖ 笹をH amFl （）において2 ft． I に //｝けて 2 4I IJ ff f・ II J培養し、一方に HCG ().5 IU/Lを j忝ん rlし、ゴ I；添ん l ｜のM I Fd l ! 度を測定した。胖をコント口ールとしてさらに 24lI:r「 f‖ 培養し，よ藷養上浦 l データの統li I ．っぇ I ’I ′、J ん乍析は、災験（ 1 ）ではK r u s k ニI トW こl l l i sI cS t およ乙ド p o St h OC c om p ar i so n に sc1 1c rr c｜ St cs t、 (2 )および (4 )では Wi lc c) ¥o ii si (T nじ c l -r ニl n kt cs t 、 (3)では Mann-ヽ｀ nlitncy U-tcsiを川 1、た。 l tl 'i果火験（1 ）のI V FE T -L : 行のJ I ｜；J ！［JJ りl J のI 「｜［＾ f j MI F tc i ‘f （I I ｜火f I 「D は、 ◎12 . ln c '/ m l ◎1 7. 5 nt こ／rn l ◎ 92.6ng/ml＠ 8.2ng/ml、と ◎ の排卵期において他の期間より有意に高かった (P<O.OOl）。実験 (2)の血清中の MIF値（中央値）は 72.Ong/ml、卵胞液中は 113.4ng/mlであり、卵胞液中で有意に高かった（ Pく 0.01）。実験 (3)ては、卵胞期後期における卵胞液中 MIF濃度（中央値）は 13.8ng/ml、 HCG投与後の排卵期では 51.6ng/mlであり、排卵期において有意に高かった（尸く 0.01）。実験 (4)の顆粒膜細胞の培養上清中の MIF値（中央値）は、 HCGを添加した群は、添加前の 3.2ng/mlから添加後 7.2ng/mlに上昇し（ Pく 0.05)、 HCGを添加しなかったコント口ール群では 2.4ng/mlから 1.2ng/mlと有意な変化はなかった。 HCG添加群では、コント口ール群に比して有意に MIF の産生が亢進した (P く 0. 05) 。考察本研究では、 IVF-ETの患者において、排卵誘発による卵巣内の環境の変化に伴う血清 MIF値の変化を検討し、 HCG投与翌日の排卵期において顕著に増加することが初めて示された。また、排卵期において血清中より卵胞液中の MIF値が高＜、卵胞液中の MIF値が HCG投与により増加し、さらに培養実験より HCGの刺激により顆・粒膜細胞での MIF産生が亢進した。すでに培養顆粒膜細胞において、 Western blot法、 RT-PCR法により MIFの存在と発現が証明されている。さらに、卵巣は HCGの主な標的臓器であり、 HCGが卵巣の顆粒膜細胞や自血球などの浸潤細胞を刺激することから、 MIFの産生が促され、血中濃度が上昇することが示唆される。近年、 MIFbsT-cellの他、 macrophage、脳下垂体前葉などの細胞より、様々な炎症や生理学的なストレスに反応して分泌されていることが明らかになってきている。また、排卵は成熟卵胞に luteiniZlng hormone (LH)． HCGが作用して惹起されるが、その際様々な免疫反応が見られ、排卵は一種の炎症であると言われている。従って、排卵期に卵巣の細胞が刺激され、その免疫反応の過程で MIFが産生され、血中濃度の上昇が認められることが推測される。加えて、MIF は tum or n ecro sis fact or-ば(TNF -ぱ）に反応して発現することが知られており、 TNF-aが排卵の重要な medialorである pr osta glan dinを誘導することからも、排卵との関係が示唆される。一方で、 MIFが、 HCG処理に反応して卵巣内の macrophageて発現されるnit ric oxid e sy nthas eを誘導することも報告されており、複数の pa ihxv ayで M IFが排卵の mediaiorとなっている可能性がある。排卵の一行程である卵胞破裂に関しては、 LHの刺激によりp r os t a gl a n di ne n d op e ro x i desy n i ha s e 、c ol l a ge n as e ヽp l as m i no g e na ct l v at o rなどの活性化が不可欠である。 MIFにより plasminogcnが活性化されることから、卵胞破裂の mcdiatorとなっている可能性カiある。以上、 MIFと排卵との関係について考察を述べたが、現時点ではその詳翁 lH ま不叨であり、また HCGがどのような機序で MI F産生を刺激するかも｜リ］らかにされておらず、今後の剛 f 究課題である。学位論文審査の要旨主査教授石橋輝雄副査教授本間研一副査教授藤本征一郎学位論文題名 I n du ct io no fr v I a cr o p h ag e: N/ I i g ra t i o nI n h ib i t o ryF a ct o r in Human Ovary by Human Chorionlc Gonadotrophin （ヒト卵巣におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンによるマクロファージ遊走阻止因子の誘導）ヒトmacr opha ge m igra tlon inhi bito ry f ac to r( MI F) は11 5アミノ酸残基よりなる12 kD aの蛋白質であるが、 MIFの卵巣機能への関与は知られていない。本研究は、主に体外受精 ‐ 胚移植 (IVF-ET)の患者より得られた血清・卵胞液中の MIF濃度を把握し、月経周期との関連を考察するとともに、顆粒膜細胞の培養系における hum an ch orio nic gona dotr ophi n(HCG )による MIF分泌への影響を解析して、 HCGにより誘導される排卵の過程と MIFとの関連を検討することを目的とした。 IVF-ET施行の患者の血清、 IVF-ET及び手術の際得られた卵胞液、卵胞液中に含まれる顆粒膜細胞を用いた。卵巣刺激法による IVF-ETの方法は、前周期の黄体期中期より GnRH analogueを用いる long pr otoco lで下垂体のゴナドトロビン分泌を抑制し、 hu man menop ausa l gonadotrophin(HMG)の連日投与により十分な卵胞成熟が見られた後 HCGを投与し、その 3 5時間後に経腟超音波ガイド下に卵胞穿刺・吸引を行い、卵を採取した。症例により同時に卵胞液・顆粒膜細胞を採取した。自然周期法による IVF-ETは、超音波断層法にて卵胞成熟を確認し HCGを投与して 35時間後に卵胞液を吸引し卵を採取した。 MIFの定量に用いる抗体は、 recombinant human MIFを免疫されたウサギの血清を精製して得られた p olycl onal 抗体を用いた。抗体の s peci tici tyはWest ern blot法にて確認された。そのウサギ抗ヒト MIF抗体を一次抗体として、 ELISA法にて血清・卵胞液・培養上清の MIF濃度の測定を行った。本研究では、以下の 4つの実験系を行った。 (i)8名の卵巣刺激法による IVF-ET患者より、＠ HMG開始より dayー 6(HCG投与日を dayOとする）、 ◎ day− 5∼ 0、 ◎ dayl(HCG投与後 35時間後）、＠ day2∼ 14、の 4期に分けて採血し、 MIF濃度を測定した。 (2)13名の卵巣刺激法による IVF-ET患者の卵胞液、および同時に採取した血液の MIF濃度を測定した。 (3)9名の自然周期における卵胞期後期の患者より手術の際得られた卵胞液、および 8名の自然周期における IVF-ET患者より、 HCG投与 35時間後の排卵期に得られた卵胞液について MIF濃度を測定した。 (4)5名の IVFー ET患者より得られた卵胞液中の顆粒膜細胞を Ham-F 10において 2群に分けて 24時間培養し、一方に HCG 0.5 IU/Lを添加し、非添加群をコント口ールとしてさらに 24時間培養し，培養上滴中の MIF濃度を測定した。データの統計学的解析は、実験 (1 )ではKru skaトWal lis t estおよびpos t ho c co mpari sonに S ch eI Te ｜S i es t 、( 2 )および(4 ) ではWi l c ox o ns i gn e dr a nkte s t 、( 3 )ではM a nn ーW h i tn e yU te s t を用いた。実験(1 )のIV FET 患者の周lg J別の血清M IF fti 'i （中央値）は、＠12 .l ng /m l、◎ 1 7. 5 n g/ m l、◎ 9 2. 6n g/ ml 、@ 8. 2n g/ ml 、と ◎の排卵j 卵において他の！卵間より有意に高かった（卩く0 . 00 1 ) 。実験(2)の血清中のMIFt ll(中央 f直）は72.O ng /m l、卵胞液中は 1 13 .4 ng /m lであり、卵胞液中で有意に高かった (P< O.Ol ）。実験(3)では、卵胞期後！卵における卵胞液中M IF濃度（中央他）は 13． 8ng/m1、 HCG投与後の排卵 j明では 51 .6ng /mlであり、排卵！弸において有意に高かった（′）〈 0 ．01）。実験（4 ）の顆粒膜細胞の培養上消中のM IF 他（中央他）は、HC G を添加した群では、添カ‖前の3 ．2 n g ／m l から添加後7 ．2 n g ／ml に上昇し（P ・〈0 ，0 5 ）、H C G を添加しなかったコント口ール群では 2．4n g/ m1から1．2 n〆ml と有意な変化はなかった。 H CG 添加群（24 時間後）では、コントロール群に比して有意にM I Fの産生が亢進した（P l く0 ．05 ）。本研究では、 IVF一 ETの患者において、排卵誘発による卵巣内の環境の変化に伴う血清 MIF値の変化を検討し、 HCG投与翌日の排卵期において顕著に増加することが初めて示された。また、排卵期において血清中より卵胞液中の MIF値が高く、卵胞液中の MIF値が HCG投与により増加し、さらに培養実験より HCGの刺激により顆粒膜細胞での MIF産生が亢進することが初めて示された。公開発表に際し、副査の本間教授から、自然周期の排卵期の血清 MIF濃度、自然周期の排卵期卵胞液中の MIF濃度の上昇の理由、培養系での HCGに対する dose一 response、 MIFが排卵に関与する機構などにっいて質問があった。副査の藤本教授から、培養実験の HCG 添加濃度設定の背景、排卵期における血清中と卵胞液中の MIF濃度比が性ステロイドホルモン濃度比と大きく異なる理由、 HCGが顆粒膜細胞以外の組織などに作用することの可能性、卵胞数と MIF濃度との関係などについて質問があった。最後に主査の石橋教授から、卵胞成熟度と血清中、卵胞液中の MIF濃度との関係、排卵期において MIFの上昇は HCG投与の前か後かにっいて、また卵胞液中と血清中の MIFの分子構造の差異の有無についてなどの質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は、対象症例の統計学的解析結果、文献的情報、自身の臨床経験をもとに概ね妥当な回答をなしえた。審査員一同は、ヒト排卵機構の解明に MIFの関与の可能性を初めて示唆した本研究の成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと判定した。