クロストリジウム・ボツリナムの発酵、およびボツリヌス毒素医薬組成物の

JP 2007-506427 A 2007.3.22
(57)【要約】
クロストリジウム・ボツリナムの発酵、およびボツリヌス毒素医薬組成物の調製に使用
するボツリヌス毒素の取得のための培地および方法。本発明の成長培地は、顕著に低下し
たレベルの肉副生成物または乳副生成物を含有し得、動物由来生成物の代わりに非動物由
来生成物を使用しうる。好ましくは、使用する培地は動物由来生成物を実質的に含まない
。
(2)
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性なボツリヌス毒素を取得する方法であって、
（ a）動物由来生成物を実質的に含まない発酵培地を用意する工程、
（ b）ボツリヌス毒素の生産を可能にする条件下で発酵培地中にクロストリジウム・ボツ
リナム（ Clostridium botulinum）細菌を培養する工程、および
（ c）発酵培地から生物学的に活性なボツリヌス毒素を回収する工程
を含む方法。
【請求項２】
発酵培地を用意する工程において、培地が植物由来のタンパク質生成物を含む、請求項
10
1に記載の方法。
【請求項３】
植物が大豆である、請求項 2に記載の方法。
【請求項４】
培養工程において、培養物の細胞密度が細胞溶解によって低下するまで培養を行う、請
求項 1に記載の方法。
【請求項５】
培養工程において、細胞密度が細胞溶解によって最初に低下してから少なくとも 48時間
後まで培養を行う、請求項 1に記載の方法。
【請求項６】
20
ボツリヌス毒素の生産方法であって、
（ a）動物由来生成物を実質的に含まず、かつ植物由来のタンパク質生成物を含む第 1培地
を用意する工程、
（ b）クロストリジウム・ボツリナムの成長を可能にする条件下で、第 1培地中にクロスト
リジウム・ボツリナム細菌を培養する工程、
（ c）動物由来生成物を実質的に含まず、かつ植物由来のタンパク質生成物を含む第 2培地
を用意する工程、
（ d）第 1培地を第 2培地に接種する工程、
（ e）ボツリヌス毒素の生産を可能にする条件下で、第 2培地中にクロストリジウム・ボツ
リナム細菌を培養する工程、および
30
（ f）ボツリヌス毒素を回収する工程
を含む方法。
【請求項７】
第 1培地を用意する工程において、第 1培地が大豆由来のタンパク質生成物を含み、かつ
第 2培地に接種する工程において、第 2培地が大豆由来のタンパク質生成物を含む、請求項
6に記載の方法。
【請求項８】
第 1培地を用意する工程において、第 1培地が加水分解大豆を含み、かつ第 2培地に接種
する工程において、発酵培地が加水分解大豆を含む、請求項 6に記載の方法。
【請求項９】
40
第 1培地中でクロストリジウム・ボツリナムを培養する工程において、条件が約 34℃ の
温度を含むと共に、培養中に細胞密度の低下が起こらないことを含み、かつ
第 1培地を第 2培地に接種する工程において、 2から 4%の第 1培地を第 2培地の接種に使用
し、かつ
第 2培地中で細菌を培養する工程において、成長を可能にする条件が約 34℃ の温度を含
むと共に、培養物の細胞密度が細胞溶解によって低下するまで培養することを含む、
請求項 6に記載の方法。
【請求項１０】
クロストリジウム・ボツリナムおよびボツリヌス毒素生産用培養培地を含む組成物であ
って、培地が動物由来生成物を実質的に含まず、かつ植物由来のタンパク質生成物を含む
50
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、組成物。
【請求項１１】
植物が大豆である、請求項 10に記載の組成物。
【請求項１２】
加水分解大豆を含む、請求項 10の組成物。
【請求項１３】
活性成分がボツリヌス毒素である、動物性生成物を実質的に含まない医薬組成物を製造
する方法であって、
（ a）（ i）動物由来生成物を実質的に含まない発酵培地を用意し、
（ ii）ボツリヌス毒素の生産を可能にする条件下で、発酵培地中にクロストリジウ
10
ム・ボツリナムを培養し、そして
（ iii）発酵培地から生物学的に活性なボツリヌス毒素を回収する
ことによって生物学的に活性なボツリヌス毒素を取得する工程、
（ b）ボツリヌス毒素を適切な賦形剤と配合することにより、活性成分がボツリヌス毒素
である、動物性生成物を実質的に含まない医薬組成物を製造する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的に活性なボツリヌス毒素を取得するための培地および方法に関する。
20
特に本発明は、生物学的に活性なボツリヌス毒素を大量に取得するための、動物性生成物
を実質的に含まない培地、培養物および嫌気発酵法（クロストリジウム・ボツリナム（ Cl
ostridium botulinum）細菌などの生物の）に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療、診断、研究または美容を目的とするヒトまたは動物への投与に適した医薬組成物
は活性成分を含むことができる。医薬組成物は 1つ以上の賦形剤、緩衝剤、担体、安定剤
、保存剤および／または増量剤も含むことができる。医薬組成物中の活性成分はボツリヌ
ス毒素などの生物学的物質でありうる。ボツリヌス毒素は、 1つ以上の動物由来生成物（
例えば肉汁培地、および血液分画または血液由来の賦形剤）を利用する培養、発酵および
30
配合方法によって取得することができる。動物由来生成物を利用する方法によって取得し
た活性成分の生物学的物質を含む医薬組成物の患者への投与により、様々な病原体または
感染因子をもらう潜在的危険に、その患者をさらすことになりうる。例えば医薬組成物に
はプリオンが存在しうる。プリオンは、正常タンパク質を作る配列と同じ核酸配列から異
常コンフォメーションアイソフォームとして生じると考えられているタンパク質性感染粒
子である。また、感染性は、翻訳後レベルでの正常アイソフォームタンパク質からプリオ
ンタンパク質アイソフォームへの「補充（ recruitment）反応」に存在するとも考えられ
ている。正常な内因性細胞性タンパク質が病原性プリオンコンフォメーションへミスフォ
ールド (misfold)するように誘導されるようである。
【０００３】
40
クロイツフェルト・ヤコブ病は、伝染性因子がプリオンタンパク質の異常アイソフォー
ムであるらしいヒト伝染性海綿状脳症の稀な神経変性障害である。クロイツフェルト・ヤ
コブ病患者は見かけ上の完全な健康状態から 6ヶ月以内に無動無言状態へと悪化しうる。
したがって、動物由来生成物を使って取得されたボツリヌス毒素などの生物学的物質を含
有する医薬組成物の投与により、クロイツフェルト・ヤコブ病などのプリオン媒介疾患を
もたらす潜在的危険が存在しうる。
【０００４】
ボツリヌス毒素
クロストリジウム属には 127を越える種があり、形態学および機能に従って分類されて
いる。嫌気性グラム陽性細菌であるクロストリジウム・ボツリナムは、ボツリヌス中毒と
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して知られる神経麻痺性障害をヒトおよび動物において引き起こす強力なポリペプチド神
経毒であるボツリヌス毒素を産生する。クロストリジウム・ボツリナムおよびその胞子は
共に土壌中に見出され、該細菌は、滅菌と密閉が不適切な零細缶詰工場の食品容器内で増
殖する可能性があり、これが多くのボツリヌス中毒症例の原因である。ボツリヌス中毒の
影響は、通例、クロストリジウム・ボツリナムの培養物または胞子で汚染された食品を飲
食した 18∼ 36時間後に現れる。ボツリヌス毒素は、消化管内を弱毒化されないで通過する
ことができ、そして末梢運動ニューロンを攻撃することができるようである。ボツリヌス
毒素中毒の症状は、歩行困難、嚥下困難および会話困難から、呼吸筋の麻痺および死にま
で進行し得る。
【０００５】
10
A型ボツリヌス毒素は、人類に知られている最も致死性の天然の生物学的物質である。
ボツリヌス毒素（精製された神経毒複合体） A型の約 50ピコグラムがマウスにおける LD5 0
である。モル基準で A型ボツリヌス毒素の致死力はジフテリアの 18億倍、シアン化ナトリ
ウムの 6億倍、コブロトキシンの 3000万倍、コレラの 1200万倍である。 Natuaral Toxins I
I［ B. R. Singhら編、 Plenum Press、ニューヨーク（ 1976）］の Singh、 Critical Aspect
s of Bacterial Protein Toxins、第 63∼ 84頁（第 4章）（ここで、記載される A型ボツリ
ヌス毒素 LD5 0 0.3ng＝ 1Uとは、 BOTOX（登録商標）約 0.05ng＝ 1Uという事実に補正される
）。 BOTOX（登録商標）は、 Allergan， Inc．（カリフォルニア州アービン）から市販され
ている A型ボツリヌス毒素精製神経毒複合体の商標である。 1単位（ U）のボツリヌス毒素
は、それぞれが 18∼ 20グラムの体重を有するメスの Swiss Websterマウスに腹腔内注射さ
20
れたときの LD5 0 として定義される。
【０００６】
7種類の血清学的に異なるボツリヌス神経毒が特徴付けられており、これらは、型特異
的抗体による中和によってそのそれぞれが識別されるボツリヌス神経毒血清型 A、 B、 C1 、
D、 E、 Fおよび Gである。ボツリヌス毒素のこれらの異なる血清型は、それらが冒す動物種
、ならびにそれらが惹起する麻痺の重篤度および継続時間が異なる。例えば、 A型ボツリ
ヌス毒素は、ラットにおいて生じる麻痺率により評価された場合、 B型ボツリヌス毒素よ
りも 500倍強力であることが確認されている。また、 B型ボツリヌス毒素は、霊長類では 48
0U/kgの投与量で非毒性であることが確認されている。この投与量は、 A型ボツリヌス毒素
の霊長類 LD5 0 の約 12倍である。ボツリヌス毒素は、コリン作動性の運動ニューロンに大き
30
な親和性で結合して、ニューロンに移動し、アセチルコリンのシナプス前放出を阻止する
ようである。
【０００７】
ボツリヌス毒素は、例えば活動過多な骨格筋によって特徴付けられる神経筋障害を処置
するために臨床的状況において使用されている。 A型ボツリヌス毒素（ BOTOX（登録商標）
）は、本態性眼瞼痙攣、斜視および片側顔面痙攣を 12歳を越える患者において処置するた
めに、また頸部ジストニアの処置のため、および眉間（顔面）しわの処置のために、米国
食品医薬品局によって承認されている。 FDAはまた、頸部ジストニアの処置のための B型ボ
ツリヌス毒素も承認している。末梢注射（例えば筋肉内または皮下） A型ボツリヌス毒素
の臨床的効果は、通常、注射後 1週間以内およびしばしば数時間以内に認められる。 A型ボ
40
ツリヌス毒素の単回筋肉内注射による症候緩和（例えば弛緩性筋肉麻痺）の典型的な継続
時間は約 3ヶ月 ∼ 約 6ヶ月であり得る。
【０００８】
すべてのボツリヌス毒素血清型が神経筋接合部における神経伝達物質アセチルコリンの
放出を阻害するようであるが、そのような阻害は、種々の神経分泌タンパク質に作用し、
かつ／またはこれらのタンパク質を異なる部位で切断することによって行われる。 A型ボ
ツリヌス毒素は、細胞内小胞関連タンパク質 SNAP-25のペプチド結合を特異的に加水分解
しうる亜鉛エンドペプチダーゼである。 E型ボツリヌス毒素も、 25キロダルトン（ kD）の
シナプトソーム関連タンパク質（ SNAP-25）を切断するが、 A型ボツリヌス毒素とは異なる
タンパク質内アミノ酸配列を標的とする。 B型、 D型、 F型および G型のボツリヌス毒素は小
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胞関連タンパク質（ VAMP、これはまたシナプトブレビンとも呼ばれる）に作用し、それぞ
れの血清型によってこのタンパク質は異なる部位で切断される。最後に、 C1 型ボツリヌス
毒素は、シンタキシンおよび SNAP-25の両者を切断することが明らかにされている。作用
機序におけるこれらの相違が、様々なボツリヌス毒素血清型の相対的な効力および／また
は作用の継続時間に影響していると考えられる。
【０００９】
血清型に関係なく、毒素中毒の分子メカニズムは類似し、少なくとも 3つの過程または
段階を含むようである。第 1段階において、毒素は、重鎖（ H鎖）と細胞表面受容体との特
異的相互作用によって、標的ニューロンのシナプス前膜に結合する。受容体は、ボツリヌ
ス毒素の各血清型およびボツリヌス毒素で異なると考えられる。 H鎖のカルボキシル末端
10
セグメント (HC )は、毒素を細胞表面に指向させるのに重要であるようである。
【００１０】
第 2段階において、毒素は、冒した細胞の形質膜を横切る。毒素は、初めに、受容体媒
介エンドサイトーシスにより細胞に包み込まれ、毒素を含有するエンドソームが形成され
る。次に、毒素は、エンドソームから該細胞の細胞質中に逃れ出る。この最後の段階は、
約 5.5またはそれ以下の pHに反応して毒素のコンフォメーション変化を誘発する H鎖のアミ
ノ末端セグメント (HN )によって媒介されると考えられる。エンドソームは、エンドソーム
内 pHを低下させるプロトンポンプを有することが既知である。コンフォメーションのシフ
トは毒素中の疎水性残基を露出させ、これが、毒素をエンドソーム膜内に埋込むことを可
能にする。次に、毒素が、エンドソーム膜を通って細胞質ゾルに移動する。
20
【００１１】
ボツリヌス毒素活性のメカニズムの最終段階は、 H鎖および L鎖を結合するジスルフィド
結合の減少を伴うようである。ボツリヌス毒素およびボツリヌス毒素の全毒素活性は、ホ
ロトキシンの L鎖に含まれる。 L鎖は亜鉛 (Zn
+ +
)エンドペプチダーゼであり、これは、神経
伝達物質を含有する小胞の認識および形質膜の細胞質表面とのドッキングならびに小胞と
形質膜との融合に必須であるタンパク質を選択的に開裂する。ボツリヌス神経毒、ボツリ
ヌス毒素 B、 D、 Fおよび G型は、シナプトソーム膜タンパク質であるシナプトブレビン [小
胞関連膜タンパク質 (VAMP)とも称される ]の分解を引き起こす。シナプス小胞の細胞質表
面に存在する大部分の VAMPは、これらの開裂現象のいずれかの結果として除去される。各
毒素は異なる結合を特異的に開裂する。
30
【００１２】
ボツリヌス毒素タンパク質分子の分子量は、既知のボツリヌス毒素血清型の 7つのすべ
てについて約 150kDである。興味深いことに、これらのボツリヌス毒素は、会合する非毒
素タンパク質とともに 150kDのボツリヌス毒素タンパク質分子を含む複合体としてクロス
トリジウム属細菌によって放出される。例えば、 A型ボツリヌス毒素複合体は、 900kD、 50
0kDおよび 300kDの形態としてクロストリジウム属細菌によって産生され得る。 B型および C
1
型のボツリヌス毒素は 500kDの複合体としてのみ産生されるようである。 D型ボツリヌス
毒素は 300kDおよび 500kDの両方の複合体として産生される。最後に、 E型および F型のボツ
リヌス毒素は約 300kDの複合体としてのみ産生される。これらの複合体（すなわち、約 150
kDよりも大きな分子量）は、非毒素のヘマグルチニンタンパク質と、非毒素かつ非毒性の
40
非ヘマグルチニンタンパク質とを含むと考えられる。これらの 2つの非毒素タンパク質（
これらは、ボツリヌス毒素分子とともに、関連する神経毒複合体を構成し得る）は、変性
に対する安定性をボツリヌス毒素分子に与え、そして毒素が摂取されたときに消化酸から
の保護を与えるように作用すると考えられる。また、より大きい（分子量が約 150kDより
も大きい）ボツリヌス毒素複合体は、ボツリヌス毒素複合体の筋肉内注射部位からのボツ
リヌス毒素の拡散速度を低下させ得ると考えられる。毒素複合体は、 pH7.3において赤血
球で処理することにより、毒素タンパク質とヘマグルチニンタンパク質に解離しうる。毒
素タンパク質は、ヘマグルチニンタンパク質から解離すると非常に不安定である。
【００１３】
すべてのボツリヌス毒素血清型は、神経活性となるためにはプロテアーゼによって切断
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またはニッキングされなければならない不活性な単鎖タンパク質として、クロストリジウ
ム・ボツリナム細菌により合成される。 A型および G型のボツリヌス毒素血清型を産生する
細菌株は内因性プロテアーゼを有するので、 A型および G型の血清型は細菌培養物から主に
その活性型で回収することができる。これに対して、 C1 型、 D型および E型のボツリヌス毒
素血清型は非タンパク質分解性菌株によって合成されるので、培養から回収されたときに
は、典型的には不活性型である。 B型および F型の血清型はタンパク質分解性菌株および非
タンパク質分解性菌株の両方によって産生されるので、活性型または不活性型のいずれで
も回収することができる。しかし、例えば、 B型ボツリヌス毒素を産生するタンパク質分
解性菌株でさえも、産生された毒素の一部を切断するだけである。
【００１４】
10
切断型分子と非切断型分子との正確な比率は培養時間の長さおよび培養温度に依存する
。したがって、例えば B型ボツリヌス毒素の製剤はいずれも一定割合が不活性であると考
えられ、このことが、 A型ボツリヌス毒素と比較した B型ボツリヌス毒素の知られている著
しく低い効力の原因であると考えられる。臨床製剤中に存在する不活性なボツリヌス毒素
分子は、その製剤の総タンパク質量の一部を占めることになるが、このことはその臨床的
効力に寄与せず、抗原性の増大に関連づけられている。また、 B型ボツリヌス毒素は、筋
肉内注射された場合、同じ用量レベルの A型ボツリヌス毒素よりも、活性の継続期間が短
く、そしてまた効力が低いことも知られている。
【００１５】
インビトロでの研究により、ボツリヌス毒素が、脳幹組織の初代細胞培養物からのアセ
20
チルコリンおよびノルエピネフリンの両方の、カリウムカチオンにより誘導される放出を
阻害することが示されている。また、ボツリヌス毒素は、脊髄ニューロンの初代培養物に
おけるグリシンおよびグルタメートの両方の誘発された放出を阻害すること、そして脳の
シナプトソーム調製物において、ボツリヌス毒素が神経伝達物質のアセチルコリン、ドー
パミン、ノルエピネフリン、 CGRPおよびグルタメートのそれぞれの放出を阻害することが
報告されている。
【００１６】
7
クロストリジウム・ボツリナムの Hall A株から、 ≧ 3× 10 U／ mg、 A2 6 0 ／ A2 7 8 0.60未満
、およびゲル電気泳動における明確なバンドパターンという特性を示す高品質結晶 A型ボ
ツリヌス毒素を生成し得る。 Schantz, E. J.ら、 Properties and use of Botulinum toxi
30
n and Other Microbial Neurotoxins in Medicine、 Microbiol Rev． 56:80-99（ 1992）に
記載されているように既知の Schanz法を用いて結晶 A型ボツリヌス毒素を得ることができ
る。通例、 A型ボツリヌス毒素複合体を、適当な培地中で A型クロストリジウム・ボツリナ
ムを培養した嫌気培養物から分離および精製し得る。硫酸での沈殿によって粗毒素を採り
、限外マイクロ濾過によって濃縮することができる。酸沈殿物を塩化カルシウムに溶解す
ることによって精製を行いうる。次いで、毒素を冷エタノールで沈殿させうる。沈殿物を
7
リン酸ナトリウムに溶解し、遠心しうる。次いで、乾燥して、比効力 3× 10 LD5 0 U／ mgま
たはそれ以上の 900kD結晶 A型ボツリヌス毒素複合体を得ることができる。この既知の方法
を用い、非毒素タンパク質を分離除去して、例えば次のような純ボツリヌス毒素を得るこ
8
ともできる：比効力 1∼ 2× 10 LD5 0 U／ mgまたはそれ以上の分子量約 150kDの精製 A型ボツリ
40
8
ヌス毒素；比効力 1∼ 2× 10 LD5 0 U／ mgまたはそれ以上の分子量約 156kDの精製 B型ボツリヌ
7
ス毒素；および比効力 1∼ 2× 10 LD5 0 U／ mgまたはそれ以上の分子量約 155kDの精製 F型ボツ
リヌス毒素。
【００１７】
ボツリヌス毒素（ 150kD分子）およびボツリヌス毒素複合体（ 300kD∼ 900kD）は例えば
、 List Biological Laboratories, Inc.（キャンベル、カリフォルニア）； the Centre f
or Applied Microbiology and Research（ポートン・ダウン、イギリス）； Wako（日本、
大阪）；および Sigma Chemicals（セントルイス、ミズーリ）から入手し得る。市販のボ
ツリヌス毒素含有医薬組成物には、次のものが包含される： BOTOX（登録商標）（ A型ボツ
リヌス毒素神経毒複合体とヒト血清アルブミンおよび塩化ナトリウムを含む。使用前に 0.
50
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9％塩化ナトリウムで再構成する凍結乾燥粉末として、 100単位バイアルで、カリフォルニ
ア、アーヴィンの Allergan, Inc.から入手可能。）、 Dysport（登録商標）（ A型ボツリヌ
ス毒素ヘマグルチニン複合体とヒト血清アルブミンおよびラクトースを製剤中に含む。使
用前に 0.9％塩化ナトリウムで再構成する粉末として、イギリス、バークシャーの Ipsen L
imitedから入手可能。）、および MyoBloc（登録商標）（ B型ボツリヌス毒素、ヒト血清ア
ルブミン、コハク酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含む pH約 5.6の注射可能な溶液。
アイルランド、ダブリンの Elan Corporationから入手可能。）。
【００１８】
種々の臨床症状の治療における A型ボツリヌス毒素の成功は、他のボツリヌス毒素血清
型への関心を高めている。すなわち、少なくとも A型、 B型、 E型および F型のボツリヌス毒
10
素がヒトに対し臨床的に用いられている。更に、純粋（約 150kDa）ボツリヌス毒素がヒト
の処置に用いられている。例えば、 Kohl A. ら、 Comparison of the effect of botulinu
m toxin (Botox(R)) with the highly-purified neurotoxin(NT201) in the extensor di
gitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000;15(補遺 3):165参照。すなわち、純粋（
約 150kDa）ボツリヌス毒素を使用して医薬組成物を調製することができる。
【００１９】
A型ボツリヌス毒素は pH4∼ 6.8で希水溶液に可溶であることが知られている。約 7を越え
る pHでは、安定化非毒性タンパク質が神経毒から解離し、その結果、特に pHおよび温度が
上がるほど、毒性が徐々に失われる。 Jankovic, J.ら、 Therapy with Botulinum Toxin,
Marcel Dekker, Inc (1994)の第 3章の Schantz E.J.ら、 Preparation and characterizati
20
on of botulinum toxin type A for human treatment（特に第 44-45頁）。
【００２０】
酵素一般について言えるように、ボツリヌス毒素（細胞内ペプチダーゼ）の生物学的活
性は、少なくとも部分的にはその三次元形状に依存する。すなわち、 A型ボツリヌス毒素
は、熱、種々の化学薬品、表面の伸長および表面の乾燥によって無毒化される。しかも、
既知の培養、発酵および精製によって得られた毒素複合体を、医薬組成物に使用する非常
に低い毒素濃度まで希釈すると、適当な安定剤が存在しなければ毒素の無毒化が急速に起
こることが知られている。毒素を mg量から ng／ ml溶液へ希釈するのは、そのような大幅な
希釈によって毒素の比毒性が急速に低下する故に、非常に難しい。毒素含有医薬組成物を
製造後、何箇月も、または何年も経過してから毒素を使用することもあるので、毒素をア
30
ルブミンおよびゼラチンのような安定剤で安定化することができる。
【００２１】
ボツリヌス毒素が臨床的に様々に使用されていることが報告されており、その例には下
記のものが含まれる：
（ 1）頸部ジストニーを処置するための筋肉内注射（多数の筋肉）あたり約 75単位 ∼ 125単
位の BOTOX（登録商標）；
（ 2）眉間のしわを処置するための筋肉内注射あたり約 5単位 ∼ 10単位の BOTOX（登録商標
）（ 5単位が鼻根筋に筋肉内注射され、 10単位がそれぞれの皺眉筋に筋肉内注射される）
；
（ 3）恥骨直腸筋の括約筋内注射による便秘を処置するための約 30単位 ∼ 80単位の BOTOX（
40
登録商標）；
（ 4）上瞼の外側瞼板前部眼輪筋および下瞼の外側瞼板前部眼輪筋に注射することによっ
て眼瞼痙攣を処置するために筋肉あたり約 1単位 ∼ 5単位の筋肉内注射される BOTOX（登録
商標）；
【００２２】
（ 5）斜視を処置するために、外眼筋に、約 1単位 ∼ 5単位の BOTOX（登録商標）が筋肉内注
射されている。この場合、注射量は、注射される筋肉のサイズと所望する筋肉麻痺の程度
（すなわち、所望するジオプター矯正量）との両方に基づいて変化する。
（ 6）卒中後の上肢痙性を処置するために、下記のように 5つの異なる上肢屈筋に BOTOX（
登録商標）が筋肉内注射される：
50
(8)
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（ a）深指屈筋： 7.5U∼ 30U
（ b）浅指屈筋： 7.5U∼ 30U
（ c）尺側手根屈筋： 10U∼ 40U
（ d）橈側手根屈筋： 15U∼ 60U
（ e）上腕二頭筋： 50U∼ 200U。 5つの示された筋肉のそれぞれには同じ処置時に注射され
るので、患者には、それぞれの処置毎に筋肉内注射によって 90U∼ 360Uの上肢屈筋 BOTOX（
登録商標）が投与される。
(7)偏頭痛を治療するために、 25Uの BOTOX(登録商標 )を頭蓋周囲に注射する (眉間、前頭
および側頭筋に対称的に注射する )：該注射は、偏頭痛頻度、最大重症度、付随嘔吐およ
び急性薬剤使用の減少 (25U注射後の 3ヶ月間にわたる )によって評価した場合に、ビヒクル
10
と比較して、偏頭痛の予防療法として有意な利益を与える。
【００２３】
A型ボツリヌス毒素は、最大 12ヶ月の有効性を有し (European J.Neurology 6(Supp 4),
S111-S1150, 1999)、ある場合には 27ヶ月間にもわたる有効性を有しうることが既知であ
る (Laryngoscope 109, 1344-1346, 1999)。しかし、 BOTOX (登録商標 )筋肉注射の通常の
持続期間は一般に約 3∼ 4ヶ月間である。
【００２４】
市販のボツリヌス毒素含有医薬組成物は、 BOTOX（登録商標）（カリフォルニア、アー
ヴィンの Allergan， Inc．から入手可能）の名称で市販されている。 BOTOX（登録商標）は
、精製 A型ボツリヌス毒素複合体、ヒト血清アルブミンおよび塩化ナトリウムから成り、
20
無菌の減圧乾燥形態で包装されている。この A型ボツリヌス毒素は、 N-Zアミンおよび酵母
エキスを含有する培地中で増殖させたボツリヌス菌の Hall株の培養物から調製する。その
A型ボツリヌス毒素複合体を培養液から一連の酸沈殿によって精製して、活性な高分子量
毒素タンパク質および結合ヘマグルチニンタンパク質から成る結晶複合体を得る。結晶複
合体を、塩およびアルブミンを含有する溶液に再溶解し、滅菌濾過（ 0.2μ ）した後、減
圧乾燥する。 BOTOX（登録商標）は、筋肉内注射前に、防腐していない無菌塩類液で再構
成し得る。 BOTOX（登録商標）の各バイアルは、 A型ボツリヌス毒素複合体約 100単位（ U）
、ヒト血清アルブミン 0.5mgおよび塩化ナトリウム 0.9mgを、防腐剤不含有の無菌減圧乾燥
形態で含有する。
【００２５】
30
減圧乾燥 BOTOX（登録商標）を再構成するには、防腐剤不含有の無菌生理食塩水（ 0.9％
Sodium Chloride Injection）を使用し、適量のその希釈剤を適当な大きさの注射器で吸
い上げる。 BOTOX（登録商標）は、泡立てまたは同様の激しい撹拌によって変性しうるの
で、そのバイアルに希釈剤を穏やかに注入する。滅菌性の理由から、 BOTOX（登録商標）
は、再構成した後 4時間以内に投与すべきである。その間、再構成 BOTOX（登録商標）は冷
蔵庫（ 2∼ 8℃ ）内で保管する。再構成 BOTOX（登録商標）は、無色透明で、粒状物を含ま
ない。減圧乾燥生成物は、冷凍庫内で -5℃ またはそれ以下の温度で保管する。
【００２６】
概ね、クロストリジウム・ボツリナムの 4つの生理学的分類群 (I、 II、 III、 IV)が認識
されている。血清学的に特定の毒素を産生し得る菌が、複類の生理学的分類群に属し得る
。例えば、 Bおよび F型の毒素は、第 I群または第 II群の株が産生し得る。更に、ボツリヌ
ス神経毒を産生し得る他のクロストリジウム属の株 [クロストリジウム・バラッティ (C． b
aratii)、 F型；クロストリジウム・ブチリカム（ C． butyricum)、 E型；クロストリジウム
・ノビイ (C． novyi)、 C1 または D型 ]が特定されている。
【００２７】
クロストリジウム・ボツリナム種の生理学的分類群を、表１に示す。
40
(9)
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【表１】
10
20
【００２８】
前記毒素型は、クロストリジウム・ボツリナム菌の適当な生理学的分類群からの選択に
よって調製し得る。第 I群の菌は通例、タンパク質分解性とされ、 A、 Bおよび F型のボツリ
ヌス毒素を産生する。第 II群の菌は糖分解性で、 B、 Eおよび F型のボツリヌス毒素を産生
する。第 III群の菌は、 Cおよび D型のボツリヌス毒素しか産生せず、多量のプロピオン酸
を産生する点で、第 I群および第 II群の菌と区別される。第 IV群の菌は、 G型神経毒しか産
生しない。
【００２９】
30
動物性生成物を実質的に含まない特定の培地を用いて破傷風毒素を取得することが知ら
れている。米国特許 6558926号参照。しかしとりわけ、該特許に開示された「動物性生成
物不含有」培地でさえも、肉消化物である Bacto-peptoneを用いている。重要なことに、
クロストリジウム・テタニ（ Clostridium tetani）による破傷風毒素の産生と、クロスト
リジウム・ボツリナム細菌によるボツリヌス毒素の産生とは、必要とする成長、培地およ
び発酵パラメータおよび考慮すべき事項において異なる。例えば Johnson, E.A.ら , Clost
ridium botulinum and its neurotoxins: a metabolic and cellular perspective, Toxi
con 39(2001), 1703-1722参照。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
40
【００３０】
したがって必要とされているのは、生物学的に活性なボツリヌス毒素を取得または生産
するための、動物由来タンパク質などの動物性生成物を含まないまたは実質的に含まない
、培地および方法である。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
概要
本発明はこの要求を満たし、生物学的に活性なボツリヌス毒素を取得または生産するた
めの、動物由来タンパク質などの動物性生成物を含まないまたは実質的に含まない、培地
および方法を提供する。取得されたボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素活性成分医薬組成
50
(10)
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物を製造するために使用することができる。
【００３２】
定義
本明細書で使用する場合、下記の単語または用語は下記の定義を持つ。
「約」とは、そのように修飾された事項、パラメータまたは用語が、明記した事項、パ
ラメータまたは用語の値の上下に ± 10%の範囲を包含することを意味する。
【００３３】
「投与」または「投与する」とは、医薬組成物を対象に与える（すなわち投与する）ス
テップを意味する。本明細書に開示する医薬組成物は、例えば筋肉内（ i.m.）、皮内、皮
下投与、髄腔内投与、頭蓋内、腹腔内（ i.p.）投与、局所外用（経皮）およびインプラン
10
ト（すなわちポリマーインプラントまたはミニ浸透圧ポンプなどの徐放装置の植込み）投
与経路などによって「局所投与」される。
【００３４】
「動物性生成物を含まない」または「動物性生成物を実質的に含まない」は、それぞれ
「動物性タンパク質を含まない」または「動物性タンパク質を実質的に含まない」を包含
し、血液由来、血液プールおよび他の動物由来生成物または化合物の不在または実質的不
在を意味する。「動物」とは哺乳動物（ヒトなど）、鳥、爬虫類、魚、昆虫、クモまたは
他の動物種を意味する。細菌などの微生物は「動物」から除外される。したがって、本発
明に包含される動物性生成物を含まない培地もしくは方法または動物性生成物を実質的に
含まない培地もしくは方法は、ボツリヌス毒素またはクロストリジウム・ボツリナム細菌
20
を含むことができる。例えば、動物性生成物を含まない方法または動物性生成物を実質的
に含まない方法とは、動物由来タンパク質、例えば免疫グロブリン、肉消化物、肉副生成
物および乳汁または乳生成物もしくは乳消化物を実質的に含まない、または基本的に含ま
ない、または全く含まない方法を意味する。したがって、動物性生成物を含まない方法の
一例は、肉および乳生成物または肉もしくは乳副生成物を排除した方法（例えば細菌培養
法または細菌発酵法）である。
【００３５】
「ボツリヌス毒素」は、クロストリジウム・ボツリナムによって産生される神経毒、お
よび非クロストリジウム種によって組換え生産されたボツリヌス毒素（またはその軽鎖も
しくは重鎖）を意味する。本明細書で使用する「ボツリヌス毒素」という表現は、ボツリ
30
ヌス毒素血清型 A、 B、 C、 D、 E、 Fおよび Gを包含する。また、本明細書で使用するボツリ
ヌス毒素は、ボツリヌス毒素複合体（すなわち 300、 600および 900kDa複合体）も、精製ボ
ツリヌス毒素（すなわち約 150kDa）も包含する。「精製ボツリヌス毒素」は、ボツリヌス
毒素複合体を形成するタンパク質などの他のタンパク質から分離された、またはそれら他
のタンパク質から実質的に分離された、ボツリヌス毒素と定義される。精製ボツリヌス毒
素は 95％より高い純度を持ち得、好ましくは 99％より高い純度を持つ。神経毒でないボツ
リヌス C2 および C3 細胞毒は、本発明の範囲からは除外される。
【００３６】
「クロストリジウム神経毒」は、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・
ブチリカム（ Clostridium butyricum）またはクロストリジウム・ベラッティ（ Clostridi
40
um beratti）などのクロストリジウム細菌から産生される神経毒、またはそれらクロスト
リジウム細菌に固有の神経毒、および非クロストリジウム種によって組換え生産されたク
ロストリジウム神経毒を意味する。
【００３７】
「全く含まない」（または「からなる」という用語法）とは、使用する機器または方法
の検出範囲内で、その物質を検出することができないこと、またはその存在を確認するこ
とができないことを意味する。
「基本的に含まない」（または「から基本的になる」）とは、その物質が痕跡量しか検
出され得ないことを意味する。
【００３８】
50
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「固定」とは、対象が 1つ以上の身体部分を動かすのを妨げるステップを意味する。十
分な数の身体部分が固定されれば、その対象は相応に固定されることになる。したがって
「固定」は、肢などの身体部分の固定および／または対象の完全な固定を包含する。
【００３９】
「修飾ボツリヌス毒素」とは、天然ボツリヌス毒素と比較して、そのアミノ酸の少なく
とも 1つが欠失、修飾、または置換されたボツリヌス毒素である。さらに修飾ボツリヌス
毒素は、組換え生産された神経毒、または組換え生産された神経毒の誘導体もしくは断片
であることもできる。修飾ボツリヌス毒素は、例えばボツリヌス毒素受容体に結合する能
力またはニューロンからの神経伝達物質放出を阻害する能力などといった天然ボツリヌス
毒素の生物学的活性を、少なくとも 1つは保持している。修飾ボツリヌス毒素の一例は、
10
あるボツリヌス毒素血清型（例えば血清型 A）由来の軽鎖および異なるボツリヌス毒素血
清型（例えば血清型 B）由来の重鎖を持つボツリヌス毒素である。修飾ボツリヌス毒素の
もう 1つの例は、サブスタンス Pなどの神経伝達物質に結合されたボツリヌス毒素である。
【００４０】
「患者」とは、医療または獣医療を受けるヒトまたは非ヒト対象を意味する。したがっ
て、本明細書に開示する組成物は、哺乳動物などの任意の動物の処置に使用しうる。
【００４１】
「医薬組成物」とは、製剤を意味し、その活性成分はボツリヌス毒素であることができ
る。「製剤」という単語は、その医薬組成物中に神経毒活性成分の他に少なくとも 1つの
追加成分が存在することを意味する。したがって医薬組成物は、ヒト患者などの対象への
20
診断的または治療的投与（例えば筋肉内注射もしくは皮下注射による投与またはデポー剤
もしくはインプラントの挿入による投与）に適した製剤である。医薬組成物は、凍結乾燥
状態もしくは真空乾燥状態にあるか、凍結乾燥もしくは真空乾燥した医薬組成物を食塩水
もしくは水を使用して復元した後に生成した溶液であるか、または復元を必要としない溶
液として存在しうる。活性成分は、ボツリヌス毒素血清型 A、 B、 C1 、 D、 E、 Fもしくは Gの
1つまたはボツリヌス毒素（いずれもクロストリジウム細菌によって自然に産生されうる
もの）でありうる。上述のように、医薬組成物は液体または固体、例えば真空乾燥物であ
ることができる。医薬組成物の構成成分は、単一組成物（すなわち、医薬組成物の初期配
合時に、必要な復元液を除く全ての構成成分が存在する）に含まれるか、または二構成要
素系として、例えば食塩水などの希釈剤（この場合の希釈剤は医薬組成物の初期配合時に
30
存在しない成分を含有する）で復元される真空乾燥した組成物などとして含まれうる。二
構成要素系には、長期間貯蔵するのに二構成要素系の第 1構成要素とあまり適合しない成
分を組み込むことができるという利点がある。例えば復元用のビヒクルまたは希釈剤は、
使用期間中（例えば 1週間の冷蔵貯蔵中）は微生物成長に対する十分な防護をもたらすが
、毒素を分解するかもしれないので 2年間の冷凍貯蔵期間中は存在させない保存剤を含む
ことができる。長期間はクロストリジウム毒素または他の成分と適合しないかもしれない
他の成分は、このようにして組み込むことができる；すなわち、使用直前に第 2ビヒクル
（例えば復元液）に加えることができる。ボツリヌス毒素活性成分医薬組成物を調製する
方法は、米国特許出願公開第 2003/0118598号（ A1）に開示されている。
【００４２】
40
「実質的に含まない」とは、当該医薬組成物の 1wt%未満のレベルで存在することを意味
する。
「治療製剤」とは、ある製剤が、ある障害または疾患、例えば末梢筋の活動亢進（すな
わち痙縮）を特徴とする障害または疾患を、処置およびそれにより軽減するために使用で
きることを意味する。
【００４３】
本発明は、動物性副生成物または乳副生成物のレベルが少なくとも低下している培地、
好ましくは動物性副生成物または乳副生成物を実質的に含まない培地を提供する。「動物
性副生成物または乳副生成物」とは、インビボであるかインビトロであるかにかかわらず
、動物細胞（細菌細胞を除く）において、または動物細胞（細菌細胞を除く）によって産
50
(12)
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生された、任意の化合物または化合物の組合せを意味する。タンパク質、アミノ酸、およ
び窒素などの培地成分の好ましい非動物性供給源として、植物、微生物（酵母など）およ
び合成化合物が挙げられる。
【００４４】
本発明は、動物性副生成物または乳副生成物を実質的に含まない少なくとも 1つの培地
を使ってボツリヌス毒素を取得する方法も提供する。例えば、動物性生成物を実質的に含
まない発酵培地中でクロストリジウム・ボツリナムを培養することによって、ボツリヌス
毒素を取得することができる。
【００４５】
本発明は、動物性生成物を実質的に含まず植物由来生成物を含む発酵培地でクロストリ
10
ジウム・ボツリヌナムを培養することによって取得されるボツリヌス毒素も包含する。ま
た、動物性生成物を実質的に含まずいくつかの大豆系生成物を含む発酵培地中でクロスト
リジウム・ボツリナムを培養することによって、ボツリヌス毒素を取得することもできる
。
【００４６】
もう 1つの好ましい実施形態として、動物性生成物を実質的に含まず、動物由来生成物
の代替物として加水分解大豆を含有する発酵培地中でクロストリジウム・ボツリナムを培
養することによって、ボツリヌス毒素を取得することができる。好ましくは、発酵培地に
おける成長は、少なくとも細胞溶解が起こるまで進行する。発酵培地の接種に用いるクロ
ストリジウム・ボツリナム源は、クロストリジウム・ボツリナムを含有する種培地から得
20
ることができる。種培地中で成長させて発酵培地用接種物として用いるクロストリジウム
・ボツリナムは、好ましくは、細胞溶解を起こしていない。種培地の接種に用いるクロス
トリジウム・ボツリナム源は、凍結乾燥培養物から得ることができる。クロストリジウム
・ボツリナムは、畜乳または豆乳中の培養物として凍結乾燥することができる。クロスト
リジウム・ボツリナムは、好ましくは、豆乳中の培養物として凍結乾燥される。
【００４７】
本発明はまた、クロストリジウム・ボツリナムを培養するため、動物由来生成物を実質
的に含まない培地を含む組成物を提供する。
【００４８】
一実施形態において、本組成物は、動物由来生成物を実質的に含まず、かつ少なくとも
30
1つの非動物源由来の生成物を含有し、さらにクロストリジウム・ボツリナムを含む培地
を含む。
【００４９】
もう 1つの実施形態において、本組成物は、動物由来生成物を実質的に含まず、かつ少
なくとも 1つの植物由来の生成物を含有し、さらにクロストリジウム・ボツリナムを含む
培地を含む。本発明のもう 1つの実施形態は、動物由来生成物を実施的に含まず、かつ少
なくとも 1つの大豆由来の生成物を含有し、さらにクロストリジウム・ボツリナムを含む
培地を含む組成物でありうる。
【００５０】
説明
40
本発明は、生物学的に活性なボツリヌス毒素を産生する能力を持つ生物（例えばクロス
トリジウム・ボツリナム細菌）の培養および発酵に役立つ、動物性生成物または動物性副
生成物を含まないまたは実質的に含まない培地および方法の発見に基づいている。取得さ
れるボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素活性成分医薬組成物の製造に使用することができ
る。したがって本明細書には肉副生成物または乳副生成物のレベルが著しく低下している
培地を開示し、好ましい培地実施形態はそのような動物性生成物を実質的に含まない。
【００５１】
本発明は、クロストリジウム・ボツリナム成長用培地に動物系生成物が必要でないとい
う本発明者の驚くべき発見、特に、そのようなクロストリジウム・ボツリナム成長用培地
に通例使用される動物系生成物を植物系生成物に代替することができるという本発明者の
50
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驚くべき発見を包含する。
【００５２】
細菌の成長および発酵に現在使用されている培地は、通常、 1つ以上の動物由来成分を
含む。本発明によれば、好ましいクロストリジウム・ボツリナム成長用培地は、培地の総
重量の約 5から約 10%を越えない量の動物由来成分を含有する。より好ましくは、本発明の
範囲に包含される培地は、培地の総重量の約 1%以下ないし約 5%未満の動物由来生成物を含
む。最も好ましくは、ボツリヌス毒素を生産するためのクロストリジウム・ボツリナムの
成長に使用される全ての培地および培養物は、動物由来生成物を全く含まない。これらの
培地には、クロストリジウム・ボツリナムの小規模および大規模発酵用の培地、種（第1
）培地および発酵（第 2）培地の接種に用いられるクロストリジウム・ボツリナム培養物
10
の成長用培地、ならびにクロストリジウム・ボツリナム培養物（例えば保存培養物）の長
期保存に用いられる培地が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５３】
本発明のある好ましい実施形態において、クロストリジウム・ボツリナム成長用および
ボツリヌス毒素生産用の培地は、動物由来生成物の代わりに大豆系生成物を含むことがで
きる。あるいは、大豆系生成物の代わりに、ルピナス・カンペストリス（ Lupinus campes
tris）の脱苦味種子を使用することができる。 L.カンペストリス種子のタンパク質分は大
豆のものとよく似ていることが知られている。好ましくは、これらの培地は、加水分解さ
れるおよび水に可溶である大豆由来生成物または L.カンペストリス由来生成物を含む。し
かし本発明では、不溶性の大豆生成物または L.カンペストリス生成物も、動物性生成物を
20
代替するために使用することができる。大豆生成物または L.カンペストリス生成物で代替
することができる一般的な動物由来生成物として、牛心臓浸出液（ BHI）、動物由来ペプ
トン生成物、例えば Bacto-peptone、加水分解カゼイン、および畜乳などの乳副生成物が
挙げられる。
【００５４】
好ましくは、大豆系生成物または L.カンペストリス系生成物を含有するクロストリジウ
ム・ボツリナム成長用培地は、実質上全ての動物由来生成物が植物由来生成物で代替され
る点以外は、動物由来生成物を含有する一般に使用される成長培地に似ている。例えば大
豆系発酵培地は、大豆系生成物、グルコースなどの炭素源、 NaClおよび KClなどの塩、 Na2
HPO4 、 KH2 PO4 などのホスフェート含有成分、鉄およびマグネシウムなどの二価カチオン、
30
鉄粉、ならびに L-システインおよび L-チロシンなどのアミノ酸を含むことができる。発酵
（第 2）培地に接種するためのクロストリジウム・ボツリナム培養物を成長させるために
用いられる培地（すなわち種培地または第 1培地）は、好ましくは、少なくとも、大豆系
生成物、 NaClなどの塩源、およびグルコースなどの炭素源を含有する。
【００５５】
本発明は、動物由来生成物を実質的に含まない培地を使ってボツリヌス毒素の生産量を
最大化するクロストリジウム・ボツリナムの成長方法を提供する。クロストリジウム・ボ
ツリナムおよびボツリヌス毒素の生産のための成長は、動物性副生成物に由来する成分を
代替する大豆副生成物を含有する培地での発酵によって行なうことができる。発酵培地用
の接種物は、それより小規模の成長培地（種培地）から得ることができる。培養物のバイ
40
オマスを増加させるために行なわれる種培地における継代数は、発酵工程の大きさおよび
体積に応じて変動しうる。発酵培地の接種に適した量のクロストリジウム・ボツリナムを
成長させるために、種培地における成長を伴う一工程または複数工程を行なうことができ
る。動物由来生成物を含まないクロストリジウム・ボツリナム成長法にとって、クロスト
リジウム・ボツリナムの成長は、非動物由来培地に保存された培養物から起こることが好
ましい。保存培養物（好ましくは凍結乾燥物）は、大豆由来のタンパク質を含有し動物性
副生成物を欠く培地における成長によって製造される。発酵培地におけるクロストリジウ
ム・ボツリナムの成長は、保存された凍結乾燥培養物からの直接的な接種によって行なう
ことができる。
【００５６】
50
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本発明の好ましい実施形態では、クロストリジウム・ボツリナムの成長が、種成長およ
び発酵という二相で進行する。これらの相はどちらも嫌気環境下で行なわれる。種成長相
は一般に、微生物の量を保存培養物から「スケールアップ」するために用いられる。種成
長相の目的は、発酵に利用できる微生物の量を増加させることである。また、種成長相に
より、保存培養物中の比較的不活発な微生物を、若返らせて活発に成長する培養物へと成
長させることもできる。さらに、活発に成長する培養物からは、保存培養物からの場合よ
りも、発酵培養物の接種に用いる生存可能な微生物の体積および量を正確に制御すること
もできる。したがって、発酵培地に接種するための種培養物を成長させることが好ましい
。また、発酵培地に接種するクロストリジウム・ボツリナムの量をスケールアップするた
めに、種培地における成長を伴う連続工程を何回でも使用することができる。発酵相にお
10
けるクロストリジウム・ボツリナムの成長は、直接接種によって保存培養物から直接進行
しうることに注意されたい。
【００５７】
発酵相では、種成長によって得られたクロストリジウム・ボツリナムを含有する種培地
の一部またはそのような種培地の全部を、発酵培地の接種に使用する。好ましくは、約2
から 4％の、種成長相で得られたクロストリジウム・ボツリナムを有する種培地を、発酵
培地の接種に使用する。発酵は、大規模嫌気環境下で最大量の微生物を生産するために用
いられる（ Ljungdahlら「 Manual of industrial microbiology and biotechnology」（ 19
86） , Demain ら編 , American Society for Microbiology, ワシントン D.C., 84頁）。
【００５８】
20
ボツリヌス毒素は、タンパク質精製技術分野の当業者に周知のタンパク質精製方法を使
って分離し精製することができる（ Coligan ら「 Current Protocols in Protein Science
」 Wiley & Sons、 Ozutsumi ら , Appl. Environ. Microbiol. 49 ; 939-943: 1985）。
【００５９】
ボツリヌス毒素を生産するために、クロストリジウム・ボツリナムの培養物を、発酵培
地に接種するための種培地中で成長させることができる。種培地における成長を伴う継代
工程数は、発酵相におけるボツリヌス毒素の生産規模に応じて変動しうる。ただし、上述
のように、発酵相での成長は、保存培養物からの接種により、直接進行することもできる
。クロストリジウム・ボツリナム成長用の動物系種培地は一般に BHI、 bacto-peptone、 Na
Cl、およびグルコースから構成される。上述のように、本発明に従って、動物系成分を非
30
動物系成分で置き換えた代替種培地を調製することもできる。例えば、限定するわけでは
ないが、クロストリジウム・ボツリナム成長用およびボツリヌス毒素生産用の種培地には
BHIおよび bacto-peptoneの代わりに大豆系生成物を使用することができる。好ましくは、
大豆系生成物は水溶性であり、加水分解大豆を含むが、クロストリジウム・ボツリナムの
培養物は、不溶性大豆を含有する培地中でも成長しうる。ただし、成長レベルおよびそれ
に続く毒素の生産レベルは、可溶性大豆生成物を用いた培地の方が高い。
【００６０】
本発明では任意の大豆系生成物源を使用することができる。好ましくは大豆は加水分解
大豆である。加水分解大豆源は様々な供給業者から入手することができる。例えば、 Hy-S
oy（ Quest International）、 Soy peptone（ Gibco）、 Bac-Soytone（ Difco）、 AMISOY（ Q
40
uest）、 NZ soy（ Quest）、 NZ soy BL4、 NZ soy BL7、 SE50M（ DMV International Nutrit
ionals、ニューヨーク州フレーザー）、および SE50MK（ DMV）などがあるが、これらに限
定されるわけではない。最も好ましくは、加水分解大豆源は Hy-Soyまたは SE50MKである。
他の使用可能性のある加水分解大豆源も知られている。
【００６１】
本発明の種培地における Hy-Soyの濃度は 25から 200g/Lの範囲である。好ましくは、種培
地中の Hy-Soy濃度は 50から 150g/Lの範囲である。最も好ましくは、種培地中の Hy-Soy濃度
は約 100g/Lである。また、 NaClの濃度は 0.1から 2.0g/Lの範囲である。好ましくは、 NaCl
濃度は 0.2から 1.0g/Lの範囲である。最も好ましくは種培地中の NaCl濃度は約 0.5g/Lであ
る。グルコースの濃度は 0.1g/Lから 5.0g/Lの範囲である。好ましくは、グルコース濃度は
50
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0.5から 2.0g/Lの範囲である。最も好ましくは、種培地中のグルコース濃度は約 1.0g/Lで
ある。種培地の他の成分と一緒にオートクレーブ処理することによってグルコースを滅菌
することも好ましいが、それは本発明にとって必須ではない。成長前の種培地の好ましい
pHレベルは 7.5から 8.5の範囲である。最も好ましくは、クロストリジウム・ボツリナムが
成長する前の種培地の pHは約 8.1である。
【００６２】
種培地におけるクロストリジウム・ボツリナムの成長は 1つ以上の段階で進行しうる。
好ましくは、種培地における成長は二段階で進行する。第 1段階では、クロストリジウム
・ボツリナムの培養物をある量の種培地に懸濁し、嫌気環境下に 34± 1℃ で 24から 48時間
インキュベートする。好ましくは、第 1段階での成長は約 48時間行なう。第 2段階では、ク
10
ロストリジウム・ボツリナムを含有する第 1段階培地の一部または全部を、さらなる成長
のために第 2段階種培地の接種に使用する。接種後、第 2段階培地を嫌気環境下に 34± 1℃
で約 1から 4日間インキュベートする。好ましくは、第 2段階種培地での成長は約 3日間行な
う。また、どの段階でも、種培地における成長は、種培地での最終成長物を発酵培地に接
種する前に細胞溶解を起こさないことが好ましい。
【００６３】
動物性副生成物を含有するクロストリジウム・ボツリナム成長用の標準的発酵培地は、
Muellerおよび Millerの配合（ MM； J. Bactgeriol. 67:271, 1954）に基づくことができる
。動物性副生成物を含有する MM培地中の成分として、 BHIおよび NZ-CaseTTが挙げられる。
NZ-CaseTTは、カゼイン（畜乳中に見いだされる一群のタンパク質）の酵素消化物に由来
20
する市販のペプチドおよびアミノ酸源である。本発明は、発酵培地中の BHIおよび NZ-Case
TTの代わりに非動物系生成物を使用することができることを実証する。例えば、限定する
わけではないが、クロストリジウム・ボツリナムの発酵に用いられる MM培地の動物系成分
を、大豆系生成物で代替することができる。好ましくは、大豆系生成物は水溶性であり、
加水分解大豆に由来するが、上述のように、不溶性大豆生成物を使って本発明を実施する
こともできる。
【００６４】
本発明では任意の大豆系生成物源を使用することができる。好ましくは、加水分解大豆
を Quest International（シェフィールド）から Hy-Soyという商標で入手するか、 DMV Int
ernational Nutritionals（ニューヨーク州フレーザー）から SE50MKという商標で入手す
30
る。可溶性大豆生成物は、例えば Soy peptone（ Gibco）、 Bac-Soytone（ Difco）、 AMISOY
（ Quest）、 NZ soy（ Quest）、 NZ soy BL4、 NZ soy BL7、および SE50MK（ DMV Internatio
nal Nutritionals、ニューヨーク州フレーザー）などといった（ただしこれらに限定され
るわけではない）様々な供給源から入手することもできる。
【００６５】
本発明のもう 1つの好ましい実施形態では、クロストリジウム・ボツリナムの発酵に用
いられる培地が、動物性副生成物を含まず、加水分解大豆、グルコース、 NaCl、 Na2 HPO4
、 MgSO4 7H2 O、 KH2 PO4 、 L-システイン、 L-チロシン、および鉄粉を含む。種培地に関して
開示したように、発酵培地中の動物性副生成物は加水分解大豆で代替することができる。
これらの動物性副生成物として、 BHIおよび NZ-CaseTT（酵素消化カゼイン）が挙げられる
40
。
【００６６】
ボツリヌス毒素を生産するための発酵培地における Hy-Soyの濃度は、好ましくは約 10か
ら 100g/Lの範囲である。好ましくは、 Hy-Soy濃度は約 20から 60g/Lの範囲である。最も好
ましくは、発酵培地中の Hy-Soy濃度は約 35g/Lである。ボツリヌス毒素の生産量を最大に
するには、発酵培地中の成分の特に好ましい濃度は、約 7.5g/L グルコース、 5.0g/L NaCl
、 0.5g/L Na2 HPO4 、 175mg/L KH2 PO4 、 50mg/L MgSO4 7H2 O、 125mg/L L-システイン、および
125mg/L L-チロシンである。鉄粉の使用量は 50mg/Lから 2000mg/Lの範囲であることができ
る。好ましくは、鉄粉の量は約 100mg/Lから 1000mg/Lの範囲である。最も好ましくは、発
酵培地中に用いる鉄粉の量は約 200mg/Lから 600mg/Lの範囲である。
50
(16)
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【００６７】
毒素生産レベルを最適にするために、大豆系発酵培地の初期 pH（オートクレーブ処理）
は好ましくは約 5.5から 7.1の範囲である。好ましくは、発酵培地の初期 pHは約 6.0から 6.2
である。種培地に関して述べたように、グルコースおよび鉄を包含する発酵培地の成分は
、好ましくは、滅菌のために一緒にオートクレーブ処理される。
【００６８】
好ましくは、クロストリジウム・ボツリナムの成長に使用した第 2段階種培地の一部を
、発酵培地の接種に使用する。発酵は嫌気チャンバー中、約 34± 1℃ で約 7から 9日間行な
われる。成長は培地の光学密度（ O.D.）を測定することによって監視される。発酵は、好
ましくは、成長測定（光学密度）による決定で、細胞溶解が少なくとも 48時間進行した後
10
に、停止する。細胞が溶解するにつれて、培地の O.D.は低下するだろう。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態では、クロストリジウム・ボツリナムの長期保存および種培
地の接種に用いられるクロストリジウム・ボツリナムの培養物を、豆乳中で成長させて、
凍結乾燥した後、 4℃ で保存する。保存用に凍結乾燥された畜乳中のクロストリジウム・
ボツリナム培養物も、ボツリヌス毒素の生産に使用することができる。しかし、ボツリヌ
ス毒素生産の全工程にわたって、動物性副生成物を実質的に含まない培地を維持するため
に、クロストリジウム・ボツリナムの初期培養物は、畜乳ではなく豆乳中に保存されるこ
とが好ましい。
【００７０】
20
実施例
以下の実施例は、本発明に包含される特定の方法を説明するものであり、本発明の範囲
を限定しようとするものではない。クロストリジウム・ボツリナム培養物は、 List Labor
atories（カリフォルニア州キャンベル）を含むいくつかの供給源から入手することがで
きる。全ての実験および培地は再蒸留水を使って調製することができる。以下の全ての実
施例において「クロストリジウム・ボツリナム」とは、 A型クロストリジウム・ボツリナ
ムの Hall A（ ATCC 登録番号 3502）株を意味する。
【実施例１】
【００７１】
動物性生成物を含まないクロストリジウム・ボツリナム用種培地の調製
30
対照種培地は培地各 1リットルにつき以下の成分を使って調製することができる： NaCl
（ 5g）、 Bacto-peptone（ 10g）、グルコース（ 10g）、 BHI（ 1リットルになる量）、 pH8.1
（ 5N NaOHで調整）。
【００７２】
試験（動物性生成物不含有）種培地は培地各 1リットルにつき以下の成分を使って調製
することができる： NaCl（ 5g）、 Soy-peptone（ 10g）、グルコース（ 10g）、 Hy-Soy（ 35g
/リットル、培地液を 1リットルにする量）、 pH8.1（ 5N NaOHで調整）。
【実施例２】
【００７３】
動物性生成物を含まない種培地におけるクロストリジウム・ボツリナムの培養
40
実施例 1の対照種培地および試験種培地各 1mlにクロストリジウム・ボツリナムの凍結乾
燥培養物を懸濁し、（各種培地を）それぞれがそれぞれの種培地 10mlを含有する 2本の試
験管に分割した後、 34℃ で約 24から 48時間インキュベートすることができる。次に、培養
物 1mlを、 40mlの（各）種培地を含有する 125ml DeLong Bellco培養フラスコの接種に使用
することができる。接種された培養物を、 Coy嫌気チャンバー（ Coy Laboratory Products
Inc.、ミシガン州グラスレイク）中、 33℃ ± 1℃ で 24時間インキュベートすることができ
る。
【実施例３】
【００７４】
動物性生成物を含まないクロストリジウム・ボツリナム用発酵培地の調製
50
(17)
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基礎発酵培地は培地各 2リットルにつき以下の成分を使って調製することができる：グ
ルコース（ 15g）、 NaCl（ 10g）、 NaH2 PO4 （ 1g）、 KH2 PO4 （ 0.350g）、 MgSO4 7H2 O（ 0.1g）
、システイン -HC（ 0.250g）、チロシン -HCl（ 0.250g）、鉄粉（ 1g）、 ZnCl2 （ 0.250g）、
および MnCl2 （ 0.4g）。
【００７５】
対照発酵培地は、調製される培地各 2リットルにつき以下の成分を使って調製すること
ができる： BHI（ 500ml；これは牛心臓浸出液乾燥重量約 45.5gに相当する）、 NZ-CaseTT（
30g）、および基礎培地（ 2リットルになる量）、 pH6.8。
【００７６】
基礎発酵培地をまず調製し、それを pH6.8に調整することができる。次に、牛心臓浸出
10
液（ BHI） BHIを調製し、 5N NaOHでその pHを 8に調整することができる。次に、 BHIを基礎
培地に加えることができる。次に NZ-CaseTTを調製することができる。次に、牛心臓浸出
液が既に加えられている基礎培地に、 NZ-CaseTTを加え、 HClの添加によって溶解させる。
次に 5N NaOHで pHを 6.8に調整することができる。次に、この培地を 16本の 100mm試験管に 8
mlずつ分注した後、 120℃ で 25分間オートクレーブ処理することができる。
【００７７】
試験発酵培地（動物性生成物不含有）は、対照発酵培地中に存在する BHIの代わりに試
験窒素源を使用することによって調製することができる。好適な試験発酵培地窒素源には
、 Hy-Soy（ Quest）、 AMI-Soy（ Quest）、 NZ-Soy（ Quest）、 NZ-Soy BL4（ Quest）、 NZ-So
y BL7（ Quest）、 Sheftone D（ Sheffield）、 SE50M（ DMV）、 SE50（ DMV）、 SE%)MK（ DMV
20
）、 Soy Peptone（ Gibco）、 Bacto-Soyton（ Difco）、 Nutrisoy 2207（ ADM）、 Bakes Nut
risoy（ ADM）、 Nutrisoy flour、 Soybean meal、 Bacto-Yeast Extract（ Difco）、 Yeast
Extract（ Gibco）、 Hy-Yest 412（ Quest）、 Hy-Yest 441（ Quest）、 Hy-Yest 444（ Quest
）、 Hy-Yest 455（ Quest）、 Bacto-Malt Extract（ Difco）、 Corn Steep、および Proflo
（ Traders）などがある。
【００７８】
試験発酵培地は、 BHIを除外する点以外は、対照発酵培地について上述したように調製
することができ、適切な窒素源をまず 3N HClまたは 5N NaOHで pH6.8に調整することができ
る。培地は 16本の 100mm試験管に 8mlずつ配分した後、 120℃ で 20から 30分間オートクレー
ブ処理することができる。
30
【実施例４】
【００７９】
動物性生成物を含まない発酵培地におけるクロストリジウム・ボツリナムの成長
試験種培地培養物（動物性生成物不含有）を 40μ lずつ使って、 8ml 16本の 100mm試験管
中の対照または試験発酵培地各 8mlに接種することができる。次に、培養物を 33± 1℃ で 24
時間インキュベートすることができる。次に、細菌を成長させるために、試験管を嫌気チ
ャンバー中でインキュベートすることができる。各培地アッセイは三重に行なうことがで
き（すなわち同じ培地に独立して 3回の接種を行なうことができる）。非接種対照を（分
光光度計用のブランクとして使用することができる）を含めることもできる。成長（光学
密度 OD によって測定される）は、 Turner分光光度計（ 330型）を使って 660nmで 24時間ご
40
とに測定することができる。細胞溶解が約 48時間続いた後に培養は停止すべきであり、そ
の後、ボツリヌス毒素生産量を測定することができる。
【００８０】
培地各 500mlにつき以下の成分を含有する Hy-Soy発酵培地を使って、追加実験を行なう
ことができる： Hy-Soy（ 17.5g）、グルコース（ 3.75g）、 NaCl（ 2.5g）、 Na2 HPO4 （ 0.25g
）、 MgSO4 7H2 O（ 0.025g）、 KH2 PO4 （ 0.0875g）、 L-システイン（ 0.0625g）、 L-チロシン
（ 0.0625g）、鉄粉（ 0.25g）、 pH6.8。
【実施例５】
【００８１】
動物性生成物を含まない発酵培地におけるクロストリジウム・ボツリナム成長によるボツ
50
(18)
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リヌス毒素生産量の決定
実施例 4の培養細胞を遠心分離した後、上清の pHを測定することができる。与えられた
試料中のボツリヌス毒素のレベルは、標準抗毒素を添加し、フロキュレーションまでの経
過時間を測定することによって、測定することができる。 Kf（フロキュレーションが起こ
るのに要する時間、単位：分）および Lf（フロキュレーション限界、フロキュレーション
によって確立される 1国際単位の標準抗毒素に相当）をどちらも測定することができる。
与えられた培養物について発酵ブロス 4mlを各発酵管から採取し、合計 12mlを 15ml遠心管
中で混合することができるように、それらを合わせることができる。遠心管を 4℃ 、 5000r
pm（ 3400g）で 30分間遠心分離することができる。上清を 1mlずつ、 0.1から 0.6mlの標準ボ
ツリヌス毒素抗血清を含有する試験管に加え、内容物を混合するために試験管を注意深く
10
振とうすることができる。次に試験管を 45± 1℃ の水槽に入れ、開始時刻を記録すること
ができる。試験管を頻繁に調べて、フロキュレーションが始まった時間を Kfとして記録す
ることができる。フロキュレーションを 1番目に開始することができる試験管内の毒素濃
度を LfFFと指名することができる。 2番目にフロキュレーションを開始することができる
試験管中の毒素濃度を LfFと指定することができる。
【００８２】
並行発酵、成長および毒素生産量アッセイは、（ a）対照種培地（対照発酵培地の接種
に使用）および対照発酵培地ならびに（ 2）（動物性生成物不含有）試験種培地（試験発
酵培地の接種に使用）および（動物性生成物不含有）試験発酵培地の両方について行なう
ことができる。重要なことに、動物性生成物を含まない培養物から接種された動物性生成
20
物を含まない培地におけるクロストリジウム・ボツリナムの発酵（大豆系生成物で動物性
生成物を代替したもの）は、約 50以上の Lft o x i n をもたらすことができると決定すること
ができる。最小として、 Lft o x i n は約 10である。好ましくは Lft o x i n は 20以上である。最も
好ましくは Lft o x i n は 50より大きい。
【００８３】
また、様々な大豆生成物が BHIを欠く発酵培地におけるクロストリジウム・ボツリナム
の成長を支えることを決定することができる。すなわち、クロストリジウム・ボツリナム
の成長に、 BHIを可溶性大豆調製物で代替することができる。最適濃度は 12.5または 25g/L
である。 Hy-Soy（ Scheffield）は最高の成長をもたらすことができる。不溶性大豆調製物
はそれより有効性が低い場合がある。
30
【００８４】
さらに、 Quest Hy-Soy、 DMV SE50MK、および Quest NZ-Soyが、クロストリジウム・ボツ
リナムの成長に関して BHIに代替しうる点で、有効な大豆生成物でありうることを示す結
果を得ることもできる。これらの結果は、成長に最適でありうる大豆生成物（例えば Ques
t Hy-Soy、 DMV SE50MK、および Quest NZ-Soy）は、毒素生産に関して BHIに代替するのに
も有効であることができることを明らかにする。毒素生産にとって最適な大豆生成物は 22
.75g/lの Quest Hy-Soyである。この生成物をさらに高濃度で使用した場合、成長はよくな
っても毒素生産量は改善されないということがありうる。同様の結果は SE50MKでも得るこ
とができると考えられ、その濃度を上げると成長は増加しても毒素生産量は増加しないと
いうことがありうる。これに対して NZ-Soyは、濃度を上げると成長および毒素生産量が向
40
上しうる。
【００８５】
最後に、大豆生成物が BHIおよび NZ-CaseTTに効果的に代替できることを決定することが
できる。大豆系培地から NZ-CaseTTを除去すると、成長が約 2分の 1から 4分の 1に抑制され
うる。 NZ-CaseTTの存在下でも不在下でも成長にとって最適な大豆生成物は SE50MKであり
うる。毒素生産に関して、 HY-Soyは BHIおよび NZ-caseTTのどちらにも代替することができ
る。ただし 1日または 2日という長い発酵周期が必要になりうる。 HY-Soyは毒素生産用培地
中の BHIおよび NZ-CaseTTをどちらにも代替しうる。しかし酵母抽出物は毒素生産にとって
阻害的でありうることを決定することができる。
【００８６】
50
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毒素生産に関して、 HY-Soyは 22.75g/lで BHIおよび HY-CaseTTのどちらにも完全に代替し
うることを決定することができる。成長に対する作用（この場合は 56.88g/lの HY-Soyが最
適でありうる）とは異なり、毒素生産相には 34.13g/lの HY-Soyが最適であることができる
。
【００８７】
このように本発明者は、驚くべきことに、 Hy-Soyまたは［ Hy-Soy＋ Hy-Yest］がクロス
トリジウム・ボツリナム種成長用培地中の BHIおよび Bacto-peptoneに代替できるかどうか
を決定した。また、クロストリジウム・ボツリナムによるボツリヌス毒素生産レベルを最
大にするべく、種培地の成分の最適濃度を決定するための実験を計画することができる。
BHIおよび NZ-CaseTTを含まない種培地および発酵培地で成長させたクロストリジウム・ボ
10
ツリナムによる毒素生産量は、 BHIおよび NZ-CaseTTを含有する培地で達成されるレベルに
達するか、それを越えることができる。
【００８８】
種培地中の成長のための Hy-Soyまたは［ Hy-Soy＋ Hy-Yest］の最適濃度を決定すること
ができる。クロストリジウム・ボツリナムの成長およびその後の発酵相におけるボツリヌ
ス毒素の生産に関して、種培地中の窒素源として、 Hy-Soyが BHIおよび Bacto-peptoneに代
替できることは、実験で確認することができる。また、種培地中の窒素源としての Hy-Soy
は、 Hy-Soy＋ Hy-Yestと比較して、後の発酵工程で高レベルのボツリヌス毒素生産をもた
らすことができる。最適な毒素レベルをもたらす種培地中の Hy-Soyの濃度は、約 62.5g/L
から 100g/Lの範囲である。
20
【００８９】
追加実験が、発酵によるクロストリジウム・ボツリナムのボツリヌス毒素生産量を最大
にするための種培地中の最適 Hy-Soy濃度を決定するために計画される。例えば、種培地中
の Hy-Soy 30g、 50g、 75gおよび 100gは、いずれも、クロストリジウム・ボツリナムの発酵
によるボツリヌス毒素の生産をもたらすことができ、それは BHIおよび Bacto-peptoneを窒
素源として含有する種培地で作られるボツリヌス毒素のレベルと同等またはそれ以上であ
る。
【００９０】
種培地中の濃度 100g/Lの Hy-Soyは、後の発酵工程において、最も高い毒素生産レベルを
もたらしたことがわかる。また、 Hy-Soy種培地の種工程 1は、 24時間後よりも 48時間後の
方が大きい成長をもたらしたことを、データは示している。
【００９１】
本明細書では様々な刊行物、特許および／または参考文献に言及したが、その内容は参
照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
本発明を特定の好ましい方法に関して詳細に説明したが、本発明の範囲内で他の実施形
態、変形、および変更形態も可能である。例えば、動物性生成物を含まない多種多様な方
法が本発明の範囲に包含される。
したがって特許請求の範囲の要旨および範囲は、上述した好ましい実施形態の説明に限
定されるべきではない。
30
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【国際調査報告】
JP 2007-506427 A 2007.3.22
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JP 2007-506427 A 2007.3.22
(22)
JP 2007-506427 A 2007.3.22
(23)
JP 2007-506427 A 2007.3.22
フロントページの続き
(51)Int.Cl.
ＦＩ
Ａ６１Ｐ 1/10
Ａ６１Ｐ 25/08
Ａ６１Ｐ 27/02
(2006.01)
(2006.01)
Ａ６１Ｐ
(2006.01)
テーマコード（参考）
1/10
Ａ６１Ｐ 25/08
Ａ６１Ｐ 27/02
(81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),
EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IT,LU,MC,NL,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,
CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,
DE,DK,DM,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,M
A,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NA,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG
,US,UZ,VC,VN,YU,ZA,ZM,ZW
(72)発明者スティーブン・ドノバン
アメリカ合衆国９２６２４カリフォルニア州カピストラーノ・ビーチ、カリェ・アネホ２７２５２
番
Ｆターム(参考) 4B050 CC01 DD02 EE02 LL01
4C084 AA06 BA44 CA04 DA33 NA07 ZA022 ZA232 ZA332 ZA722 ZA942
4H045 AA20 AA30 BA72 CA11 DA83 DA89 EA20 FA73

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