（別紙様式第３号）学位論文要旨氏名:林昌平題目: 河川生物膜における微生物の生態に関する研究－農薬の影響評価のためのモデル生物膜の構築と固体培地上での微生物間共生の機構解明－ (Microbial ecological study on river biofilm -Construction of river model biofilm for assessing pesticide effects and elucidation of mechanisms of inter-microbial symbiosis on solid media-) 環境中で藻類、細菌、菌類、原生生物などの微生物は他の生物と相互作用しながら生存しており、その生息場所の一例として河川生物膜が挙げられる。この河川生物膜は生産者、分解者、消費者としての藻類、細菌、原生生物などの多様な微生物から構成され、それらが複雑に相互作用している群集で、河川生態系で重要な役割を担っている。また、河川生物膜は河川で流入する農薬に最初に暴露される生物集団であり、その農薬の影響が水域生態系全体に広がる可能性がある。そのため、農薬の河川生物膜への影響を群集レベルで評価することは重要であると考えられるが、河川または実験的な水路に沈設された人工基質上に形成した自然河川生物膜を用いて農薬の影響を評価することは、生物膜形成における再現性が低く、同じ河川生物膜を再現性よく得られないために、困難であることが予想される。そこで本研究では、生物膜形成における農薬の影響を群集レベルで評価するために、一定の培養条件下でガラス基質上に、既知の微生物から構成されるモデル生物膜を構築した。微生物種を変えてモデル生物膜を形成させ、生物膜の細胞数、活性、群集構造を調査した結果、細菌3株（Pedobacter sp. 7-11、Aquaspirillum sp. T-5、Stenotrophomonas sp. 3-7）と珪藻2株（Achnanthes minutissima N71と、Cyclotella meneghiniana N803またはNitzschia palea N489）の組み合わせにおいて、モデル生物膜の各生物学的指標はばらつきが小さく、各指標の値が安定的に増加して、生物膜が形成した。また、細菌が存在しないと珪藻は付着せず、珪藻が存在しないと細菌は増殖しないことから、このモデル生物膜は珪藻と細菌の間の相互作用によって形成したと推定された。本モデル生物膜において、珪藻は細菌に光合成産物を供給し、細菌は珪藻に生物膜の形成に必要な付着環境を提供したと予想された。その後、本モデル生物膜を用いてアトラジンの毒性試験を行い、各生物学的指標が河川生物膜への農薬の影響評価を行うためのエンドポイントとして利用できるかを検討し、モデル生物膜の有用性を評価した。その結果、アトラジン濃度の対数値と生物膜形成過程における珪藻数、細菌数およびクロロフィルa量の増加率に対する阻害割合との間に良好な負の相関関係が認められ、エステラーゼ活性を含めたそれらの測定項目でエンドポイントとして同様なEC50 値が暫定的に得られた。また、本モデル生物膜が微生物を単独で用いた毒性試験では検出できない間接的な影響を検出できることが実証された。以上の結果から、本モデル生物膜が河川生物膜への農薬の影響を群集レベルで評価するために利用できる可能性があることが示された。しかし、さらにモデル生物膜の有用性を評価するために、他の農薬や実験条件を用いて調査する必要がある。また、河川生物膜の中で起こっている微生物間の相互作用は、その生態学的な役割や農薬の影響に関与していると考えられる。従って、河川生物膜の役割や農薬の影響を調べる際にはその相互作用を理解する必要があるが、河川生物膜は多様な微生物から構成され複雑な相互作用があると予想されることから、河川生物膜を用いて相互作用を調査することは困難であると考えられる。本研究のモデル生物膜についての研究過程で、純粋培養したシアノバクテリア Synechococcus leopoliensis CCAP1405/1 が寒天培地上で増殖できないが、別の従属栄養細菌が共存すると増殖できることを発見した。S. leopoliensis CCAP1405/1 は、従属栄養細菌と寒天培地上で共存して相互作用することによって増殖できるようになったとが予想され、この相互作用を解明することは河川生物膜などの自然環境で起こっている相互作用を理解する手掛かりになるのではないかと考えた。そこで本研究では、従属栄養細菌が寒天培地上のシアノバクテリア S. leopoliensis CCAP1405/1 を増殖させる機構を解明するための調査を行った。その結果、分類学的に様々な系統の従属栄養細菌が S. leopoliensis CCAP1405/1 を増殖させる能力を持っていたが、その能力は培地組成やゲル化剤の種類によって影響を受けることがわかった。さらに、S. leopoliensis CCAP1405/1 を高密度で接種したり、ビタミン類、チオ硫酸を添加したりすることで S. leopoliensis CCAP1405/1 が増殖したが、カタラーゼは効果を示さなかった。無機培地上では従属栄養細菌は S. leopoliensis CCAP1405/1 からの光合成産物を利用し、S. leopoliensis CCAP1405/1 の寒天培地上での増殖を支持したと考えられる。Bacillus subtilis 168 の遺伝子欠損株ライブラリーから、S. leopoliensis CCAP1405/1 を増殖させる能力を失った増殖能欠失株が同定されたが、破壊された遺伝子間の関連性がなかったことから、この寒天培地上での相互作用は複雑で様々な因子が関与していると考えられた。システインの添加が亜硫酸還元酵素欠損株の S. leopoliensis CCAP1405/1 を復帰させたが、システインの添加は S. leopoliensis CCAP1405/1 の寒天培地上での増殖に効果がなかったことから、B. subtilis 168 のシステイン生合成経路の同化型硫酸還元反応でシステインが S. leopoliensis CCAP1405/1 の増殖に関与していることが推察された。しかし、今回の調査からは具体的な機構は分からなかった。シアノバクテリアと従属栄養細菌の間のこの様な相互関係は、それらの微生物が単独では生存できないような自然環境下で作用していると予想される。本研究では河川生物膜に及ぼす農薬の影響評価のためのモデル生物膜の構築および河川生物膜に生息するシアノバクテリアを寒天培地上で増殖させる従属栄養細菌の機構解明を通して微生物間の相互作用について研究した結果、モデル生物膜は珪藻と細菌の相互作用によって形成されたこと、無機寒天培地上でシアノバクテリアと従属栄養細菌の相互作用が両者の増殖に必要であることがわかった。本研究で得られた知見は河川生物膜における微生物間の相互作用を解明するための手掛かりになるであろう。