操作手順 CONTENTS I. 前増菌培養 II. サンプルからの遺伝子抽出 III. 試薬の調製 IV. 試薬分注・サンプル溶液の添加 V. LAMP反応および検出 VI. 結果判定 VII. 検査フローチャート VIII. アッセイシート Loopamp®L.monocytogenes検出試薬キット LAMP法を用いたL.monocytogenes検出検査の準備と手順 2006年8月 第一版 12 はじめに はじめに はじめに 前増菌培養 試薬調製 サンプル添加 前増菌培養 抽出操作 試薬調製 サンプル添加 サンプル添加 前増菌培養 抽出操作 抽出操作 試薬調製 I. 操作手順 LAMP LAMP 反応 検出 LAMP反応 反応 検出 検出 資料 資料 資料 ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ 結果判定 結果判定 結果判定 前増菌培養 Ⅱ. サンプルからの遺伝子抽出 ❏前増菌培養 （図9）【領域B】 【領域B にて操作します】 ① 検体の食品を25gあるいは25mL採取します。試料が固 体の場合は滅菌したハサミ、ナイフ等で小片に刻みま す。 ② フィルター付きストマッカー用バッグに採取した食品お よび、増菌用培地としてHalf- Fraser培地、UVM培地、 EB培地等225mLを入れ、ストマッカー処理を行い均一 化します。 ③ バッグの開口部をクリップなどで留め、ふ卵器に入れて 30℃、24時間増菌培養します。 25g秤量した検体（食品）をフィ ルター付きストマッカー用バッ グに入れ、Half Fraser培地、 UVM培地、EB培地等225mL を加える。 ① ② ② ストマッカーで検体と増菌培地 を均一化する。 ③ ストマッカー処理をした試料を 30℃、24時間増菌培養します。 ❏サンプルからの遺伝子抽出 コンタミネーションの原因となるので、チューブのフタの 内側には触れないでください。 【領域B にて操作します】 ④ 増菌後の培養液50μLをそれぞれ別に用意した滅菌 チューブ（1.5mL）に採取します。 ▩ 予め、増菌培養液をストマッカー用バッグから、適量 を滅菌マイクロチューブにメスピペットを用いて分注 しておくと、操作が容易になります。 ⑤ 微量遠心機にて2,000×g、5分間遠心分離を行います。 ⑥ 沈殿物を吸引しないように可能な限り上清をピペットで 除去します。沈殿物がない場合には上清を約40μL除 去します。 ⑦ Extraction Solution for Foods (EX F) 80μLを添加しま す。 ▩ EX Fは融解後、混合し、微量簡易遠心機で数秒間 遠心（スピンダウン）してから使用してください。 EX Fは空気に触れると徐々に劣化するので、速やかに 分注してください。 ④ ボルテックスミキサーで攪拌後、微量簡易遠心機でスピ ンダウンします。 ⑤ 95℃、5分間の加熱処理を行います。 ▩ この操作により感染性がなくなります。 95℃加熱中に、空気の膨張によりチューブのフタが開 いてしまうことがありますのでご注意ください（キャップロッ クなどの使用をお勧めします）。 ⑩ 直ちに氷上で冷却しスピンダウンします。 ⑪ 1M Tris-HCｌ （pH7.0）（Tris）10μLを添加し、ボルテッ クスミキサーで攪拌します。 ⑫ 微量簡易遠心機で室温にて2,000×g、30秒間遠心し ます。 ⑬ 氷上に移し、上清をサンプル溶液とします。 DNA抽出後のサンプル溶液は、反応チューブに添加 するまで氷上で保存し、速やかに測定してください。 Loopamp®L.monocytogenes検出試薬キット LAMP法を用いたL.monocytogenes検出検査の準備と手順 2006年8月 第一版 13 LAMP法 LAMP法 残り 50μL 分離培養 ④ ⑤ ⑥ ⑧ ⑨ ⑩ ⑫ ⑬ 図9．検査の流れ LAMP法と培養法との比較 はじめに はじめに はじめに 前増菌培養 試薬調製 サンプル添加 前増菌培養 抽出操作 試薬調製 サンプル添加 サンプル添加 前増菌培養 抽出操作 抽出操作 試薬調製 操作手順 LAMP LAMP 反応 検出 LAMP反応 反応 検出 検出 結果判定 結果判定 結果判定 資料 資料 資料 ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ III. 試薬の調製 Ⅳ. 試薬分注・サンプル溶液の添加 ❏ 試薬の調製 操作は氷上でおこなってください。 マスターミックスは検査毎に調製し、作り置きはしないでください。 調製後のキット試薬は、速やかに凍結保存してください。 必要量を採取した残りの試薬は速やかに凍結保存してください。 【操作は領域Aで行います。 】 ① -20℃で保存していた酵素以外のキット試薬を室温で解凍し、使用するま で氷上で保存します。 Bst Polymeraseは、そのまま氷上で保存します。 ② 解凍したReaction Mix. Lis (RM Lis)をタッピングにて混合しスピンダウンを 行います。Bst Polymeraseは、スピンダウンのみ行います。 Bst Polymeraseは、必要量を採取した残りの試薬は速やかに凍結保存して ください。 ③ 別途用意した1.5mL滅菌チューブに、各試薬を分注します。 ▩ 各試薬1テストあたりReaction Mix Lis(RM Lis) 20μL、Bst DNA Polymerase 1μLを、陽性･陰性コントロールを含めた必要なテスト数分 分注します。 実際のサンプル数＋α分のマスターミックスを調製することにより、滞りな く分注することができます（例：20サンプル実施の場合、21サンプル分の マスターミックスを調製）。 ④ 転倒混和あるいはボルテックスミキサー（1秒間×3回）により十分混合した 後、スピンダウンし、マスターミックスとします。なお調製したマスターミックス はすぐに使用してください。 マスターミックスをボルテックスミキサーで混合する場合は、1秒間×3回を 厳守してください（過度な混合は酵素失活の恐れがあります）。 マスターミックスの調製分量 テスト数 1test ＿＿tests Reaction Mix. 20μL 20μL× ＿＿ ＝＿＿μL Lis Bst DNA Polymerase Total 1μL 1μL × ＿＿ ＝ ＿＿μL 21μL 21μL× ＿＿ ＝ ＿＿μL ② ❏ 試薬分注・サンプル溶液の添加（図10） 操作は氷上でおこなってください。 反応前にチューブにヒビ・キズ等がないことを予め確認してください。 【操作は領域Aで行います。】 ① キット添付のPositive Control （PC Lis）と、陰性コントロールとして Extraction Solution for Foods （EX F）を予め準備しておきます。 陰性コントロールとして使用するEX Fは、試薬開封の際に100μL程度マ イクロチューブに分取し、陰性コントロール専用として領域Cにて使用、 保存します。 ② 試薬調製用のクリーンベンチ内でLoopampⓇ反応チューブにそれぞれマス ターミックスを20μLずつ分注し、すべてのキャップを閉じます。 【操作は領域Cで行います。 】 ③ マスターミックス20μLが分注されている反応チューブにサンプルを5μLず つ添加し、ピペッティングで十分に混和します。 ▩ Cont Lisは大量のDNAを含むため、取り扱いには十分注意してください （使用前にはスピンダウンを行ってください。反応チューブへの添加は最 後に行ってください）。 ▩ サンプルの添加は、コンタミネーションを避けるため、陰性コントロール （EX F）、サンプル溶液、陽性コントロール（Cont Lis）の順で行うことをお 勧めします。 ▩ サンプル溶液を添加する際は、沈渣を持ち込まないよう、上清を採取し てください。 ▩ ピペットの汚染を防ぐため、吸引操作はゆっくりおこなってください。 ▩ コンタミネーションを避けるため、サンプル添加後はしっかりとキャップを 閉めてから、次のサンプルを添加してください。 ④ キャップを閉め、スピンダウンします。 ⑤ スピンダウン終了後にはチューブ内に気泡がないことを確認してください。 ▩ 反応液中に大きな気泡ができた場合は、スピンダウンで取り除いてくださ い（小さな気泡であれば問題ありません）。マスターミックスが温まると気 泡が出やすくなるため、氷上の操作をお勧めします。 Loopamp®L.monocytogenes検出試薬キット LAMP法を用いたL.monocytogenes検出検査の準備と手順 2006年8月 第一版 14 ⑤ 図10．試薬分注 およびサンプル溶液の添加 はじめに はじめに はじめに 前増菌培養 試薬調製 サンプル添加 前増菌培養 抽出操作 試薬調製 サンプル添加 サンプル添加 前増菌培養 抽出操作 抽出操作 試薬調製 操作手順 LAMP 反応 LAMP 反応 検出 LAMP反応 検出 LAMP LAMP反応 検出 反応 検出 検出 結果判定 結果判定 結果判定 資料 資料 資料 ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ V. LAMP反応および検出 ❏LAMP反応および検出【領域D】 ◆LAMP反応および検出はリアルタイム濁度測定装置にて おこないます。LAMP反応条件は65℃60分間、その後反 応停止条件として80℃、2分間とします。 ① 使用する20分前までに電源を入れ装置を立ち上げて ください。 ② 反応前にチューブにヒビ・キズ等がないことを確認して ください。 ③ チューブを検出部に入れる際は、チューブ内に気泡 がないことを確認してください（気泡があると、誤った 判定の原因となります）。 ◆LA-320C（図11） ① 本体がパソコンに接続されていることを確認し電源を 投入してください。 ② パソコンを起動し「LA-320C制御ソフト」を起動してく ださい。 ③ 測定条件を設定します（各試薬のパラメーター表を参 照してください。パラメーター表は弊社担当者に御要 請ください。）。 ④ 予備加熱終了後、サンプルを測定部にセットし、ホット ボンネットを閉めてください。 ◇ 反応チューブの確認（ヒビ･キズ、気泡等）を確実 におこなってください。 ⑤ [測定開始]を確実にクリックし測定を開始します。 ◇ [測定開始]をクリックしないとデータが保存されず、 判定ができなくなってしまいます。 ⑥ 32チューブそれぞれの濁度を測定し、モニターに増 幅曲線、判定補助画面を表示します。 詳しくは、添付の取扱説明書をご覧ください。 図11. LA－３２０C本体（上）とサンプル測定部（下） ◆RT-160C（図12） ① 本体の電源を投入してください。 ② 測定条件を設定します（各試薬のパラメーター表を参 照してください。パラメーター表は弊社担当者に御要 請ください。）。 ③ 予備加熱終了後 、サンプルを測定部にセットし、ホッ トボンネットを閉めてください。 ◇ 反応チューブの確認（ヒビ･キズ、気泡等）を確実 におこなってください。 ④ [Start/Heat]ボタンを押し、測定を開始します。 ⑤ 16チューブそれぞれの濁度を測定し、モニターに増 幅曲線、判定補助画面を表示します。 詳しくは、添付の取扱説明書をご覧ください。 反応開始後は、測定機器のフタ（ホットボンネット）を開け ないでください。 反応後のチューブを検出部から取り出す際はチューブを 破損しないように慎重に取り扱ってください。また反応 チューブのキャップは、決して開けないでください。増幅 産物によるコンタミネーションは誤判定の原因になるだけ ではなく、試験環境を汚染し、汚染を除去しない限り、以 後の試験で正しい結果が得られなくなる可能性がありま す。 Loopamp®L.monocytogenes検出試薬キット LAMP法を用いたL.monocytogenes検出検査の準備と手順 2006年8月 第一版 15 図12. RT－１６０C本体（上）とサンプル測定部（下） はじめに はじめに はじめに 前増菌培養 試薬調製 サンプル添加 前増菌培養 抽出操作 試薬調製 サンプル添加 サンプル添加 前増菌培養 抽出操作 抽出操作 試薬調製 操作手順 LAMP LAMP 反応 検出 LAMP反応 反応 検出 検出 資料 資料 資料 ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ 結果判定 結果判定 結果判定 VI. 結果判定 ❏結果判定【領域D】 陽性コントロール ◆ 判定の前に（図13） 判定の際には以下の点を確認した上で実施してください。 ▩ 陽性コントロール、陰性コントロールの反応が適切 に進行している。 ◇ 正常な反応が行われている場合、陽性コントロー ル、陰性コントロールおよび検体の増幅曲線は 図13のようなパターンを示します。 ◇ 陽性コントロールで濁度が上昇し、陰性コントロー ルで濁度が上昇していなければ、LAMP反応は 正常に進行しています。 ▩ 増幅モードの増幅曲線による濁度上昇の有無。 陽性検体1 陰性コントロール 0.7 0.7 0.6 0.6 濁 0.4 0.4 度 0.3 度 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1 0 0 0 10 20 30 40 50 60 ▩ 反応の増幅曲線を示します（縦軸：Abs、横軸：時間） ② 判定モード ② ▩ 測定値を移動平均微分法で演算した結果をグラフ で示します（縦軸：微分値、横軸：時間）。 ③ 結果モード ▩ 測定結果を棒グラフで表示し、判定カードの色で判 定結果の確認ができます。 ▩ 陽性－赤、陰性－緑、測定中－黄 （青－増幅分） ③ 図 14. 機器判定画面 （LA-320C） ② 微分グラフ表示 ① ▩ 測定値を移動平均微分法で演算した結果をグラフ で示します（縦軸：微分値、横軸：時間）。 ③ 数値表示 ▩ 測定結果を吸光度、立上り時間、判定で表示します。 ② ◆ 注意事項 ▩ 上記装置による判定は陽性／陰性を確定するもの ではありません。あくまでも判定を補助するための機 能です。 ▩ 最終的な結果判定は、陰性／陽性コントロールを比 較対象とし増幅曲線で濁度の上昇を確認することに よって行ってください。 ▩ 詳細内容および上記以外の装置およびLAMP法試 薬を用いての判定に関しては、各機器・試薬の取扱 説明書・添付文書をご確認ください。 ③ 図 15. 機器判定画面 （RT-160C） Loopamp®L.monocytogenes検出試薬キット LAMP法を用いたL.monocytogenes検出検査の準備と手順 2006年8月 第一版 16 10 20 30 40 図13．コントロールの増幅曲線パターン（左） 検体の増幅曲線パターン（右） ◆ LA-320C（図14） ① 増幅モード ▩ 反応の増幅曲線を示します(縦軸：Abs、横軸：時間)。 0 時 間（分） 時 間（分） ① ◆ RT-160C（図15） ① 増幅モード 陰性検体 0.5 0.5 濁 陽性検体2 50 60 はじめに はじめに はじめに 前増菌培養 試薬調製 サンプル添加 前増菌培養 抽出操作 試薬調製 サンプル添加 サンプル添加 前増菌培養 抽出操作 抽出操作 試薬調製 操作手順 LAMP LAMP 反応 検出 LAMP反応 反応 検出 検出 結果判定 結果判定 結果判定 資料 資料 資料 ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ VII. 検査 フローチャート 食品 25g あるいは 25mL ↓ ┏ フィルター付きストマッカー用バッグ □ ┃ ＋ Half-Fraser培地、UVM培地、EB培地等 225mL ┃ 前 処 理 □ ┃ ← ストマッカー処理 30秒～1分間 □ ↓ ← 培養（前増菌培養） 30℃、24時間 前増菌培養液 約250mL ┣━━━┓ 領 域 B ┃ 前増菌培養液 ━ ━ ━ → 培養法へ ┃ 前培養済菌液 50μL ↓ ┏ 1.5mL 滅菌マイクロチューブ □ ┃ ← 遠心 2,000×g 、室温 5分間 □ ┃ ← 上清除去 （もしくは上清40μL除去する） 抽 出 □ ┃ ← スピンダウン □ ┃ ＋ 80μL Extraction Solution for Foods (EX F) ┃ □ ┃ ← 攪拌 ボルテックス □ ┃ ← スピンダウン □ ┃ ← インキュベート 95℃、5分間 □ ┃ ← 氷冷 □ ┃ ← スピンダウン ┏ 滅菌マイクロチューブ 試 ┃ マスターミックス調製 薬 1test ＿＿＿test 調 領 ┃ テスト数 Reaction Mix.Lis 製 域 □ ┃ （RM Lis） 20 μL ＿＿＿μL Bst DNA Polymerase ・ A □ ┃ (Bst DNA Polymerase) 1μL ＿＿＿μL 分 注 □ ↓ 分注 20μL/tube □ ┏ Loopamp 反応チューブ ┏ → □ ┫ ＋ 5μL/tube サンプル溶液・コントロー サ ル ┃ン ┃ ┃ プ 領 ┃ ← そのままピペッティングにて混和 ・5μL/tube サンプル溶液 【測定検体】 ル ┃ 溶 域 ┃ ・5μL/tube Positive Control Lis (PC Lis) 【陽性コントロール】 ┛液 C ┃ ・5μL/tube Extraction Solution for Foods (EX F) 添 ┃ ← スピンダウン 気泡がないか確認 加 LAMP反応液 25μL □ ┃ ＋ 10μL 1M Tris-HCｌ （pH7.0）（Tris） □ ┃ ← 攪拌 ボルテックス □ ┃ ← 遠心 2,000×g 、室温 30秒間 □ ┃ ← 氷冷 サンプル溶液 90～100μL □ ┃ Loopamp 濁度測定装置 L □ ┃ ┃ ← 電源投入 A M P 領 □ ┃ ┃ ← 表示温度確認 65℃ 反 域 □ ┗ ┫ ← チューブをセット 応D □ ┃ ← 反応開始ボタンを押す ・ ┃ LAMP反応 （65℃ 60分間） 反応中、リアルタイム濁度測定・判定 検 ┃ 反応停止 （80℃ 2分間） 出 データ処理 Loopamp®L.monocytogenes検出試薬キット LAMP法を用いたL.monocytogenes検出検査の準備と手順 2006年8月 第一版 17 はじめに はじめに はじめに 前増菌培養 試薬調製 サンプル添加 前増菌培養 抽出操作 試薬調製 サンプル添加 サンプル添加 前増菌培養 抽出操作 抽出操作 試薬調製 操作手順 LAMP LAMP 反応 検出 LAMP反応 反応 検出 検出 結果判定 結果判定 結果判定 資料 資料 資料 ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ ﾌﾛｰﾁｬｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ ｱｯｾｲｼｰﾄ VIII.アッセイシート DATE KIT NAME Lot. No. ASSAY Profile SHEET No. A B C D 11 22 33 44 55 66 77 8 A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2 A3 B3 C3 D3 A4 B4 C4 D4 A5 B5 C5 D5 A6 B6 C6 D6 A7 B7 C7 D7 A8 B8 C8 D8 Position Profile A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 Loopamp®L.monocytogenes検出試薬キット LAMP法を用いたL.monocytogenes検出検査の準備と手順 2006年8月 第一版 18 8 memo Loopamp®L.monocytogenes検出試薬キット LAMP法を用いたL.monocytogenes検出検査の準備と手順 2006年8月 第一版 19
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