CBA master buffer Kit マニュアル 改訂（概略） 目次 • マニュアル冊子 • Human, Mouse/Rat用マニュアル • Cell Siganling用マニュアル マニュアル冊子 改訂前 • マニュアル１冊 • • • 構成試薬(Standard, sample, bead)の調製方法 BD FACSCalibur setup方法 BD FACSArray setup方法 改訂後 • マニュアル3冊 1. 2. 3. 構成試薬(Standard, sample, bead)の調製方法 BD FACSCalibur setup方法 BD FACSArray setup方法 BD FACSDiva setup方法についてはwebを参照してください http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/products/product_features.php?key_products=97 Human, Mouse/Ratマニュアル Human, Mouse/Ratマニュアル Standard, sample, beadの調整方法 マニュアル変更点 • Materials Required but not Providedの “Required for Plate Loader Equipped Flow Cytometers” セクションを独立項目とし、 内容を改訂 • Filter plates • • Manifold • • 新しい カタログ番号（Millipore製） • 以前のmanifoldは、新しいplateでは使用できないのでMilliporeから新しいmanifoldが推奨されている Vacuum gauge and regulator • • 新しい カタログ番号（Millipore製） • 以前のプレートは販売中止 推奨された manifoldを使用しない場合 ワークフローの変更 • Instrument setup, bead prep, sample prep,assayの順番変更 Human, Mouse/Ratマニュアル ワークフロー 改訂前 • Instrument setup • Bead prep • Standards prep • Sample prep • Assay prep/incubation • Detector prep • incubation 改訂後 • Instrument setup • Sample prep • Standards prep • Bead prep • Detector prep • Assay prep/incubation Human, Mouse/Ratマニュアル Overview:Assay Procedure 改定前 改定後 Human, Mouse/Ratマニュアル Standard, sample, beadの調整方法 マニュアル変更点 (つづく) • Standard Prep • Reconstitution • • Standard Dilutions • • Top-0 pg/mlの10チューブ/ウェルを指定 Sample Prep • • Top standardを調製するために1本のチューブに全ての standardタブレットを入れ、その後 2mL assay diluentで溶 解する。 FCAP Array softwareへのdilutionの入力について記載 追加 (1:4,1:8,1:16 etc) Capture bead /Detection bead Prep(簡潔に説明) • • • • • SupernatantとSerum/Plasmaを別に記載（for Human） Beadsのvortex at least 15secondsの記載追加 調製例（35testsの場合）を１つ記載 調整に必要なBeads量の早見表を巻末Appendixに移動 TubeとPlate調製方法を別に記載 Human, Mouse/Ratマニュアル Standard, sample, beadの調整方法 マニュアル変更点 (つづく) • Assay Procedure (簡潔に説明) • • • TubeとPlate操作を別に記載 Standard dilutionの表を巻末Appendixに移動 Troubleshooting • • 最新のtroubleshooting sectionを各マニュアル に掲載 Human, MS/RATに対応する内容 Human, Mouse/Ratマニュアル Appendix • • • • Appendixを巻末に追加 Bead/PE formulation table（調製の公式テーブル） Essential tubes (standards) table(濃度のテーブル) New table for instruments (Instrument vs Detector) Cell Signalingマニュアル Cell Signalingマニュアル Standard, sample, beadの調整方法 マニュアル変更点 (5/11∼6/11) • Materials Required but not Providedの “Required for Plate Loader Equipped Flow Cytometers” セクションを独立項目と し、内容を改訂 • Filter plates • • Manifold • • 新しい カタログ番号（Millipore製） • 以前のmanifoldは、新しいplateでは使用できないのでMilliporeから新しいmanifoldが推奨されている Vacuum gauge and regulator • • 新しい カタログ番号（Millipore製） • 以前のプレートは販売中止 推奨された manifoldを使用しない場合 ワークフローの変更 • Instrument setup, bead prep, sample prep,assayの順番変更 Cell Signalingマニュアル ワークフロー 改訂前 • Instrument setup • Sample prep • Standards prep • Bead prep • Assay prep • Detector prep • incubation 改訂後 • Instrument setup • Sample prep • Standards prep • Bead prep • Detector prep • Assay prep/incubation Cell Signalingマニュアル Overview:Assay Procedure 改定前 改定後 Cell Signalingマニュアル Standard, sample, beadの調整方法 マニュアル変更点 (つづく) • Sample Prep • タンパク量が少ないことが判明しているサンプルは、初めから液量を減らすについて言及 • FCAP Array softwareへのdilutionの入力について記載 (1:4,1:8,1:16 etc) • Cell in Suspension • • • Denaturation操作を下記３種類から選択指示(step.3) • 5X Denaturation buffer • Ice-cold PBS, 5X Denaturation buffer • Ice-cold lysis buffer with detergent+ 15 minutes incubation, 5X Denaturation buffer Denatured Sampleがピペッティングしやすくなるような改善方法を3種類指定(step.4) • Probe sonicatorによるDNA切断 • 26G針によるDNA切断 • High quality DNase I(protease free)の使用 Adherent Cells • • Denaturation操作を2種類から選択指示(step.3) • 5X Denaturation buffer • 液を全て除去+5X Denaturation buffer、 はがす Denatured Sampleがピペッティングしやすくなるような改善方法を3種類指定(step.4) • Probe sonicatorによるDNA切断 • 26G針によるDNA切断 • High quality DNase I(protease free)の使用 Cell Signalingマニュアル Standard, sample, beadの調整方法 マニュアル変更点 (つづく) • Standard Prep • Reconstitution • • • Liquidの場合、Lyophilizedの場合を記載 Standard Dilutions • Top-0 U/mlの10チューブ/ウェルを指定 Capture bead /Detection bead Prep(簡潔に説明) • • • • Beadsのvortex at least 15secondsの記載追加 調製例（35testsの場合）を１つ記載 必要なBeads量の早見表を末尾Appendixに移動 TubeとPlate調製方法を別に記載 Cell Signalingマニュアル Standard, sample, beadの調整方法 マニュアル変更点 (つづく) • Assay Procedure (簡潔に説明) • • • TubeとPlate操作を別に記載 Standard dilutionの表を末尾Appendixに 移動 Troubleshooting • • 最新のtroubleshooting sectionを各マニュ アルに掲載 Cell Signalingに対応する内容 Cell Signalingマニュアル Appendix • • • • Appendixを巻末に追加 Bead/PE formulation table（調製の公式テーブル） Essential tubes (standards) table(濃度のテーブル) New table for instruments (Instrument vs Detector)
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