乳酸菌についての研究 Ⅰ 概要最近、植物性乳酸菌のヨーグルトが多く販売されており、人気となっている。そこで、キャベツの漬物から乳酸菌を取り出しヨーグルトを作成し、出来たヨーグルトには何か違いがあるのか疑問に思い実験を行った結果、有機酸の総量と有機酸に占める乳酸菌の割合から、ヨーグルトの味や固まり方に違いがあらわれることがわかった。 Ⅱ はじめに乳酸菌について調べていくうちに、漬物にも乳酸菌が含まれていることを知った。そこで、ドイツの家庭料理に「ザワークラウト」というキャベツの漬物があるので、群馬の特産品であるキャベツからも乳酸菌を取り出すことも可能ではないかと考え、実験を行った。 Ⅲ 乳酸菌とは炭水化物を乳酸【CH₃CH（OH）COOH】に変える働きのある微生物のこと。乳酸菌は一定の熟成期間を経て作られる食品中には必ず存在しているといってもよい。食品に限らず、有機物が堆積しているところにも存在している。しかし、正確な棲息数やどういった種類の乳酸菌がいるか、その乳酸菌がどのような役割を果たしているかなど、不明な点が多い。〈乳酸菌の定義〉グラム染色陽性細胞形態桿菌 or 球菌カタラーゼ試験陽性酸素要求性無・ごく微量要求運動性無内生胞子無栄養従属栄養ブドウ糖の代謝 50%以上を乳酸に転換 Ⅳ (気性：嫌気性) 実験方法１キャベツの漬物の作成キャベツの重量を含めて、3%、5%、10%の食塩水に漬ける。そして、それぞれ 30℃、 15℃(室温)に 10 日間漬けておく。漬け汁の pH が 4 になるくらいが目安。(乳酸は弱酸であるため、どんなに乳酸がふえても pH は 4 以下にはならないため) ２乳酸菌の採取・培養培地は通常用いる培地材料のほか、以下の材料を加えた培地を作成。・肉エキス…乳酸菌の生育を促す。・酢酸ナトリウム…pH の急激な変動を防ぐ緩衝液。・炭酸カルシウム…乳酸菌が乳酸を出すため培地が白濁→透明になる。・シクロヘキシド・アジ化ナトリウム…抗生物質でカビの防止。キャベツの漬け汁(以下、試料と表記)１ml あたりには約 10⁷～10⁸個の乳酸菌が存在すると考えられているため、単一の乳酸菌を採取しやすいように乳酸菌を１ml あたり 30～300 にまで希釈する必要がある。 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml }試料 1ml 生理食塩水 9ml 10 10² 10³ 10⁴ 10⁵ 10⁶ 滅菌ペトリ皿に希釈液 1ml と培地を 15ml まき、嫌気性の条件にするために寒天の層で表面をコーティングする。寒天重層培地＋試料 30℃で 1 日半培養。乳酸菌には至適生育温度が 40～45℃の高温性乳酸菌・30～35℃ の中温乳酸菌・10℃の低温性乳酸菌がいるため、ここでは幅広い種類の乳酸菌を採取するために中温の 30℃に設定した。培養できたペトリ皿の中から特徴のある乳酸菌のコロニー(培養細胞が形成する単一細胞由来の細胞塊)を取り出し、単一の乳酸菌として培養する。３ヨーグルトの作成培養できた乳酸菌を牛乳に投入するために、培地から遠心分離機を用いて乳酸菌だけを取り出す。そして、牛乳 60ml に乳酸菌を投入したものを 4 個作り、30℃で培養しヨーグルトを作成する。〈ヨーグルトのでき方〉乳酸発酵によってできる。C₆H₁₂O₆+2ADP+2Pi → 2 C₃H₆O₃+2ATP 乳酸菌ブドウ糖乳酸 C₆H₁₂O₆ C₃H₆O₃ ヨーグルトが固まるのは、タンパク質が酸により緩やかに沈殿しているためである。タンパク質として大きな構造変化はおきない。しかし牛乳の時にミセルコロイドとして互いに反発し合っていたものが、酸の添加によりカゼイン粒子(牛乳に多く含まれるタンパク質)同士の反発が抑えられ凝集してできる。４官能検査(嗅覚・味覚による検査) まず、できたヨーグルトのにおいを調べ明らかに異臭のするものは除外する。次に実際に試食をし、味に違いがあるかどうかを話し合う。５有機酸・アミノ酸の測定できたヨーグルトに含まれる有機酸の量とアミノ酸の量を分析装置を用いて測定。〈有機酸の量の測定〉機械的に高圧をかけた液体によって分析物をカラムに通し、このことにより各有機酸を分離・検出する。〈アミノ酸検出〉機械的に高圧をかけた液体によって分析物をカラムに通し、このことにより各アミノ酸を分離・検出する。 Ⅴ 実験結果１キャベツの漬物の作成どのキャベツの漬物も pH が 4 程度になった。２乳酸菌の採取・培養枯草菌(納豆菌)が表面を覆っているのが大半で、ほかにもセラチア菌やススカビが生えているものもあった。9 割方がコンタミ(化学実験における汚染)をしてしまった。今後の実験に使用できそうなものは、30℃3%のみであった。ペトリ皿中に乳酸菌の数が多いほど乳酸菌 1 個の大きさは小さく、少ないほど乳酸菌 1 個の大きさは大きかった。希釈 10 コロニーの数 10² 10⁴ 10³ ∞ 10⁵ 10⁶ 57 6 6 69 11 4 この結果より、この試料に乳酸菌は 6.3×10⁵個/ml 含まれていたことになる。 10⁴希釈の試料から特徴のある乳酸菌を選択。〈確認できた乳酸菌の形・色〉・両凸レンズ型…大部分がこれだった形・凸レンズ合体型…いくつか見られた色白・クリーム色のみ・球形…いくつか見られた３ヨーグルトの作成採取できた 19 種の乳酸菌でヨーグルトを作成。 30℃で培養 48 時間→固まったのは①。さらに 37℃で培養 48 時間→半数以上が固まる。結果として、19 種 76 このうち 13 種 22 個が固まった。普通のヨーグルトは 37℃で 8～12 時間で培養するので、全体的に固まり方が弱かったことがいえる。これは、初発菌数が少なく乳酸菌自体が増えるのに時間がかかったこと、また、乳酸菌はグルコース(ブドウ糖)をエネルギー源とするが、牛乳には乳糖が含まれており、グルコースを得るためにはまず乳糖をガラクトースにして、それをさらにグルコースにする必要があり、乳糖を分解するラクターゼの活性が低かったことが考えられる。４官能検査におい；異臭…漬物臭い、腐卵臭のするものがあった⇒除外牛乳のにおい…固まらなかった固まり具合；ふるいにヨーグルトを入れ、一定時間におけるこされて出てきた乳清の量を測定 ① ④ ⑤ ⑪ ⑥ ③ ② ⑧ ⑨ ⑩ ⑦ 6.8% 7.1 9.0 10.2 11.0 12.4 15.3 16.0 17.4 20.3 38.5 固い← 【ヨーグルトの軟度】 →軟らかい味；①③⑧⑩⑪ ⇒全体として酸味が市販品と比べると少なかった。それぞれ酸味の度合は異なっていた。チーズケーキのような味をするものもあった。比較的美味しかった。 ②④⑤⑥⑦⑨ ⇒牛乳の後味が残るものが多かった。とてもヨーグルトと言えるような味はしなかった。５有機酸・アミノ酸の測定〈アミノ酸の量〉いずれのヨーグルトもはっきりとしたアミノ酸の違いが表れなかった。官能検査で除外したものを測定してみると明らかに他とは違っていた。〈作成したヨーグルトにおける有機酸に対する乳酸の割合〉 120 100 80 その他 60 酢酸クエン酸乳酸 40 20 0 ① ③ ⑩ ⑧ ⑪ ⑥ ⑤ ⑨ ①③⑩⑧⑪の５種類は乳酸の割合が高かった。 ② ⑦ ④ 〈有機酸の総量〉 Ⅵ 考察有機酸に占める乳酸菌の割合が 50%以上のヨーグルトは、酸味がありヨーグルト独特の味がするものが大部分だった。また、乳酸菌の割合が 50%以下のものでは牛乳臭さが残ってしまっていた。他の有機酸、例えばクエン酸の割合の大小と味との関係性をみつけることができなかった。以上のことにから、乳酸によって牛乳臭さがなくなり、ヨーグルト独特の風味を出しているのではないかと考察した。また、ヨーグルトの固まり方は乳酸の割合が大きいほど固まり方は強いのではないかと予想していたが、予想とは異なりヨーグルトの固まり方は乳酸の割合とは比例しなかった。けれども、有機酸の総量が多いヨーグルトほど一定時間における乳清の割合が少ないものと対応するものが多かった。よって固まり方は乳酸の割合には関わらず、有機酸の総量が多いほど固まり方は強いのではないかと考察した。また、できたヨーグルトは全体的に固まり方が市販のヨーグルトに比べ、弱かった。これは牛乳に乳酸菌を投入する際に乳酸の培養が十分でなかったため、初発菌数が少なかったことが大きく関係していると考えられる。 Ⅶ 最後に１反省・感想時間が限られた中で結果を出すのが大変だった。最初の段階で実験自体に慣れていないこともあり、9 割方コンタミをしてしまい対照実験が出来なかったことと、アミノ酸の測定であまり違いがみられなかったことが残念だった。しかし最終的にはヨーグルトの作成は上手にできたので安心した。高度な内容の研究ができ、研究職が身近なものと感じることができてよかった。また、乳酸の割合と固まり方の関係がつかめなかったとき、違う視点から考察することができたので、化学的な思考で考えることが身につけることができた。２今後の展開今回の実験では採取できた乳酸菌の種類が少なく、単一の乳酸菌のみのヨーグルトの作成となってしまったので、後輩にはより多くの乳酸菌の採取や数種類の乳酸菌を混合させたヨーグルトの作成とさらに深めた研究をしてもらい、高女独自のヨーグルトをつくってもらいたい。 Ⅷ 参考文献・乳酸菌実験マニュアルー分離から固定まで Ⅸ （著）内村泰岡田早苗協力今回、私たちの乳酸菌に関する研究に協力してくださった先生方。高崎健康福祉大学松岡寛樹先生須永晃多さん本当にありがとうございました。