ウエスタンブロット トラブルシューティング集 Vol.1 Cyanagen Srl社提案 輸入元： Cyanagen Srl社製品 ウエスタンブロット用高感度検出 試薬WESTARの使用に付随して、ウエスタンブロットに おけるよくある課題に対するSolutionをご提案致します。 最も多い課題に対するSolutionのうちVoi.1では、 以下の2点に対して記載致します。 a.バックグラウンドが高い b.非特異的なバンドが出る a. バックグラウンドが高い Soltion1. 2次抗体の濃度調整 1:30,000 2°Ab 1:70,000 2°Ab 1:90,000 2°Ab 1:120,000 2°Ab 2次抗体のみをブロットすることにより特異性を確認したり、バンドが拡大し てしまう場合は、別の2次抗体の選択を検討してください。 抗体の質や鮮度によりバックグラウンドの高さに影響を及ぼす可能性もあ ります。 Soltion2. ブロッキング工程 ブロッキングしたい箇所が正しくブロッキングされていない場合があります。 TBS-Tバッファー中のTween-20の濃度を上げてください。（0.1~0.5％ｖ/ｖ）。また 可能であれば、ブロッキングバッファーとして5％のノンファットミルクを使用して ください。右図のようにノンファットミルクには、内因性ビオチンが含まれており、 アビジン/ストレプトアビジンとの互換性はありませんので、5％ウシ血清アルブ ミンに代替してください。 Soltion3. 洗浄工程 洗浄が不十分な場合に、左図のよう にバックグラウンドにムラが発生しま す。洗浄回数、時間を増やしてくださ い。また、常にメンブレンが浸漬して いる状態が維持されているか確認し てください。 Soltion4. メンブレンの取り扱い方 クリーンなプラスチック製ピンセッ トとパウダーフリーの手袋のみを 使用し、常にタンパク質の面が 上に向いているようにメンブレン をハンドリングしてください。 Soltion5. バッファー溶液の汚染 バッファーに粒子または細菌汚染物質 が存在しているとバックグラウンドに影 響を及ぼしますので、ご確認ください。 古いバッファーも交換を行ってください。 ｂ. 非特異的なバンドが出る Soltion1. 1次抗体、2次抗体が特異的でない モノクローナル1次抗体 ポリクローナル1次抗体 1次抗体が目的タンパク質に対して特異的ではない場合。 モノクローナル抗体を使用する、もしくは、抗原を用いたアフィニティ― クロマトグラフィーで精製した抗体を使用してください。 室温ではなく常に4℃で一晩1次抗体をインキュベートしてください。 TBS-Tバッファー中のNaClを低減してください。 非特異的な2次抗体 2次抗体が特異的であるかどうかは、2次抗体のみでブロットを行うこと により確認できます。 Soltion2. タンパク質の凝集と断片化 電気泳動層の中で、上記なタンパク質の凝集や断片化が起こって しまっていないか、確認してください。 タンパク質が高濃度にロードされてしまうとタンパク質のバンドが拡 散してしまうと一般的にも考えられているので、タンパク質量を減ら して調整してください。 Soltion3.SDSの相互作用 SDSの干渉がタンパク質に結合する抗体を起因とする非特 異的なバンドの生成に繋がることがありますので、メンブレ ンへの転写後は水で十分にメンブレンを洗浄してください。 Cyanagen Srl社 ウエスタンブロット用高感度化学発光検出試薬 WESTARシリーズ 製品Line Up 製品名 High タ ン パ ク 質 検 出 感 度 Low WESTAR Supernova ~50フェムトグラム WESTAR EtaC Ultra ~150フェムトグラム WESTAR ECL-SUN ~20ピコグラム 特長 容量（ｍｌ） 定価（¥） 最も高感度にタン パク質を 検出で きる試薬。シグナ ル持続性も高い。 20（10ｘ2本） 100（50ｘ2本） 200（100ｘ2本） 10,500 48,500 96,500 XLS3,0020 XLS3,0100 XLS3,0200 最もハンドリングし 易いスタンダード試 薬。長時間露光時 も高安定性維持。 20（10ｘ2本） 100（50ｘ2本） 200（100ｘ2本） 10,000 34,500 68,500 XLS4,0020 XLS4,0100 XLS4,0200 最も直線性が良く、 シグナル持続性も 高い試薬。エント リーレベルに使用。 50（25ｘ2本） 250（125ｘ2本） 500（250ｘ2本） 5,000 22,000 43,500 XLS063,0050 XLS063,0250 XLS063,0500 ※税抜価格となります。 WESTAR Starter Kit 春の特別価格 ¥33,000 XLS025,0000 無料サンプルプレゼント中！ お問い合わせは裏面をご覧ください。 ☎お問い合わせ先 〒103-0001 東京都中央区日本橋小伝馬町18-10 新規事業推進部 TEL: 03-3661-4662 Web: http://www.globolab.jp
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