DĠOKSĠN ANALĠZ METOTLARI VE AVRUPA KOMĠSYON DĠREKTĠFLERĠNDEKĠ YENĠ UYGULAMALAR TARIM, GIDA VE HAYVANCILIK BAKANLIĞI ANKARA GIDA KONTROL LABORATUVAR MÜDÜRLÜĞÜ 2014  Adı Soyadı : ÇalıĢtığı Birim : Demet UZUN GTHB Ankara Gıda Kontrol Laboratuvar Müdürlüğü  Konu : Dioksin Analiz Metotları Ve Avrupa Komisyon Direktiflerindeki Yeni Uygulamalar  Gidilen Ülke Görev Tarihi : : Amsterdam- HOLLANDA 10-14 ġubat 2014   1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Dioksin ve PCB’lerin Tanımı, Kimyasal Yapısı, Kaynakları Dioksin Krizi Dioksin Analiz Yöntemleri DR Calux metodu ve güvenilirliği DR Calux çalıĢma prensibi ve analiz alanları Dioksin ile ilgili AB Stratejileri ve düzenlemeler DR Calux için yeni kriterler Sonuç hesaplama ve raporlama Genel değerlendirme DĠOKSĠNLER    Dioksin ve benzeri bileĢikler hemen her yerde bulunabilen insan ve hayvan sağlığını tehdit eden toksik çevre kirleticileridir. Lipofilik olmaları nedeniyle özellikle hayvansal gıdalarda birikebilir. Besin zinciri yoluyla da insanlara ulaĢarak insan sağlığını etkilerler. Ġnsan sağlığı ve gıda güvenliği açısından dioksin kontaminasyonunun belirlenmesi ve önlenmesi büyük önem taĢımaktadır. DĠOKSĠNLER En çok bilinen dioksinler; -Poliklorlu-ρ-dioksinler (PCDD), -Poliklorludibenzofuranlar (PCDF) ve -Poliklorlubifeniller (PCB)’dir. Dioksin, iki oksijen köprüsüyle birbirine bağlanmıĢ iki klorlu benzen halkası içeren bileĢen grubunun genel ismidir. Poliklorludibenzofuran tek oksijen köprüsüyle birbirlerine bağlanmıĢ iki klorlu benzen halkası içeren bileĢen grubunun genel ismidir. 75 PCDD izomeri 135 PCDF izomeri PCB’LER  Poliklorlu bifeniller (PCB’ler) iki benzen halkasından oluĢan bir molekül olan bifenile bağlı 1 ile 10 klor atomundan oluĢan organik bileĢiklerdir. Toplam 209 PCB bulunmaktadır.  Bunların 12’si dioksin benzeri PCB’lerdir.  En bilinen ve toksik dioksin bileĢeni 2,3,7,8-tetraklorin-dibenzo-p-dioksin (TCDD)’ dir. Dioksin    Doğal olarak oluĢmaz. Ġnsan yapımı değildir. Ortamda klor varlığında 200oC-1000oC’de organik maddelerin yanması sonucu oluĢur. PCB Ġnsan yapımıdır. DIOKSINLERIN OLUġUM KAYNAKLARI  Atık yakma tesisleri  Tıbbi ve evsel atık bertarafı  Termik santraller  Petrokimya endüstrisi  Geri dönüĢüm metal endüstrisi  Çimento fabrikaları  Kağıt üretim tesisleri (beyazlatma)  Doğal kaynaklar (madenler, volkanlar, orman yangınları)  Hayvan karkaslarının yakılması vb. DĠOKSĠN TOKSĠSĠTESĠ YEM VE GIDALARDA DIOKSIN KRIZI Brezilya Turunçgil pulpu1998 Belçika PCB’li yağ 1999 Almanya Kil 1999 Belçika Kolin klorid 2002 Almanya Ekmekçilik atıkları 2003 Hollanda Patates kabukları/kaolinic kil 2004 Belçika Jelatin/Hidroklorik asit (HCl) 2006 Avustralya Balık/Home bush bay-2,4,5-T 2006 Hindistan Guara Gum/PCP 2007 Ġtalya Mozzarella atıkları 2008 DIOKSIN ANALIZ YÖNTEMLERI  HR-GCMS, Doğrulama metodudur. Kaynağın belirlenmesi için en iyi yöntemdir .  Biyotestler (örn: CALUX), tarama metodudur. Kontaminasyon sıklığı, yerin belirlenmesi, boyutu için en iyi yöntemdir . TOXIC EQUIVALENT (TEQ) HESAPLANMASI GCMS methodu x TEF1 = TEQ1 2. Bileşik: x TEF2 = TEQ2 3. Bileşik: x TEF3 = TEQ3 n. Bileşik: x TEFn = TEQn 1. Bileşik: 1.nin konsantrasyonu Numunenin toplam dioksin toksisitesi: CALUX® methodu NumuneninTEQ değerinin direkt ölçülmesi ToplamTEQ + DR Calux metodu ve güvenilirliği;  CALUX patentli bir ürün olup; klinik, gıda, çevre, kanser ile ilgili alanlarda ve büyük çoğunluğu hormon analizi üzerine yoğunlaĢmıĢ toplam 19 çeĢit CALUX sistemi bulunmaktadır. DR CALUX MEKANĠZMASI 16 IġIK EMISYONUNUN TANIMLANMASI DR CALUX sisteminde, dioksin Luminometer Centro XS3 ve benzeri maddelerin varlığında Berthold Detection Systems hücreler ışık yayar.  Tarama metotlarıyla elde edilen sonuçlar ulusal limitlerin %25’inden daha az olmalı AYRIM ANALĠZĠ-CARBON VE FLOROSĠL KOLONU PCB DIOKSIN/FURAN AYRıMı 1 2 3 Dioksin 4 5 5 6 6 7 7 PCB Sonucu, ulusal limitin %25 altından daha yukarıda kalan numuneler için dioksin ve PCB’lerin ayrımı gerekmektedir. BASKILAMA ANALIZI  Numune eksraktında var olan giriĢim yapan bileĢikler tarafından yanıtın olası baskılanmasını kontrol etmek için; 1. Ġlgi seviyesine karĢı gelen miktarda 2,3,7,8,-TCDD eklenerek 2. 2,3,7,8,- TCDD eklenmeden ölçülmelidir. BASKILAMA ANALIZI BIODETECTION SYSTEMS (BDS)  BDS, yem maddeleri, yağlar, et, süt ve balık ürünlerinde DR CALUX ile Dioksin ve dioksin benzeri PCB’lerin tanımlanmasında ISO 17025 standardına göre akredite olmuĢtur. DR CALUX ANALIZ ALANLARI Kan/Anne sütü Zehirli atıklar Gazlar Çevre /Toprak Yem Su Gıda Doğal yaşam alanları Uluslararası tanınırlık • North America Europe Europe Laboratories Service laboratories Japan: 3 Labs Consultants USA: 1 Ireland: 1 UK: 3 China: 2 Sweden: 1 Vietnam/Korea: 2 Asia Denmark: 1 Thailand: 1 Netherlands: 6 Labs Germany: 2 Lab Belgium 3 Labs South America: 2 France: 2 Taiwan: 4 Labs New Zealand: 1 Czech Republic: 1 Slovakia: 1 Swiss: 2 Turkey: AGKLM / Edip Sincer Italy: 2 Australia:2 Spain: 2 Cyprus: 1 Avrupa Birliği (AB) bünyesinde 12 farklı ülkede, 21 laboratuvar DR.CALUX sistemini kullanarak dioksin analizini gerçekleştirmektedir. Bu laboratuvarlar ve bulunduğu ülkeler aşağıda verilmiştir: • • • • • • • • • • • • Belgium; C.A.R.T.- University of Liege, Liege, VITO, Mol, Czech Republic; Veterinary Research Institute, Brno, The Netherlands;BioDetection Systems, Amsterdam, CCL B.V., Veghel, DWR, Amsterdam, Keuringsdienst van Waren, Zutphen, Masterlab BV, Boxmeer, RIKILT, Wageningen, AgriQuality Ltd., Lower Hutt, New Zealand; CEFAS, Burnham-on-Crouch, United Kingdom; EMPA, Dübendorf, Switzerland; Instituto Superiore di Sanita, Rome, Italy; Kaneka Techno Research Co., Ltd., Takasago-city, Japan; NIES, Tsukuba-city, Public Analyst's Laboratory, Galway, Republic of Ireland; State Veterinary and Food Institute, Kosice, Slovakia; LABTRASA, Murcia, Spain; SGIT-INIA, Madrid, Bureau of Food and Drug, Nangang Taipei, Taiwan; Environmental Analysis Laboratory of EPA, Chung Li City. 2004-2007 YILLARI ARASINDA YAPILAN GC-HRMS ILE DR CALUX SONUÇLARININ KARġILAġTIRMALI ÇALIġMALARI WHO-PCDD/F/PCB-TEQ (1997) vs. CALUX-Total-TEQ(pg/g fat) HRGC/HRMS Total-TEQ (TEF 1998) 10000.0 y = 2.093x + 62.652 R2 = 0.9556 9000.0 8000.0 7000.0 6000.0 5000.0 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0.0 0 500 1000 1500 2000 2500 DR CALUX Total-TEQ 3000 3500 4000 4500 DR CALUX VE GC/HRMS ILE DIOKSIN ANALIZI MALIYETLERI ULUSLARARASI DÜZENLEME ÇALIġMALARI VE AVRUPA KOMĠSYON DĠREKTĠFLERĠ AVRUPA KOMĠSYON DĠREKTĠFLERĠ EC/252 (GIDA) VE EC/278 (YEM) NOLU DÜZENLEMELERDE DR CALUX IÇIN YENI KRITERLER 2. Metod performansı 1.Kabul edilebilirlik 3. Kalite kontrol 31 EC/252 (GIDA) VE EC/278 (YEM) NOLU DÜZENLEMELERDE DR CALUX IÇIN YENI KRITERLER Biyoanalitik sonuçlar Bioanaliytical equivalents (BEQs) olarak ifade edilecek.  Kabul edilebilirlik kriterleri - Kalibrasyon eğrisi ve çalıĢma aralığı - Rakamsal sonuçların; 1) Procedure blank (prosedür kör) 2) Referans numune ile geri kazanım için düzeltilmesi - Raporlama limitinin prosedür körden en az 3 kat fazla olması - Geri kazanım oranının BEQ değerleri için %30-130 arasında olması  BDS yeni uygulamada yarı kantitatif olarak adlandırılan Calux için ne değişiklikler yaptı?  Yeni bir hesaplama dosyası hazırladı  Bu hesaplama dosyası için genişletilmiş bir kalibrasyon eğrisi oluşturdu Ölçüm serisi içine bir referans numunesi ekledi  Hesaplama dosyasına ilgi seviyeleri ekledi EU NO 1883/2006 – TEBLİĞ NO 2012/5 TÜRK GıDA KODEKSI BELIRLI GıDA MADDELERINDE DIOKSINLERIN VE DIOKSIN BENZERI POLIKLORLU BIFENILLERIN SEVIYESININ RESMI KONTROLÜ IÇIN NUMUNE ALMA, NUMUNE HAZıRLAMA VE ANALIZ METODU KRITERLERI TEBLIĞI  Bir biyodeney uygulanırken; TCDD ya da dioksin/furan/dl-PCB karıĢımı bilinen ve farklı konsantrasyonlarından oluĢan bir kalibrasyon seti kullanılmalıdır. Buna göre kalibrasyon eğrisi için R2 > 0.95 olmalıdır. 34 EU NO 252/2012 Yeni hesaplama tablosu Data formun resmini koy yeni kalibrasyon serileri için DR CALUX REFERANS MATERYALLERI   BDDs referans materyalleri: balık yağı ve yem materyali: AB limit değerinin yarısı kadar Dioksin içeren numune, AB seviyesinde Dioksin ve ToplamTEQ (Dioksin ve dl- PCB) içeren numune Yeni hesaplama tablosu R2 > 0.98 Prosedür kör düzeltmesi Biyodeney geri kazanım düzeltmesi Prosedür kör düzeltmesi Biyodeney geri kazanım düzeltmesi EC/252 (GIDA) VE EC/278 (YEM) NOLU DÜZENLEMELERDE DR CALUX IÇIN YENI KRITERLER  Metot performansı kriteri:  Tekrarlanabilirlik (RSDr) < %20 (TGK Tebliğ No: 2012/5 %30)  Laboratuvarlar arası yeniden üretilebilirlik (RSDR ) <%25 (Taslak tebliğde düzeltme!)  Hatalı uygun oranı < %5 (TGK Tebliğ No: 2012/5 %1 )  EĢik değer seviyeleri:  Ġlgi seviyesi (maksimum seviyenin %33 aĢağısı) (TGK Tebliğ No: 2012/5 %25)  Referans numunenin BEQ/TEQ oranına göre belirlenir. 42 EC/252 (GIDA) VE EC/278 (YEM) NOLU DÜZENLEMELERDE DR CALUX IÇIN YENI KRITERLER Kalite kontrol gereklilikleri:  Her çalıĢma kalite kontrol numuneleri içermeli (procedure blank ve referans numune)  Kalite kontrol tabloları oluĢturulmalı  Tarama sonuçları GC/HRMS ile doğrulanmalı:  Negatif numunelerin %2-10  Tüm Ģüpheli numuneler Shewhartkaart 3 pM punt 3.5 3.3 --> pM 2,3,7,8-TCDD in well  3.1 -2 * s +2 * s -3 * s 2.9 +3 * s gem 2.7 2.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 nr 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 43 YENĠ AVRUPA BĠRLĠĞĠ KOMĠSYON DÜZENLEMELERĠNE GÖRE;  Gıda ve yem numunelerinde bir biyodeney yöntemi kullanılmıĢsa sonuçlar BEQ olarak verilmelidir, TEQ olarak değil.  Yeni düzenlemelere göre raporlamada UYGUN veya ġÜPHELĠ olarak sonuç verilir. Dolayısıyla laboratuvar doğru hesaplamaları yapabilmek için dikkat etmelidir.  Numunenin uygun ya da Ģüpheli olması numunenin bulunduğu ürün grubuna bağlıdır. Dolayısıyla eğer bir sıkıntı varsa ürün grupları doğru değerlendirilmeli, eĢik değerler doğru belirlenerek BEQ düzeltmeleri tekrar yapılmalıdır. GENEL DEĞERLENDIRME Yeni düzenlemelerle;  DR CALUX metodu için sınırlar belirginleĢmiĢ, anlaĢılır hale gelmiĢtir.  Kabul edilebilirliği kesinleĢmiĢtir.  Ülkemizde Bakanlığımız tarafından 252/2012 nolu direktifler taslak haline getirilmiĢtir.  Taslağın Türkçe’ye uyarlanmasında sıkıntılar vardır. TEŞEKKÜRLER ANKARA GIDA KONTROL LABORATUVAR MÜDÜRLÜĞÜ