Dante Delivery of AdvaNced TEchnology Anno VI - n. 2 - Settembre 2007 In questo numero: Le mucine: una classe emergente di marcatori immunoistochimici • La classificazione delle mucine • Mucine di membrana • Mucine secretorie che formano gel Le mucine: una classe emergente di marcatori immunoistochimici Marco Chilosi, Anatomia Patologica, Università di Verona L e mucine costituiscono un’ampia famiglia di glicoproteine di grandi dimensioni (peso molecolare 2-20 x 105 Dalton) secrete da cellule epiteliali o espresse sulla loro membrana. Sono stati individuati più di 20 tipi differenti di mucina e la loro distinzione si basa sulla sequenza dei differenti backbone proteici (apomucine) codificati da geni MUC (localizzati su differenti cromosomi). La struttura molecolare delle mucine è complessa ed è caratterizzata dalla presenza di numerosi TR (tandem-repeats) capaci di formare un numero enorme di siti di potenziale O-glicosilazione tramite residui di serina o treonina. La presenza di questo peculiare involucro di zuccheri permette alle mucine di assorbire grandi quantità d’acqua e di impedire la proteolisi, contribuendo così al 123 mantenimento delle barriere mucose. Le mucine formano infatti la parte preponderante della frazione proteica del muco, con funzioni di protezione delle mucose dall’autodigestione e dalla penetrazione di patogeni e tossine, contribuendo alle difese immunitarie nel tratto gastrointestinale, nel sistema respiratorio e in quello riproduttivo. Le molteplici e importanti funzioni specifiche delle mucine sono legate alle loro caratteristiche visco-elastiche nella protezione delle mucose, ma sono coinvolte anche nella modulazione dell’adesione cellulare e nella regolazione di importanti pathways molecolari. Negli ultimi anni le conoscenze sull’eterogeneità delle mucine e sulle loro differenti funzioni ne hanno sottolineato l’importanza Anno VI - n. 2 - Settembre 2007 Reg. Trib. di Milano n. 32 del 28/01/2003 Editore Springer-Verlag Italia Srl via Decembrio 28 - 20137 Milano Realizzazione a cura di Medicom divisione di Springer-Verlag Italia Srl Direttore Responsabile Maria Antonietta Argentiero Stampa Geca SpA - via Magellano 11 Cesano Boscone (MI) Contiene IP Dante Delivery of AdvaNced TEchnology nella fisiologia e patologia delle mucose. La disponibilità di anticorpi monoclonali che riconoscono i cores proteici delle apomucine ha consentito il superamento delle tipizzazioni istochimiche, sostituite dall’analisi immunoistochimica. Questo approccio metodologico, più specifico e riproducibile, è in notevole espansione. L’analisi qualitativa e quantitativa delle mucine non è semplice a causa della complessità della loro classificazione, nonché per l’occorrenza di polimorfismi e splicing alternativi. Non sempre l’espressione di mRNA corrisponde a quella della relativa proteina e dati contrastanti sono riportati in letteratura a causa dell’eterogeneità metodolo- gica. La disponibilità di anticorpi monoclonali, specifici e sensibili, è fondamentale per poter analizzare con precisione e riproducibilità il pattern di espressione delle mucine nella patologia umana. Le applicazioni in patologia umana sono numerose e abbracciano diversi campi. Tra i principali ricordiamo la caratterizzazione delle lesioni pre-neoplastiche e neoplastiche del sistema gastrointestinale, quella di neoplasie ovariche e uterine, e quella dei tumori del polmone. Appaiono rilevanti anche le informazioni ricavabili dallo studio delle mucine nella fisiopatologia del “microambiente” delle mucose, in particolare in quello del sistema respiratorio. Anomalie quali- tative e quantitative delle mucine caratterizzano infatti la patogenesi di malattie croniche importantissime quali l’asma, la BPCO e la fibrosi cistica (1). Le mucine sono presenti in tutte le mucose in differenti combinazioni, correlate alle funzioni specifiche del tessuto nonché a stimoli microambientali capaci di influenzarne qualitativamente e quantitativamente l’espressione. Il pattern di espressione è in parte conservato nella trasformazione neoplastica, seguendo il fenotipo tissutale, e peculiari patterns di espressione possono essere utilizzati diagnosticamente come marcatori istogenetici e di differenziazione. La classificazione delle mucine TABELLA 1. Le mucine si suddividono, in base alle loro caratteristiche molecolari (con o senza TR) e in base alle caratteristiche biologiche e al pattern di espressione, in mucine secretorie e mucine di membrana. Mucine di membrana: MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC11, MUC12, MUC13, MUC16, MUC17, MUC20 Mucine secretorie (ricche in cisteina): MUC6, MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC19 Mucine secretorie (povere di cisteina): MUC7, MUC8, MUC9 Mucine prive di TR: MUC14, MUC15, MUC18(CD146) Da: Gene Bank e Callaghan Rose M, and Voynow JA, Physiol Rev 86:245,2006 (1) Vedi anche: http://www.gene.ucl.ac.uk/cgi-bin/nomenclature/searchgenes.pl TABELLA 2. Gene MUC1 MUC2 MUC3A MUC3B MUC4 MUC5AC MUC5B MUC6 MUC7 MUC8 MUC9 MUC11 MUC12 MUC13 MUC15 MUC16 MUC17 MUC18 MUC19 MUC20 Tipo M S M M M S S S S S S, M M M M M M M M S M Espressione prevalente pan-epiteliale intestino intestino intestino bronchi, colon bronchi, stomaco bronchi, salivari stomaco, intestino, vescica salivari bronchi tube colon, bronchi colon, pancreas colon, trachea, rene colon, bronchi ovaio intestino polmone, mammella salivari, trachea rene, placenta, polmone ecc. Cromosoma 1q21 11p15.5 7q22 7q22 3q29 11p15.5 11p15.5 11p15.5 4q13-21 12q24.3 1p13 7q22 7q22 3q13.3 11p14.3 19q21 7q22 11q23 12 3q29 M: mucine di membrana S: mucine secretorie Mucine di membrana T ra le mucine di membrana MUC1 e MUC4 sono state particolarmente studiate in campo oncologico per le potenzialità diagnostiche e prognostiche. MUC1 È una mucina di membrana espressa da quasi tutti gli epiteli (nel duodeno è caratteristicamente assente). Questa mucina è anche conosciuta come epithelial membrane antigen (EMA), un ben noto marcatore in patologia e immunoistochimica. L’espressione di MUC1 può subire variazioni in differenti tumori (ad es. nel carcinoma della mammella). La molecola può essere iper-espressa e contemporaneamente ipo-glicosilata nello stesso tumore e questa combinazione rende MUC1 un potenziale bersaglio per strategie immunoterapeutiche e vaccini anti-tumorali (2). MUC1 è espressa al polo apicale delle cellule epiteliali nella maggior parte dei tessuti ove svolge un importante ruolo fisiologico (adesione cellulare, differenziazione, modulazione del sistema immune, regolazione dell’adesione cellulare). La porzione intra-citoplasmatica di MUC1 è fosforilata e può interagire con importanti pathways molecolari (ad es. betacatenina, recettori ormonali ecc.). La genetica di MUC1, soprattutto particolari polimorfismi (ad es. l’omozigosi di forme di MUC1 di piccole dimensioni) appare correlata con la suscettibilità a sviluppare gastrite cronica, metaplasia intestinale e carcinoma gastrico. MUC4 È una mucina di membrana estesamente espressa a livello tracheo-bronchiale, intestinale, nel sistema riproduttivo ecc. Dati recenti hanno dimostrato per questa mucina un ruolo fisiologico complesso e importante. MUC4, infatti, a livello citoplasmatico è capace di interagire come ligando con la tirosin-kinasi recettoriale Dante Delivery of AdvaNced TEchnology ErbB2 e può contribuire alla regolazione della p27, importante inibitor e del ciclo cellular e. Queste funzioni sono presumibilmente correlate con le caratteristiche di marcatore “prognostico” di MUC4 (come ad es. nel carcinoma del polmone e nel carcinoma del pancreas) (3). In diversi tipi di epitelio MUC4 non è normalmente espressa, a differenza di quanto osser vato nelle corrispondenti neoplasie. Questa eterogeneità di espressione può essere utilizzata a livello diagnostico. Ad esempio nel pancreas MUC4 non è espressa, a differenza del carcinoma intraduttale, in cui sono rilevabili consistenti livelli di espressione. Una interessante applicazione diagnostica di MUC4 è stata recentemente proposta nell’ambito della diagnosi differenziale tra mesotelioma (MUC4-negativo) e carcinoma sieroso dell’ovaio (MUC4-positivo) (4). Mucine secretorie che formano gel I n questo gruppo ci sono le mucine più utilizzate in patologia (MUC2, MUC5AC, MUC5B, e MUC6). I geni di queste mucine sono localizzati sul cromosoma 11 e presentano significative analogie di funzione e di struttura. MUC2 Q uesta mucina è il marker tipico della cellula goblet intestinale. La proteina, che è scarsamente solubile, caratterizza il denso muco intestinale ed è fondamentale per le funzioni di barriera contro la penetrazione di patogeni intestinali (ad es. la Entamoeba histolytica aderisce alla mucina utilizzando una lectina di 170 kD ed è bloccata da questa interazione), mentre nell’amebiasi l’invasività è determinata dalla dissociazione del gel del muco intestinale operata dall’azione di una proteasi MUC2-specifica. MUC2 è considerata un ottimo marcatore di differenziazione intestinale (insieme al fattore di trascrizione cdx-2). Elevati livelli di espressione di MUC2 sono dimostrabili immunoistochimicamente nelle cellule goblet intestinali, nei carcinomi dell’intestino, nelle lesioni neoplastiche e pre-neoplastiche che presentano caratteri di differenziazione intestinale in diversi organi come: ovaio, polmone e stomaco, metaplasia intestinale nello stomaco ecc. Nell’esofago di Barrett, il profilo di espressione delle mucine contribuisce alla definizione del tipo di metaplasia (completa, incompleta) e del rischio di sviluppare un carcinoma (5, 6). Interessante notare come nei topi knock-out (Muc2 -/-) sia possible dimostrare un aumento della proliferazione e della motilità cellulare a livello intestinale, come an- che il decremento dell’apoptosi. Queste anomalie sono verosimilmente correlate nei topi Muc2 -/all’elevata frequenza di adenomi e carcinomi gastrointestinali. MUC5AC N ota come “mucina tracheobronchiale”, viene espressa anche a livello gastrointestinale (in particolare nelle foveole gastriche). Nel polmone normale questa mucina è espressa a livello delle cellule caliciformi (goblet) e ne evidenzia molto precisamente l’incremento a livello bronchiolare in corso di stimolazioni flogistiche. L’espressione di differenti tipi di mucina, e in par ticolare di MUC5AC, è stata utilizzata per distinguere e caratterizzare differenti tipi di adenocarcinoma del polmone. Il carcinoma a cellule con castone è caratterizzato da elevata espressione di MUC1, ma modesta o nulla espressione di MUC5AC. Il carcinoma bronchiolo-alveolare mucinoso (m-BAC) è caratterizzato da elevati livelli di espressione di MUC5AC, mentre MUC1 è assente o ipo-espressa. Questo particolare “profilo” di espressione rappresenta un utile marcatore diagnostico nell’ambito della diagnosi differenziale degli adenocarcinomi del polmone. Questa distinzione è clinicamente rilevante alla luce della corrispondenza tra fenotipo mucinoso e peculiari alterazioni molecolari (assenza di mutazioni di EGFR, ma presenza di mutazioni di KRAS), che determinano la predittività sulla risposta a inibitori delle tirosin-kinasi (7). Nel pancreas MUC5AC non è normalmente espressa, ma è rilevabile nel carcinoma duttale e questa espressione è un utile marcatore diagnostico, specialmente su prelievi con ago sottile (8). Il profilo di espressione delle mucine, e in particolare l’espressione di MUC5 e MUC2, caratterizza le forme mucinose intraduttali (9). Espressione aberrante di MUC5AC caratterizza anche i processi oncogenetici del grosso intestino (10). MUC5B MUC6 V definita mucina “gastrica ghiandolare” a causa del ruolo fondamentale che ricopre nella protezione della mucosa gastrica (acidità, proteasi, patogeni e traumi). Livelli significativi di espressione sono però dimostrabili anche nella cistifellea e, in minor quantità, a livello intestinale, nelle ghiandole di Brunner. Nel carcinoma gastrico l’espressione di MUC6 è spesso diminuita e la riduzione è correlata con l’aggressività del tumore. In questo tumore la distin- ede tra le sue funzioni principali quella di fornire le proprietà visco-elastiche e lubrificanti alla saliva: è infatti una mucina espressa nelle ghiandole salivari. Livelli significativi di espressione sono dimostrabili anche nei bronchi, nelle ghiandole submucose e nelle cellule goblet bronchiali, nell’endocervice, nel pancreas e nella cistifellea. L’epitelio dell’endocervice esprime tre delle mucine secretorie: MUC5AC, MUC5B e MUC6. a b c d È Figura 1. Espressione di MUC2 [Ab NCL-MUC-2] nel colon (a) e nel digiuno (b); espressione di MUC4 [Ab NCL-MUC-4] (c) e MUC1 [Ab NCL-MUC-1] (d) nel digiuno Dante Delivery of AdvaNced TEchnology zione tra fenotipo “intestinale” e “gastrico” si basa sull’identificazione di un profilo in cui le mucine sono componenti fondamentali (11). Nel carcinoma dello stomaco, infatti, vengono conservate, anche se eterogeneamente, le mucine gastriche (MUC1, MUC5AC, MUC6), ma viene espressa in modo anomalo MUC2 nelle forme mucinose a differenziazione intestinale. teins in health and disease. Physiol Rev. 2006;86(1):24578. Review. 2) Li Y, Cozzi PJ. MUC1 is a promising therapeutic target for prostate cancer therapy. Curr Cancer Drug Targets. 2007;7(3):259-71. Bibliografia 3) S i n g h A P, C h a t u r v e d i P, Batra SK. Emerging roles of MUC4 in cancer: a novel target for diagnosis and therapy. Cancer Res. 2007;67(2):4336. Review. 1) Callaghan Rose M, Voynow JA. Respiratory tract mucin genes and mucin glycopro- 4) D a v i d s o n B , Z h a n g Z , Kleinberg L, Li M, Florenes VA, Wang TL, Shih IM. Gene a b c d expression signatures differentiate ovarian/peritoneal serous carcinoma from diffuse malignant peritoneal mesothel i o m a . Clin Cancer Res. 2006;12(20):5944-50. 5) P i a z u e l o M B , H a q u e S , Delgado A, Du JX, Rodriguez F, Correa P. Phenotypic differences between esophageal and gastric intestinal metaplas i a . Mod Pathol. 2 0 0 4 ; 17(1):62-74. 6) Warson C, Van De Bovenkamp JH, Korteland-Van Male AM, Buller HA, Einerhand AW, Ectors NL, Dekker J. Barrett's esophagus is characterized by Figura 2. Espressione di MUC1 [Ab NCL-MUC-1] (a, negativa), MUC2 [Ab NCL-MUC-2] (b), MUC5AC [Ab NCL-MUC-5AC] (c) e MUC6 [Ab NCL-MUC-6] (d) in un caso di esofago di Barrett expression of gastric-type mucins (MUC5AC, MUC6) and TFF peptides (TFF1 and TFF2), but the risk of carcinoma development may be indicated by the intestinal-type mucin, MUC2. Hum Pathol. 2002;33(6):660-8. 7) Finberg KE, Sequist LV, Joshi VA, Muzikansky A, Miller JM, Han M, Beheshti J, Chirieac LR, Mark EJ, Iafrate AJ. Mucinous differentiation correlates with absence of EGFR mutation and presence of KRAS mutation in lung adenocarcinomas with bronchioloalveolar features. J Mol Diagn. 2007;9(3):320-6. a 8) Giorgadze TA, Peterman H, Baloch ZW, Furth EE, Pasha T, Shiina N, Zhang PJ, Gupta PK. Diagnostic utility of mucin profile in fine-needle aspiration specimens of the pancreas: an immunohistochemical study with surgical pathology correlation. Cancer. 2006; 108(3):186-97. 9) Luttges J, Zamboni G, Longnecker D, Kloppel G. The immunohistochemical mucin expression pattern distinguishes different types of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas and determines their relationship to mucinous noncystic carcinoma and ductal adenocarcinoma. Am J Surg Pathol. 2001;25(7):942-8. 10)Forgue-Lafitte ME, Fabiani B, Levy PP, Maurin N, Flejou JF, Bara J. Abnormal expression of M1/MUC5AC mucin in distal colon of patients with diverticulitis, ulcerative c o l i t i s a n d c a n c e r. I n t J Cancer. 2007 Jun 12; [Epub ahead of print]. 11)Tian MM, Zhao AL, Li ZW, Li JY. Phenotypic classification of gastric signet ring cell carcinoma and its relationship with clinicopathologic parameters and prognosis. World J Gastroenterol. 2007;13(23):3189-98. b c Figura 3. Espressione di MUC5AC [Ab NCL-MUC-5AC] nelle cellule goblet bronchiolari (a), nell’iperplasia a cellule goblet in un bronchiolo (b) e nel BAC mucinoso (c) a b c Figura 4. Espressione di MUC1 [Ab NCL-MUC-1] (a), MUC2 [Ab NCL-MUC-2] (b) e MUC5AC [Ab NCL-MUC-5AC] (c) in un caso di carcinoma mucinoso papillare intraduttale del pancreas
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