FAM

Examples of Inherited Disorders Detectable by PCR
Disease
Affected Gene
Severe-combined immunodeficiency,
SCID
adenosine deaminase (ADA)
Lesch-Nyhan syndrome
hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase
(HGPRT)
α1-Antitrypsin deficiency
α1-Antitrypsin
Cystic fibrosis
cystic fibrosis transmembrane conductance (CFTR)
protein
Fabry disease
α-galactosidase
Gaucher disease
acid β-glucosidase (glucocerebrosidase)
Sandhoff disease
hexosaminidase A and B
Tay-Sachs disease
hexosaminidase A
Familial hypercholesterolemia (FH)
LDL receptor
Glucose-6-phosphate dehydrogenase
deficiency
glucose-6-phosphate dehydrogenase
Maple syrup urine disease
branched-chain α-keto acid dehydrogenase
Phenylketonuria (PKU)
phenylalanine hydroxylase
Ornithine transcarbamylase deficiency
ornithine transcarbamylase
Retinoblastoma (Rb)
RB gene product, pRB
Sickle-cell anemia
point mutation in β-globin
β-Thalassemia
mutations in β-globin gene that result in loss of
synthesis of protein
Hemophilia A
Factor VIII
Hemophilia B
Factor IX
Diagnostica Biomolecolare:
Tecnologie e Applicazioni
Preparazione dei campioni:
(Estrazione del DNA o dell’RNA dal tessuto di interesse)
Analisi delle mutazioni:
SSCP – DHPLC – Dot blot - Southern - PCR (ARMS – Enzimi di
restrizione)
Real-Time PCR (Discriminazione allelica) - RT-PCR
Analisi HT
Diagnosi attraverso l’analisi
molecolare
mRNA
DNA
Diagnosi attraverso l’analisi
molecolare
mRNA
a. RT-PCR
b. Protein Truncation Test (PTT)
a. RT-PCR
RT-PCR permette di evidenziare variazioni
nella lunghezza dell’mRNA (delezioni) oppure
modulazioni del livello dei trascritti (mutazioni
nei siti di regolazione dell’espressione).
Può essere vantaggiosa nel caso si analizzi un
gene di notevoli dimensioni (distrofina).
Il gene che codifica la distrofina è il più
grande del nostro genoma.
E’ lungo 2.4 Mb, ed è costituito da 79
esoni
b. Protein Truncation Test (PTT)
Il “PTT” è un test che permette di mettere in
evidenza la formazione di una proteina tronca.
Naturalmente non permetterà di conoscere il
tipo di mutazione che ha causato l’evento
PTT
“Protein Truncation Test”
È un test specifico per mutazioni frameshift,
nonsense, splice site che portano alla
produzione di una proteina tronca
(Neurofibromatosi, Distrofia di Duchenne)
Amplificazione del cDNA
Presenza al 5’:
• di un promotore,
• sito di inizio della trascrizione
• Una sequenza specifica che permetta il giusto frame di
lettura
Il prodotto di PCR viene messo in contatto con un
sistema di trascrizione e traduzione che costruisce il
polipeptide corrispondente, le cui dimensioni vengono
analizzate su gel di poliacrilamide con SDS.
Polipeptidi tronchi avranno dimensioni minori rispetto
a quelle di controllo.
Diagnosi attraverso l’analisi
molecolare
DNA
a. Mutazioni non necessariamente caratterizzate
b. Specifiche mutazioni
• Amplificazione
della
sequenza
da
analizzare (PCR)
• Individuazione dei prodotti mediante
sonde specifiche (Ibridazione)
a. Mutazioni non necessariamente caratterizzate
• Mobilità elettroforetica di heteroduplex
• Single-strand conformation polymorphism (SSCP)
• Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
• Mismatch cleavage
enzimatico
chimico
SSCP
Analisi di polimorfismi di DNA a singola elica
• Amplificazione mediante PCR del frammento di DNA
da analizzare.
• Denaturazione.
• Elettroforesi su gel di poliacrilamide non denaturante
del DNA da analizzare e di un DNA di controllo.
In presenza di mutazione la diversità di conformazione del
DNA a singola elica determinerà differenze nella velocità di
migrazione.
DGGE
“denaturing gradient gel electrophoresis”
DHPLC
“denaturing high performance liquid cromatography”
Sfruttano le proprietà del DNA eteroduplex,
in gradiente di denaturazione,
per poter individuare sequenze che differiscono anche per una
sola base
Questi metodi non individuano la posizione
e il tipo di mutazione.
Non permettono di discriminare tra una
mutazione che provoca un’alterazione nel
prodotto proteico ed un semplice
polimorfismo del DNA.
Per conoscere quindi se la mutazione
messa in evidenza può causare un
fenotipo patologico occorre ricorrere al
sequenziamento
b. Specifiche mutazioni
• La mutazione che causa la malattia è
unica ( Falcemia )
• Effetto del fondatore o vantaggio degli
eterozigoti ( bTalassemia – Fibrosi cistica )
• La malattia è causata da uno specifico
meccanismo molecolare ( Corea di Huntington
– FraX )
b. Specifiche mutazioni
• Digestione con enzimi di restrizione di DNA amplificato
con PCR; controllo della grandezza dei frammenti su
gel
• Ibridazione di DNA amplificato
oligonucleotidi allele specifici (ASO)
con
PCR
ad
• Amplificazione di DNA usando primers allele specifici
(ARMS)
• PCR con primers localizzati agli estremi di una
delezione o di un breakpoint di traslocazione
• Individuazione del numero di triplette ripetute
Digestione con enzimi di restrizione di DNA
amplificato con PCR;
controllo della grandezza dei frammenti su gel
M
1
2
3
4
187 bp
165 bp
+-
+-
++
++
Analisi della mutazione N1303K (gene CFTR: 4041 C>G)
In questo caso la mutazione crea un sito di restrizione per l’enzima DdeI (CTNAG), perciò
l'enzima taglia il DNA con la mutazione
(+ presenza della mutazione; - mutazione assente;
M = marcatore di peso molecolare)
Scomparsa di un sito BclI nel gene del fattore VIII
Ibridazione di DNA amplificato con PCR ad
oligonucleotidi
allele
specifici
(ASO)
PCR con primers localizzati agli estremi di una
delezione o di un breakpoint di traslocazione
ARMS
“Amplification refractory mutation system”
(amplificazione allele specifica)
• Si eseguono due amplificazioni parallele.
• Uno dei primer è comune ad entrambe le
reazioni;
• l’altro in una reazione è specifico per
l’allele normale, nell’altra per l’allele
mutato
PCR allele specifica
Multiplex ARMS test per individuare 4 specifiche
mutazioni che causano la fibrosi cistica
Real Time PCR
Per ogni campione da analizzare utilizzo 2
differenti sonde marcate con 2 differenti
fluorofori
1) Complementare all’allele “wild type”
2) Complementare all’allele mutato
e la stessa coppia di primers
Discriminazione allelica
L’analisi viene condotta operando inizialmente una reazione enzimatica di amplificazione del DNA,
conosciuta come Polymerase Chain Reaction (PCR), che consente di amplificare in vitro una
specifica regione della molecola, copiandola in varie fasi successive, fino ad ottenerne milioni di
copie.
In tale maniera vengono amplificati, mediante amplificazione genica fluorescente multipla , 18
esoni del gene della Distrofina, così ripartiti:
Il sistema, realizzato seguendo le linee guida del gruppo collaborativo europeo per la diagnosi
molecolare della Distrofia DMB/DMD (EMQN), permette di evidenziare circa il 98% delle delezioni
del gene della Distrofina.
Exon
exon 1
exon 3
exon 43
exon 50
exon 13
exon 6
exon 47
exon 60
exon 52
Size
(bp)
535
410
357
271
238
202
181
139
113
DYE
Exon
HEX
HEX
HEX
HEX
HEX
HEX
HEX
HEX
HEX
exon 45
exon 48
exon 19
exon 17
exon 51
exon 8
exon 12
exon 44
exon 4
Size
(bp)
547
506
459
416
388
360
331
268
196
DYE
FAM
FAM
FAM
FAM
FAM
FAM
FAM
FAM
FAM
Sequenziamento
Campioni biologici su cui è possibile eseguire
il test:
Prelievo ematico in EDTA
2 ml
Liquido Amniotico
10 ml
Villi Coriali
10 mg
DNA
2 ug
Le ricerche sono state condotte sul cetuximab, un anticorpo monoclonale utilizzato
per il trattamento del cancro del colon-retto metastatico ed è stato individuato un
gene (KRAS) che predice l'efficacia di questa molecola sul paziente.
I risultati mostrano che il cetuximab funziona meglio nei pazienti che non
presentano mutazioni in questo marcatore.
Questa scoperta è un altro decisivo passo avanti verso la messa a punto di terapie
sempre più mirate e su misura per il paziente.
Cetuximab è un anticorpo
monoclonale che blocca il recettore
dell’EGF.
La proteina Ras si trova a valle di
EGFR, quindi anche bloccando il
recettore non si ottiene la risposta
desiderata (blocco della proliferazione
cellulare)
Ricerca delle mutazioni del gene K-Ras
nella biopsia del paziente
Diagnosi di malattie da espansione
di triplette ripetute
Variazioni del genoma
possono determinare:
• Insorgenza di malattie genetiche
• Differente predisposizione a determinate
patologie
• Differente risposta a specifiche terapie
• Differente risposta a stress ambientali, a virus,
a tossine
Diagnostica Biomolecolare:
Tecnologie e Applicazioni
Individui affetti
Identificazione eterozigoti
(malattie ad eredita mendeliana)
Presintomatici
(malattie ad esordio tardivo)
Suscettibilità genetica
Risposta a specifiche terapie
(fenotipi complessi)
Diagnostica Biomolecolare:
Tecnologie e Applicazioni
Individui affetti
•Diagnosi preimpianto
•Diagnosi prenatale
•Diagnosi neonatale
Identificazione eterozigoti
• Consulenza genetica
(malattie ad eredita mendeliana)
Diagnostica Biomolecolare:
Tecnologie e Applicazioni
Suscettibilità genetica
Presenza di mutazioni a geni oncosoppressori
BRCA1- BRCA2 cancro al seno
Risposta a specifiche terapie
Ricerca delle mutazioni K-Ras nel carcinoma al colon
(fenotipi complessi)

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