Struttura genetica delle popolazioni di piante da orto Cose da sapere per cominciare Impollinazione Gamia Fecondazione Gametofito Nucleo vegetativo Partenocarpia Sinergidi Endosperma Apirenia Doppia fecondazione Nucleo secondario Xenia Nucleo spermatico Micropilo Sacco embrionale Tubetto pollinico Riproduzione nelle angiosperme Anfimissia: riproduzione sessuale per seme Autogamia L’embrione si forma in seguito ad autofecondazione Allogamia L’embrione si forma in seguito a fecondazione incrociata Apomissia: riproduzione asessuale per seme L’embrione si forma da una cellula 2n, somatica o di un sacco embrionale non ridotto Propagazione vegetativa: Struttura genetica moltiplicazione per parti vegetative Percentuali di allogamia 1 0-4 90 100 100 100 70 5-35 100 93 1-6 90 70 100 70 2-5 Lorenzetti et al. 1994 Struttura genetica Strutture fiorali Specie prevalentemente autogame Cleistogamia: fecondazione a fiore chiuso, è un meccanismo frequente di autofecondazione (es. orzo) Lattuga Lo stilo si allunga all'interno della colonna staminale, raccogliendo il polline. L'avvenuta fecondazione è rivelata dall'incurvamento dei due lobi dello stigma Nel pomodoro lo stilo si allunga all'interno del cono formato dagli stami e viene autoimpollinato. Se però è molto lungo puo' fuoriuscire prima della fecondazione e venire impollinato da pronubi Peperone e melanzana hanno il fiore pendulo, il polline cade spontaneamente sullo stigma, mentre si trova all'interno della colonna staminale Struttura genetica Fiore di lattuga si vedono gli stigmi già ricoperti di polline ma non ancora incurvati verso il basso. Lavando via il polline si può emasculare, per poi realizzare l'incrocio portando il polline del partner prescelto Struttura genetica Strutture fiorali Specie prevalentemente allogame Dioicismo I fiori maschili e femminili sono portati da individui diversi Nelle angiosperme la separazione dei sessi è rara (circa il 5% delle specie) Determinazione del sesso Cromosomica (spinacio ?) Genetica (asparago) Struttura genetica Strutture fiorali Specie prevalentemente allogame Con fiori monoclini intervengono meccanismi genetici per l'esclusione o riduzione dell'autofecondazione Dicogamia Sfasamento dell’antesi maschile e femminile Proterandria: il polline viene rilasciato prima che lo stigma sia ricettivo. Si trova nelle Apiacee (carota) Proteroginia: il polline viene rilasciato quando lo stigma non è più ricettivo Struttura genetica Incompatibilità Incapacità di produrre seme pur in presenza di gameti maschili e femminili funzionali Auto/alloincompatibilità Presente in almeno 300 specie, specialmente di Asteracee, Brassicacee, Graminacee, Rosacee e Solanacee In piante da orto Incompatibilità di tipo Monofattoriale Bi/multifattoriale + Beta Gametofitico Sporofitico + Brassica + + Cichorium intybus + + Lycopersicum + Rapahanus + Solanum + + + + Struttura genetica L'incompatibilità può essere classificata in tre modi Omomorfica o Eteromorfica I fiori compatibili hanno morfologia diversa Monofattoriale o Bifattoriale Uno o più loci coinvolti Gametofitica o Sporofitica Determinata dal genotipo del polline o da quello della pianta da cui proviene Struttura genetica Incompatibilità ss Ss Sistema sporofitico Omomorfico/Eteromorfico Monofattoriale/bi(multi)fattoriale Diallelico/Multiallelico Dominanza/Codominanza tra alleli Sistema gametofitico Es. Petunia Sporofitico Monofattoriale Eteromorfico Fiore a spillo Monofattoriale/Bifattoriale Multiallelico Fiore a spazzola S1 S2 Le unioni posso essere: Compatibili S1S2 x S3S4 -> S1S3, S1S4, S2S3, S2S4 Semicompatibili S1S2 x S1S3 -> S1S3, S2S3 Incompatibili S1S2 x S1S2 -> non si ottiene seme Sistema sporofitico-gametofitico: Cacao Sistema post-zigotico poligenico: Autosterilità Es. Trifolium Gametofitico Monofattoriale Omomorfico Struttura genetica Incompatibilità Caratteristiche dei due sistemi principali di autoincompatibilità Caratteristica Sistema Sporofitico Gametofitico Reazione controllata da Genotipo parentale Genotipo del polline Momento dell’azione del gene S nel polline Pre-meiotico (?) Post-meiotico Tipo di polline Tricellulare Bicellulare Tipo di stigma Asciutto Umido Superficie stigmatica Precoce Stilo - Tardivo Localizzazione dei fattori maschili Superficie dell’esina Tubetto pollinico Localizzazione dei fattori femminili Stigma Stilo Callosio nel polline e nelle papille stigmatiche Callosio nel tubetto; scoppio dell’apice Sito e momento della reazione Risposta Struttura genetica Come si individua l’esistenza di un sistema di autoincomaptibilità ? Incrocio diallelico tra F1 Es. Sistema gametofitico monofattoriale S1S2 x S3S4 -> S1S3, S1S4, S2S3, S2S4 Con 4 alleli 4/16 degli incroci sono incompatibili In una popolazione con n alleli n/n2 degli incroci casuali sono incompatibili S1S3 S1S4 S2S3 S2S4 S1S3 X O O S1S4 O X O O S2S3 O O X O S2S4 O O O O X Il numero di incroci incompatibili in una popolazione serve a valutare il numero di alleli Struttura genetica Incompatibilità I sistemi più studiati 1. Crucifere (Brassica) Sporofitico, monofattoriale, omomorfico Risposta stigmatica precoce, inibizione della germinazione del polline 2. Solanacee (Nicotiana, Lycopersicum, Solanum) Gametofitico, monofattoriale, omomorfico Risposta stilare, lisi del tubetto pollinico 3. Papavero Gametofitico, monofattoriale, omomorfico Risposta stigmatica, lisi del tubetto pollinico Struttura genetica Incompatibilità Brassica oleracea, campestris, ecc. - Sistema sporofitico, fino a 80 alleli Componenti stigmatiche SLG : S-locus Glycoprotein Glicoproteina secreta SRK : S-locus Receptor Kinase Ha tre domini 1. dominio extracellulare con alta omologia a SLG 2. dominio transmembrana 3. dominio kinasico Aquaporin SLR1 : S-Locus Related protein Componenti polliniche SCR/SP11 Piccola proteina secreta ricca di cisteina. Si lega a SRK e SLG PCP-A1 : Pollen Coat Protein. Interagisce con SLR e SLG SLR-BP1,2 : SLR-binding proteins Se avviene il riconoscimento tra le componenti polliniche e stigmatiche del sistema viene bloccata la secrezione di acqua dello stigma che permette la germinazione del polline Incompatibilità Solanacee Petunia, Lycopersicum, Nicotiana, Solanum Lycopersicum peruvianum Combinazione incompatibile Combinazione compatibile Tubetti pollinici che si allungano nello stilo, colorati con blu di anilina, che rivela, attraverso la fluorescenza agli UV, il callosio presente nelle pareti del tubetto Struttura genetica Incompatibilità Tubetto pollinico P1 Incrocio incompatibile Incrocio compatibile Tubetto pollinico P2 Rnasi S1 Rnasi S3 Inibitore dell’Rnasi Fattore P1 Fattore P2 Trasportatore di membrana Stilo S1S3 Stilo S1S3 Struttura genetica Incompatibilità L'autofertilità del pomodoro si è originata per mutazione di geni del pathway, selezionati durante la domesticazione Spesso l'autocompatibilità si trova nelle piante coltivate, mentre i progenitori selvatici sono autoincompatibili: Offre la sicurezza di produrre semi e frutti anche quando le condizioni ambientali sono sfavorevoli all'impollinazione e allegagione Struttura genetica Incompatibilità e miglioramento genetico In negativo: impedisce l’ottenimento di linee inbred ma in qualche caso può essere “aggirata” es. “bud pollination” in Brassica oleracea In positivo: Può essere sfruttata per fare incroci controllati (ma spesso non è “affidabile”) Struttura genetica Verifica sperimentale del sistema riproduttivo La conoscenza delle quote di incrocio e autofecondazione nelle condizioni in cui opera il breeder è molto importante struttura genetica popolazione metodi di miglioramento tipi di varietà ottenibili distanze di isolamento 1. Esame dei fiori e della biologia riproduttiva Dioicismo Fiori diclini Dicogamia Fiori visitati da insetti Polline portato dal vento Dimostrano o suggeriscono prevalente allogamia Cleistogamia : Dimostra l’autogamia La patata coltivata spesso non produce fiori... Struttura genetica 2. Determinazione delle percentuali di allo- e autogamia Isolamento di piante o infiorescenze singole Non si produce seme: Allogamia Si produce seme L’esame delle progenie può darci ulteriori informazioni: Depressione da inbreeding?? Si: preval. allogamia Struttura genetica No: preval. autogamia http://www.edor.se/photo-gallery.html Determinazione delle percentuali di allo- e autogamia mediante marcatori genetici Vengono coltivati pochi genotipi omozigoti per un gene marcatore recessivo (che, ad es. determina assenza di antociani, plantule verdi) randomizzati in mezzo a genotipi omozigoti dominanti (presenza di antociani, plantule violacee) Si raccoglie quindi il seme sulle piante omozigoti recessive La percentuale di plantule con antociani nelle loro progenie fornirà una stima della percentuale di incrocio 6% 8% 3% 9% plantule con antociani nelle progenie Allogamia media 6,5% Sono necessarie prove ripetute per più anni consecutivi e in più ambienti Marcatori per caratteri dei semi (cotiledoni o endosperma) sono molto utili perché non è necessario allevare le progenie, grazie alla xenia Tra i marcatori per caratteri delle piante sono più utili quelli che si manifestano allo stadio di plantula (come la presenza/assenza di antociani) perché danno la risposta molto più presto di quelli che si manifestano in piante adulte (colore fiori ecc.) I marcatori molecolari si utilizzano allo stesso modo, ma bisogna trovare un allele raro ! Struttura genetica Struttura genetica delle popolazioni di piante E’ determinata dal sistema riproduttivo e quindi è diversa per le specie a propagazione vegetativa, a riproduzione prevalentemente autogama e prevalentemente allogama 1. Specie a propagazione vegetativa Clone popolazione di individui ottenuti a partire da un singolo individuo mediante propagazione vegetativa. Come si genera nuova variabilità da sfruttare per il miglioramento genetico ? Incrocio -> Segregazione e ricombinazione Mutazione spontanea o indotta - Mutazioni gemmarie - Chimere - Colture in vitro e variazione somaclonale Le varietà coltivate sono cloni La selezione clonale ha il compito di mantenere il genotipo Struttura genetica 2. Specie a riproduzione prevalentemente autogama L'autofecondazione ripetuta porta all'omozigosi, quindi una popolazione di una specie strettamente autogama dovrebbe essere costituita da individui omozigoti a tutti i loci Quanti omozigoti diversi possono formarsi a partire da un idividuo eterozigote? Monoibrido Diibrido Aa AaBb AA aa AABB AAbb aaBB aabb Poliibrido (n loci) 2n possibili omozigoti La variabilità in una popolazione di specie autogama dovrebbe essere esclusivamente quella tra omozigoti diversi Un individuo estratto da una popolazione di specie autogama dovrebbe dare origine, per autofecondazione, ad una linea pura, in teoria ... Struttura genetica in pratica ... Allard e Golden ripeterono gli esperimenti di Johannsen con la varietà di fagiolo Red Kidney ed ebbero un effetto significativo della selezione entro linea pura Che cosa può determinare variazioni genetiche in una linea pura? 1. Mutazioni spontanee La loro frequenza in natura è compresa tra 10-5 e 10-6. Quelle che interessano geni che controllano caratteri quantitativi non hanno un effetto fenotipico evidente, ma accumulandosi in periodi di tempo sufficientemente lunghi, generano variabilità genetica entro linee pure, in modo tale che la selezione al loro interno può essere efficace 2. Incrocio naturale Nessuna specie è autogama al 100% ! Se la quota di autofecondazione è s e quella di incrocio generazioni la frequenza degli eterozigoti sarà pari a t = 1-s, dopo infinite 2pq[2t/(2-s)] Ad esempio con t=0,1 e p=q=0,5 la percentuale di eterozigoti si stabilizzerà al 9 % Struttura genetica Vantaggio degli eterozigoti Jain e Allard hanno determinato la fitness degli eterozigoti per alcuni geni qualitativi in confronto a quella degli omozigoti in una popolazione di orzo in cui la frequenza di incrocio naturale era pari al 2% Fitness Locus Omozigote dominante Eterozigote Omozigote recessivo B/b 1,06 1 1,31 S/s 0,81 1 0,96 G/g 1,04 1 0,82 E/e 0,47 1 0,59 B1/b1 0,61 1 0,54 R/r 0,82 1 0,68 Bt/bt 0,96 1 1,06 Sh/sh 0,71 1 0,63 La fitness alta degli eterozigoti incrementa la variabilità delle popolazioni autogame Struttura genetica Autogamia, adattamento, evoluzione Qualche considerazione L’autogamia favorisce, nelle specie annuali, la produzione di seme, anche in condizioni sfavorevoli alla impollinazione incrociata Es. Medicago annuali (come M. truncatula) sono autogame, mentre Medicago perenni sono allogame (come M. sativa) Molte specie coltivate autogame derivano da progenitori selvatici a riproduzione allogama (es. Solanum): la domesticazione ha favorito la facilià di produrre frutti e semi garantita dalla autofecondazione L’autogamia stretta potrebbe compromettere l’adattamento a lungo termine L’incrocio occasionale, il vantaggio degli eterozigoti e la mutazione garantiscono il mantenimento di variabilità genetica indispensabile alla sopravvivenza della specie Struttura genetica 3. Specie a riproduzione prevalentemente allogama Le popolazioni di queste specie sono comunità riproduttive di organismi sessuati a riproduzione incrociata che condividono un pool genico comune (Dobzhansky) Le frequenze dei geni e dei genotipi si modificano nel tempo secondo quanto voluto dalla fitness dei singoli individui della popolazione Tali popolazioni vengono considerate comunemente in equilibrio Hardy-Weinberg L'equilibrio HW sussiste nelle condizioni già note: - popolazione numerosa - assenza di mutazioni differenziali - assenza di migrazione - assenza di selezione - unioni casuali Costanza delle frequenze geniche E' raro che tutto questo si verifichi ! Inoltre, considerando l'insieme dei geni, l'equilibrio si raggiunge lentamente, specialmente per geni associati (v. squilibrio gametico e di linkage) La struttura genetica delle popolazioni di piante allogame è complessa Struttura genetica Natura della variabilità delle specie allogame 1. Variabilità tra popolazioni In ambienti diversi si differenziano gli ecotipi che si caratterizzano per le frequenze geniche e genotipiche Ecotipi Quando la variazione nello spazio delle frequenze geniche e genotipiche è graduale e non dà origine ad ecotipi nettamente distinguibili si parla di variazione clinale, dovuta a cambiamenti graduali dell’ambiente e al flusso genico tra le popolazioni Nota: Non confondiamo gli ecotipi con le varietà locali, o agroecotipi (in inglese land races) che si sono differenziati in coltivazione (ne tratterete più avanti) Ecotipo ed ecocline La distinzione dipende dalla densità geografica del campionamento che effettuiamo di una specie e dalla natura del territorio In ampi territori pianeggianti ….. I caratteri che si prestano di più a differenziare gli ecotipi sono quelli legati all'adattamento all'ambiente In territori accidentati ….. Entrata in riposo vegetativo in autunno Ripresa vegetativa in primavera L’epoca di fioritura e maturazione (precocità) La resistenza al freddo, al secco, all’umido... Struttura genetica 2. Variabilità entro popolazioni Tutte le piante sono diverse tra loro e altamente eterozigoti A livello fenotipico però la variabilità non è sempre elevatissima Infatti un fenotipo adattato può essere prodotto da combinazioni di geni diverse Ciò è dimostrato da ciò che avviene quando coltiviamo una popolazione di specie allogama in nuovo ambiente Omogeneità fenotipica nell'ambiente di adattamento Spostamento in un nuovo abiente Grande variabilità fenotipica iniziale Dopo alcune generazioni Riduzione della variabilità fenotipica: Ecotipizzazione Struttura genetica La storia dell'erba medica Grimm Fattoria di Wendelin Grimm, Carver County, Minnesota, USA Dalla Sassonia al Minnesota a Cipro alla Gran Bretagna La variabilità genetica di popolazioni allogame si può distinguere in libera, potenziale e criptica Variabilità libera: è quella che si manifesta a livello fenotipico; dipende dalle differenze tra omozigoti per alleli diversi Variabilità potenziale: è quella che non è manifesta a livello fenotipico ma è immagazzinata negli eterozigoti. Perché diventi libera sono necessarie segregazione e ricombinazione AA BB CC DD …. Aa Bb Cc Dd…. Variabilità criptica Il linkage in trans fa sì che la variabilità potenziale rimanga “nascosta” finchè non si siano verificati tutti crossing-over necessari alla sua trasformazione in variabilità potenziale, prima, e poi in variabilità libera Struttura genetica aa bb cc dd ….. A b C D e F G h I l x x x x x x a B c d E f g H i L A B C D E F G H I L a b c d e f g h i l A B C D E F G H I L a b c d e f g h i l A B C D E F G H I L a b c d e f g h i l Autogamia, allogamia ed evoluzione delle piante Piante Autogame Adattamento rapido all’ambiente nel breve periodo grazie alla fissazione dei tipi meglio adattati Ridotta capacità di adattamento nel lungo periodo Bassa flessibilità genetica Piante Allogame Adattamento rapido all’ambiente nel breve periodo può essere fornito dalla propagazione vegetativa Massima capacità di adattamento nel lungo periodo Alta flessibilità genetica I meccanismi che in natura favoriscono l’allogamia sono più diffusi e più sofisticati di quelli che favoriscono l’autogamia Si ritiene che le piante autogame si siano evolute in particolari condizioni da piante ancestrali allogame Nota: oggi sappiamo che l'adattamento può essere regolato anche da meccanismi epigenetici e questo ci fa riconsiderare le capacità adattative delle piante autogame nel breve periodo Struttura genetica Biologia riproduttiva, struttura genetica delle popolazioni e modelli varietali Lorenzetti et al. Uomini e semi. Patron, 2013 Continua Segue Il controllo dell'impollinazione nel miglioramento genetico Produzione di un ibrido di mais: emasculazione del portaseme Struttura genetica Il controllo dell'impollinazione - Nel miglioramento genetico gli individui selezionati devono essere quasi sempre incrociati tra loro per ottenere la popolazione migliorata - L'incrocio è il mezzo principale per creare nuove combinazioni di geni e di caratteri da cui selezionare quelle migliori - L'incrocio con uno stesso partner (tester) è un modo per confrontare il valore di diversi genotipi in selezione - L'autofecondazione controllata è necessaria per ottenere linee inbred Dobbiamo quindi escludere che avvengano autofecondazioni o incroci indesiderati: il polline è piccolo e vola! Da solo o trasportato dai pronubi 1. Autoimpollinazione controllata - Nelle allogame può essere sufficiente isolare singoli fiori/infiorescenze/ piante - A volte dobbiamo intervenire: fiori diclini (es. mais, cucurbitacee) o fiori che “scattano“ - Nelle autogame (se non sono cleistogame) è prudente comunque isolare le piante o i fiori Struttura genetica 2. Incrocio intraspecifico - E' necessario l'isolamento dei partner dagli altri individui - Spesso è necessaria l'emasculazione o castrazione manuale/meccanica/ chimica/genetica del genitore femminile (portaseme) - E' molto utile avere un marcatore genetico (dominante nell'impollinante o codominante) per distinguere le progenie da incrocio da quelle da autofecondazione X Es. Medicago sativa Fiore giallo x violetto“ = “variegato“ Struttura genetica Isolamento Strutture mobili per isolamento e impollinazione controllata http://www.edor.se/photo-gallery.html Incrocio intraspecifico Le tecniche per realizzare l'impollinazione controllata sono molto diverse a seconda della specie Manuale, portando le antere o il polline raccolto sui fiori del partner maschile sullo stigma del portaseme (di solito emasculato) Mediato da insetti pronubi allevati ad hoc o comprati dagli apicoltori In cipolla si usano api o mosche Impollinazione manuale in zucchino Video University of Wisconsin-Madison sul miglioramento genetico http://plantbreeding.wisc.edu/educators/videos/ Impollinazione Solanum parte I http://www.youtube.com/watch?v=SQddcAiGBhE&list=UUqyLv50NSDw9MHhtZ3OBrBw Solanum parte II http://www.youtube.com/watch?v=DXSPYFgJiRQ&list=UUqyLv50NSDw9MHhtZ3OBrBw Peperone http://www.youtube.com/watch?v=rM9porsseQo&list=UUqyLv50NSDw9MHhtZ3OBrBw Cucurbitacee http://www.youtube.com/watch?v=V5a-coN2Xgg&list=UUqyLv50NSDw9MHhtZ3OBrBw Maschiosterilità Mutazioni spontanee possono portare alla mancata formazione di polline funzionale Maschiosterilità citoplasmatica E' determinata da geni mitocondriali ed è quindi ad eredità materna (quasi sempre) Maschiosterilità genetica E' determinata da geni nucleari Struttura genetica Maschiosterilità Geneticocitoplasmatica E' una maschiosterilità citoplasmatica che può essere superata grazie a geni nucleari “restorer“ Struttura genetica 3. Incrocio interspecifico E' importantissimo per utilizzare la diversità genetica presente nelle specie affini In pomodoro, patata e altre specie geni di resistenza alle avversità si trovano molto spesso in specie selvatiche e non nel germoplasma coltivato, ad esempio: Solanum pureja Solanum pimpinellifolium Lycopersicum peruvianum Struttura genetica Per far riuscire un incrocio interspecifico si possono usare trucchi come: - utilizzare genotipi “adatti“ - utilizzare una specie “ponte“ - raddoppiare icromosomi (es. in patata, 2n=4x=48) - utilizzare genotipi autoincompatibili o maschiosterili come portaseme - Rimozione dello stigma - Mentor pollen Sterilità dell'ibrido Per definizione gli incroci interspecifici, quando riescono, danno progenie sterili a causa di barriere pre- o post-zigotiche alla fertilità Una fertilità anche bassissima dell'ibrido può permettere di fare il reincrocio con la specie coltivata Se la specie è propagata vegetativamente l'ibrido può essere coltivato La sterilità dell'ibrido spesso può essere superata mediante raddoppiamento cromosomico Struttura genetica Sommario La biologia della riproduzione è un vincolo per il breeder e determina i tipi di varietà che possono essere costituiti L'autoincompatibilità, in particolare, è spesso un ostacolo per l'ottenimento di varietà omogenee Le percentuali di auto e allogamia devono essere note per le specie, i genotipi e gli ambienti in cui si opera Le strutture genetiche delle popolazioni autogame e allogame sono molto diverse: le prime sono composte da genotipi ad alto grado di omozigosi, le seconde da genotipi eterozigoti tutti diversi tra loro Il controllo accurato dell'impollinazione è un requisito di ogni programma di miglioramento genetico L'incrocio interspecifico è una risorsa essenziale per attingere alla biodiversità naturale Struttura genetica
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