UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI BARI DIPARTIMENTO DI FARMACIA-SCIENZE DEL FARMACO 1st Research Day Towards high-affinity ligands for CLC-K channel: optimal pharmacophoric requirements of new ligands bearing 2benzofuran carboxylic acid scaffold RELATORE: Giuseppe FRACCHIOLLA Canali al cloro Sono proteine implicate in diversi processi fisiologici tra cui i meccanismi di eccitabilità delle cellule nervose e muscolari e la regolazione della diuresi e dell’omeostasi idrico-salina Recettori postsinaptici inibitori attivati da GABA e glicina Regolatori della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica Famiglia dei CLC CLC-1 CLC-2 CLC-Ka CLC-Kb CLC-3 CLC-4 CLC-5 CLC-6 CLC-7 CLC-K sono espressi nel rene dove esplicano un ruolo importante nel trasporto transepiteliale di sali. CLC-Ka è il maggior canale che media il trasporto di cloro transepiteliale nel tratto ascendente sottile dell’ansa di Henle. CLC-Kb è un canale basolaterale presente nel TAL, nel DCT, nel CNT e nelle cellule intercalate del dotto collettore. Mutazioni a carico di questo gene causa la sindrome di Bartter di tipo III patologia caratterizzata da una eccessiva perdita di sali. Presupposti della ricerca L’importanza del ruolo dei CLC-K umani nel riassorbimento renale di sali ha fatto crescere l’interesse verso la scoperta di ligandi utili come tools farmacologici per lo studio delle correnti regolate da questi canali e potenzialmente impiegabili per la terapia di alcune sindromi collegate a questi canali e per il trattamento dell’ipertensione. ATTIVATORI CLC-Kb SINDROME DI BARTTER CLC-Ka REGOLAZIONE DEL RIASSORBIMENTO DI ACQUA CLC-Kb NUOVA CLASSE DI DIURETICI INIBITORI BLOCCANTI Presupposti della ricerca Non sono noti attivatori o inibitori endogeni per i canali CLC-K per cui la ricerca allo stato attuale è orientata verso lo studio delle relazioni strutturaattività di alcuni ligandi attivi riportati in letteratura e da noi sintetizzati BLOCCANTE PIU’ POTENTE DEI CLC-K Cl CF3 NH O COOH COOH FFA BLOCCANTI DEI CLC-K (CLC-Ka >> CLC-Kb) CF3 N NH COOH GF47 NFA ATTIVATORE CLC-Ka A. PINELLI, C. GODIO, A. LAGHEZZA, N. MITRO, G. FRACCHIOLLA, V. TORTORELLA, A. LAVECCHIA, E. NOVELLINO, J.-C. FRUCHART, B. STAELS, M. CRESTANI, F. LOIODICE (2005). Synthesis, Biological Evaluation, and Molecular Modeling Investigation of New Chiral Fibrates with PPARalpha and PPARgamma Agonist Activity. J. MED. CHEM., 48, 5509-5519. A. LIANTONIO, A. PICOLLO, E. BABINI, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, F. LOIODICE, V. TORTORELLA, M. PUSCH, AND D. CONTE CAMERINO (2006). Activation and Inhibition of Kidney CLC-K Chloride Channels by Fenamates. MOL. PHARM., 69, 165-173. Presupposti della ricerca Non sono noti attivatori o inibitori endogeni per i canali CLC-K per cui la ricerca allo stato attuale è orientata verso lo studio delle relazioni strutturaattività di alcuni ligandi attivi riportati in letteratura e da noi sintetizzati Bloccanti Attivatore L’EFFETTO FINALE DI ATTIVAZIONE O DI BLOCCO DEL CANALE E’ STRETTAMENTE CORRELATO ALLA GEOMETRIA ASSUNTA DA QUESTE MOLECOLE A. LIANTONIO, A. PICOLLO, E. BABINI, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, F. LOIODICE, V. TORTORELLA, M. PUSCH, AND D. CONTE CAMERINO (2006). Activation and Inhibition of Kidney CLC-K Chloride Channels by Fenamates. MOL. PHARM., 69, 165-173. Presupposti della ricerca A. LIANTONIO, A. PICOLLO, E. BABINI, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, F. LOIODICE, V. TORTORELLA, M. PUSCH, AND D. CONTE CAMERINO (2006). Activation and Inhibition of Kidney CLC-K Chloride Channels by Fenamates. MOL. PHARM., 69, 165-173. Presupposti della ricerca Ricerca di nuovi ligandi più selettivi e più potenti dei CLC-Ka/Kb umani O COOH Cl GF47 (1) O COOH Cl GF167 (2) G. FRACCHIOLLA, A. LAGHEZZA, L. PIEMONTESE, G. CARBONARA, A. LAVECCHIA, P. TORTORELLA, M. CRESTANI, E. NOVELLINO, F. LOIODICE (2007). Synthesis, Biological Evaluation, and Molecular Modeling Investigation of Chiral Phenoxyacetic Acid Analogues with PPARalpha and PPARgamma Agonist Activity. CHEMMEDCHEM, 14;2(5), 641-654, 1860-7179. Studi SAR ♦ Definire i requisiti essenziali per l’attività biologica ♦ Migliorare la potenza bloccante e/o l’affinità verso le due isoforme H N S COOH Cl COOH Cl O COOH O COOH 3 Cl 1 4 5 O COOH Br O COOH O 6 Cl COOH 9 Cl O COOH O COOH Cl 2 H3 C CH3 10 7 O O O COOH COOH COOH Cl Cl Cl 8 12 11 A. LIANTONIO, A. PICOLLO, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, P. TORTORELLA, F. LOIODICE, A. LAGHEZZA, E. BABINI, G. ZIFARELLI, M. PUSCH, AND D. CONTE CAMERINO. Molecular switch for CLC-K Cl channel block/activation: Optimal pharmacophoric requirements towards high-affinity ligands. PNAS, 2008, 105, 4, 1369-1373. Saggi biologici O 100 COOH CLC-Ka > 200 O COOH 90 Cl Cl 1 80 9 O O 70 COOH COOH Cl Cl Kd mM 60 2 H N COOH 10 50 O COOH Cl 40 Cl Cl 30 3 11 20 O COOH S COOH 10 Cl Cl 4 0 1 2 3 O 4 5 6 O COOH 5 8 O COOH Br 7 6 10 11 12 12 O COOH H3C 9 7 COOH 8 I test farmacologici sono stati eseguiti su CLC-Ka e CLC-Kb espressi in oociti di xenopus laevis attraverso la tecnica del voltage-clamp A. LIANTONIO, A. PICOLLO, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, P. TORTORELLA, F. LOIODICE, A. LAGHEZZA, E. BABINI, G. ZIFARELLI, M. PUSCH, AND D. CONTE CAMERINO. Molecular switch for CLC-K Cl channel block/activation: Optimal pharmacophoric requirements towards high-affinity ligands. PNAS, 2008, 105, 4, 1369-1373. Saggi biologici 100 CLC-Ka > 300 90 CLC-Kb 80 70 Kd mM 60 50 40 30 20 10 0 1 O 2 8 O COOH O COOH O COOH COOH Cl Cl 1 12 O COOH Cl Cl 11 2 8 Cl 11 12 I test farmacologici sono stati eseguiti su CLC-Ka e CLC-Kb espressi in oociti di xenopus laevis attraverso la tecnica del voltage-clamp A. LIANTONIO, A. PICOLLO, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, P. TORTORELLA, F. LOIODICE, A. LAGHEZZA, E. BABINI, G. ZIFARELLI, M. PUSCH, AND D. CONTE CAMERINO. Molecular switch for CLC-K Cl channel block/activation: Optimal pharmacophoric requirements towards high-affinity ligands. PNAS, 2008, 105, 4, 1369-1373. Modello farmacoforico In base ai requisiti strutturali delle diverse classi di composti finora sintetizzati e alle relazioni struttura-attività emerse è stato definito un modello di farmacoforo per bloccanti e attivanti di questi canali • GRUPPO CARBOSSILICO • DUE ANELLI AROMATICI IDROFOBICI Angolo diedro TRA I DUE ANELLI AROMATICI 0-8° ATTIVANTI 20-80° BLOCCANTI I REQUISITI INDIVIDUATI PER IL FARMACOFORO SONO STATI VALIDATI EFFETTUANDO UN QUERY 3D NEL CCDS A. LIANTONIO, A. PICOLLO, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, P. TORTORELLA, F. LOIODICE, A. LAGHEZZA, E. BABINI, G. ZIFARELLI, M. PUSCH, AND D. CONTE CAMERINO. Molecular switch for CLC-K Cl channel block/activation: Optimal pharmacophoric requirements towards high-affinity ligands. PNAS, 2008, 105, 4, 1369-1373. Finalità della ricerca Modificazioni dell'anello furanico N O COOH COOH COOH * * acidi 3H-indol-2-carbossilici acidi 1H-inden-2-carbossilici Modificazione -COOH -SO3H, -PO3H2, -tetrazolo Modificazioni del gruppo idrofobico 5-R Riduzione del doppio legame anelli isosteri - 2 (20) e 3-furil (21) - 3 e 4-piridinil - 2 (22) e 3-tienil 7 6 O 1 5 R anelli aromatici sotituiti - p-metossi-fenil (17) - p-cloro-fenil (18) - p-fenil-fenil (19) acidi 4H-cromen-2-carbossilici 4 2 COOH O 3 R1 * * COOH acidi 2,3-diidro-1-benzofuran2-carbossilici gruppi alchilarilici - benzil (15) - feniletil (16) 3-phenyl-1-benzofuran2-carboxylic acid Modificazioni del gruppo idrofobico R1 - o-metossi o-nitro o-tert-butile o-Cl Modificazioni del 3-fenil anelli isosteri - 2 e 4-piridinil - 2 e 3-furil - 2 e 3-tienil gruppi alchilarilici - benzil - feniletil Schema di sintesi OH X1 O O + X2 O O O a COOEt O Br X1 X2 X1; X2 = H, Cl, Br b,c O COOH R X2 1-22 a) K2CO3, acetone anidro, riflusso b) RB(OH)2, Cs2CO3, Tetrakis Pd(0), toluene anidro, mw; Resa: 72-80%; 20-30 min ; c) NaOH 1N, THF 1:1. t.a./HCl L. PIEMONTESE, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, A. LAGHEZZA, P. TORTORELLA, AND F. LOIODICE. Convenient Synthesis of Some 3Phenyl-1-benzofuran-2-carboxylic Acid Derivatives as New Potential Inhibitors of CLC-Kb Channels. HETEROCYCLES, 2010, 81 (12), 2865-2872. Lavori in corso… DERIVATI SINTETICI O R O COOH COOH X Lead compound R = H, CH3, CH3O, CF3O X = H, Cl O O Gruppo Acido R HOOC O spacer COOH X Gruppo Acido: SO3H, PO3H2, CONHSO2R, tetrazolo R; X = sostituenti vari Ligandi doppi NUOVI LIGANDI DISPONIBILI IN COMMERCIO Valutazione dell’attività biologica di farmaci noti e di nuovi ligandi commercialmente disponibili, derivati dall’esplorazione di differenti banche dati utilizzando come query 3D il nuovo modello farmacoforico da noi messo a punto RINGRAZIAMENTI DIPARTIMENTO DI FARMACIA – SCIENZE DEL FARMACO Giuseppe Carbonara Diana Conte-Camerino Antonio Carrieri Paola Imbrici Carlo Franchini Antonella Liantonio Donato Giannico Antonio Laghezza Fulvio Loiodice Luca Piemontese Angela Sanrocco Savino Sfregola Sabina Sblano Paolo Tortorella Istituto di Biofisica, CNR, Genova Michael Pusch e collaboratori
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