質量分析によるタンパク質解析のための新規ゲル内酵素消化法愛媛大学プロテオサイエンスセンタープロテオミクス研究部門講師武森信暁 1 質量分析計の臨床診断への応用 2014年 2014年7月に米国FDA 米国FDAの FDAの Medical Device(Class 1) として認可、登録 2 タンパク質定量イムノアッセイから質量分析へターゲットプロテオミクス SRM/MRM質量分析法を用いた標的タンパク質の高感度定量解析。抗体を用いることなくあらゆるタンパク質の定量が可能に。（Nature Method誌のMethod of the Yearに選出） Nature Methods Vol. 10, P19–22 (2013) 3 質量分析によるヒトプロテオーム解析ヒトプロテオーム（体内に発現するすべてのタンパク質）の解析が昨年終了 4 プロテオーム解析用試料の前処理 • 質量分析の前処理として、タンパク質試料を基質選択制の高いプロテアーゼ（トリプシンなど）を用いてあらかじめ消化する必要がある抽出タンパク質試料プロテアーゼ消化消化ペプチドのＬＣ分離 MS/MS 解析＆データベース検索解析の再現性や同定タンパク質数に影響 5 従来技術（試料前処理）とその問題点 • 溶液内消化法：界面活性剤の使用が困難で溶液内消化法：あり、難溶性タンパク質の解析に向かない • ゲル内消化法：界面活性剤を含む難溶性タンゲル内消化法：パク質試料の解析にも適応可能であるが、消化ペプチドの回収率が低い消化法溶液内消化（尿素法）ゲル内消化（Tube-gel法*）界面活性剤の使用難溶性タンパク質の消化消化ペプチド回収率 × △ ◎ ◎ ◎ △ * Lu X, Zhu H. Mol Cell Proteomics. 2005, vol.4, p1948-58 6 新技術の特徴・従来技術との比較ゲルマトリックスからのペプチド回収率を改善するために、還元処理により可溶化するBACアクリルアミドゲルを使用した新しいゲル内消化法（ＢＡＣゲル消化法）を開発消化ペプチドの低回収率が問題 O O N,N'-methylene-bis-acrylamide (Bis) N H N H O O N,N'-Cystamine-bis-acrylamide (BAC) S N H S N H HS S-S 還元処理 HS SH 7 BACアクリルアミドゲルの可溶化プレステインタンパク質試料を含む BACアクリルアミドゲル BACアクリルアミドゲル 1min後 3min後 5min後 TCEP 添加 Acetonitrile 添加後に遠心 8 消化プロトコル抽出タンパク質試料（ in 4% SDS溶液） SDS溶液）従来法 mix 還元アルキル化 mix BIS/アクリルアミド溶液 BIS/アクリルアミド溶液ＢＡＣゲル法 BAC/アクリルアミド溶液 BAC/アクリルアミド溶液ポリアクリルアミドゲルの形成ゲル洗浄によるSDS ゲル洗浄によるSDS除去 SDS除去トリプシン/Lys トリプシン/Lys/Lys-Cを用いたゲル内消化消化ペプチドの抽出 ① TCEP処理（ゲルの可溶化） TCEP処理（ゲルの可溶化）消化ペプチドの抽出 ② ACN添加・遠心処理 ACN添加・遠心処理消化ペプチドの抽出 ③ 回収したペプチド溶液の遠心濃縮 STAGE TIPによる消化ペプチドの精製 TIPによる消化ペプチドの精製 LCLC-MS/MS解析 MS/MS解析 LCLC-MS/MS解析 MS/MS解析 9 従来法との比較① 抽出タンパク質試料 5 μg （ Drosophila頭部から 4% SDS溶液により抽出） BAC/アクリルアミド溶液 BAC/アクリルアミド溶液 mix mix BIS/アクリルアミド溶液 BIS/アクリルアミド溶液トリプシン/Lys トリプシン/Lys/Lys-Cを用いたゲル内消化 TCEP処理（ TCEP処理（5 処理（5 min） min） ACN添加・遠心処理（ ACN添加・遠心処理（5 添加・遠心処理（5 min） min）消化ペプチドの抽出 (10 min) ×3 回収ペプチド溶液の遠心濃縮・精製 QTrap5500による LC-MS/MS解析 QTrap5500による LC-MS/MS解析 10 従来法との比較② 8M尿素で溶解したタンパク質試料 5 μg Lys-Cによる溶液内消化（4h） 50mM NH4HCO3溶液で4倍希釈トリプシンによる溶液内消化（12h） QTrap5500による LC-MS/MS解析 11 同定ペプチドの本数消化ペプチドのアミノ酸数の比較 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 BAC BIS 38 37 34 32 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 アミノ酸数同定ペプチドの本数 250 200 BAC 150 Urea 100 50 0 39 38 37 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 アミノ酸数 12 同定タンパク質の機能別分類 25 同定タンパク質数 Urea BAC 20 15 10 5 0 13 ペプチド配列占有率の比較 14 定量の再現性 15 ゲル内環境でのタンパク質保存乾燥ＢＡＣゲル内における脱水タンパク質試料は室温で安定しており、還元処理によるゲルの可溶化により試料の損失なく回収が可能 16 想定される用途 • 質量分析によるプロテオミクス（ボトムアップ・ミドルダウン解析、SRM/ＭＲＭによるターゲット解析）用試料調製 • 複数回膜貫通型タンパク質（GPCR等）を標的とする定量質量分析用の試料調製 • 異なる施設間における各種タンパク質試料および臨床検体試料の常温保存・輸送 17 実用化に向けた課題 • 長期（1か月～1年）室温保存条件の最適化 • アクリルアミド以外のゲルマトリックスの検討 • 臨床現場での使用に向けた簡易プロトコルの開発（キット化の必要有） 18 企業への期待 • 前処理工程のオートメーション化およびキット化に関して、企業との共同開発を希望 • また、質量分析による臨床試料からの標的タンパク質解析（ターゲットプロテオミクス）、比較プロテオーム解析によるバイオマーカー探索（特に膜タンパク質など）に関心のある企業には、本技術の導入が有効 19 本技術に関する知的財産権 • 発明の名称：タンパク質の保存および輸送法 • 出願番号：特願2014-58219 • 出願人：愛媛大学 • 発明者：武森信暁、武森文子 20 お問い合わせ先（必須）四国ＴＬＯ（株式会社テクノネットワーク四国）技術移転部安田崇〒760-0033 香川県高松市丸の内２番５号 TEL : 087-811-5039（代表） FAX : 087-811-5040 e-mail : [email protected] URL : http://www.s-tlo.co.jp 21