2014, 9, 16 JST新技術説明会 Water-in-Oil分散液を用いた静置培養法による中空球状バクテリアセルロースゲルの調製日本大学理工学部物質応用化学科助教星徹 1 本技術に関する知的財産権 • • • • • 発明の名称出願番号公開番号出願人発明者 : : : : : バクテリアセルロースの製造方法２０１３－２２２９８３２０１４－１２１３１４日本大学星徹，柿沼祐香，澤口孝志，矢野彰一郎中空球状バクテリアセルロースゲル (報告例なし) 2 バクテリアセルロース（BC）とは？酢酸菌の代謝によって生産されるセルロース好気性細菌の酢酸菌の代謝によって，グルコースからセルロースを生成植物由来よりも細い，セルロースフィブリルが緻密に絡み合うネットワーク構造を形成 99%は水分のヒドロゲルとして得られる植物性セルロースと比べ，ほぼ純粋なセルロースから成る細胞膜 UDPGlucose UDP 細胞質セルロース合成酵素フィブリル Bacterial Cellulose 外膜 BC hydrogel (ナタデココとして有名) 3 バクテリアセルロースの調製方法植菌後，容器に展開し静置培養することで BCゲルが得られる 4 バクテリアセルロースの特徴その1 培養日数培養日数の増加とともに膜厚の増加容器形状によって，様々な形になる容器形状でBCゲルの形が決定 5 バクテリアセルロースの特徴その2 培養日数空気密な網目構造新しい古い疎な網目構造・セルロースは，培養液－空気界面で生成・厚さ方向に積層構造を形成・酢酸菌は培養時間とともに増殖するので，生成するセルロース量が増加培養日数とともに緻密な網目構造を形成 6 バクテリアセルロースの特徴その3 BC hydogel 超臨界乾燥後のBCエアロゲルのSEM画像植物由来よりも細い直径10 ～ 100nm程度のセルロースフィブリルが緻密に絡み合うネットワーク構造を形成 99%は水分のヒドロゲルとして得られる優れた保水性 7 従来技術とその問題点 • ＢＣゲルの形状は，培養容器に依存形状の自由度が低い • 酢酸菌の増殖による緻密な網目構造の形成物性の再現性に乏しい • 高度に発達した網目構造薄膜作成など，切削加工が困難 • 不溶，不融一般的な成型法が適用不可 BCの高度利用には，ゲルの形状制御が必要 8 新技術の特徴・従来技術との比較 • 通常，ＢＣゲルは培養液－空気界面で産出されるため，ＢＣゲルの形状は容器形状に依存する． • ＢＣゲルの形状制御が報告されている． • 攪拌培養のよる球状ＢＣゲル (p.9) • 高酸素透過性チューブ内での静置培養によるチューブ状ＢＣゲル (p.10) • 本技術では，オイル(疎水性液体)中に培養液を滴下し，浮遊した球状培養液中で酢酸菌を培養することで，中空球状ＢＣゲルを得ることができる． 9 BCゲルの形状制御の例－1 球状BCゲル：食品，保水材料，細胞培養への応用攪拌培養 5 mm ・培養液を攪拌しながら培養することで，球状ＢＣゲルが得られる・攪拌速度，せん断応力により，粒径を制御できる・粒径が小さくなると，形状，サイズが不均一になる Y.Hu et al., Biomacromolecules, 11, 1727-1734 (2010), W. Czaja et al., Cllulose, 11, 403-411 (2004) 10 BCゲルの形状制御の例－2 チューブ状BCゲル：人口血管への応用酸素透過性に優れたシリコーンチューブ内に培養液を入れ，高濃度酸素雰囲気下で静置 1. Silicone tube 2. BC gel 3. Culture medium 4. Plug シリコーンと培養液界面でセルロースが生成 A.Putra et al., Polymer, 49, 1885-1891 (2008) A. Bodin et al., Biotech. Bioeng., 97, 425-434 (2007) 11 新技術の特徴本発明の特徴：中空球状BCゲル (報告例なし) ポイント：疎水性－培養液界面でのBCゲルの生成油との界面で生成 PPとの界面で生成 PP－培養液界面で非常に薄いBCゲルが生成培養液と接触する物質によりセルロース生成量が異なる 12 ・疎水性溶媒に培養液を滴下形状制御 (球状) ・疎水性－培養液界面でのBC生成中空体の調製 13 中空球状BCゲルの確認培養液 (比重1.02) 4 mm 培養液滴下量： 50 μL 2.5 mm 培養液滴下量： 20 μL BCゲルのサイズは培養液の滴下量により制御可能中空体を形成培養液－オイル界面でセルロースが生成するため，中空体を形成１ ∼ 8mmの中空球状BCゲルを得ることに成功 14 テフロンシャーレ上での静置培養お椀型BCゲルテフロンシャーレとの接触面にセルロースが生成しない比重の異なる2種類のシリコーンオイル*中での培養培養液と接する疎水場の特性比重小比重大接触の仕方 *相溶しない組み合わせ比重小様々な形状のBCゲルの作成への応用を検討中 15 超臨界乾燥後の中空球状BCゲルのIR測定 1163 cm-1 897 cm-1 1429 cm-1 1500 900 1300 1100 Wave number (cm-1) セルロースI型の特異な吸収* 1429 cm-1 : CH2 Bending 1163 cm-1 : C-O-C Stretching 897 cm-1 : β-Glucosidic linkage オイル－培養液界面で，通常の培養法(空気－培養液界面) と同様のセルロースI型の生成を確認 *Y.Yue et al., BioResources, 8, 6460-6471 (2013) 16 超臨界乾燥後の中空球状BCゲルのSEM観察空気－培養液界面と同様に，厚さ方向 (液滴の中心方向)に積層構造を形成積層面方向は，セルロースミクロフィブリルによる網目構造を形成 17 中空球状BCゲルのまとめ中空球状BCゲルのサイズは培養液の滴下量により制御可能１ ∼ 8mmの中空球状BCゲルが得られる天然セルロースと同じセルロースI型結晶を有するセルロースミクロフィブリルによる網目構造を形成大きい分子細胞小さい分子セルロース分子ふるい能を発現 18 想定される用途 • 材料：機能性フィラー，触媒担体 • 食品：嚥下困難な高齢者向け介護職素材，新触感デザート • 医薬：内服薬のコーティング剤，新規ＤＤＳ素材 BCゲル表面での骨芽細胞の培養の報告アリ* • 医療：中空内部での細胞培養，セルデリバリー，埋め込み医療機器の表面修飾 *Y. Hu et al., Biomacromolecules, 14, 3444-3452 (2013) 19 実用化に向けた課題 • 大量生産に向けた培養液の分散性の向上 • 粒径制御(特に1mm以下) • ゲル状培養液の利用 • 界面活性剤の利用 • 膜厚(強度)制御現状エアレーション • 培養時間との関係 • エアレーションの利用培養液滴に酸素を供給セルロース産生の促進 20 企業への期待 BCゲルの形状を制御することに成功したが，大量合成法の確立や用途開発まで至っていない．企業の皆様には，下記について，ご協力をお願いします． • W/O型分散液の技術を有する企業との共同研究を希望大量合成法の確立 • ニーズの提供ニーズに応じた中空球状BCゲルの作成 21 お問い合わせ先日本大学本部研究推進部知財課日本大学産官学連携知財センター（NUBIC）コーディネーター小野洋一ＴＥＬ０３－５２７５－８１３９ＦＡＸ０３－５２７５－８３２８ e-mail ono.youichi＠nihon-u.ac.jp 22