転写因子の核局在機構 酸化ストレスによるyAP-1の 核外輸送阻害 久下周佐 蛋白質合成の場と遺伝子発現(転写)の場を隔てる核膜には核膜孔があり,細 胞質一核間 Database Center for Life Science Online Service を通過する蛋白質やRNAの 移動を監視する。細胞質に局在する転写因子の場合も,活 性化 シグナルを受けて細胞質から核へと場を変えることにより,複 数のターゲット遺伝子の発 現調節を行なっている。これらは核内輸送の許可が調節ステップとなっていることが明ら かとなってきたが,yAP-1(yeastAP-1)転 写因子の場合は核外輸送のON/OFFに より調 節されていることが判明した。yAP-1は 定常的に核内輸送および核外輸送されており,両 方向のバランスがその転写活性に重要である。酸化ストレスはyAP-1の 核外輸送を特異的 に阻害し,結 果的にyAP-1は 核に局在し,夕ーゲット遺伝子の転写を誘導することが明ら かとなった。 【核 外 輸 送 】 【転 写 因 子 】 【 局 在 調 節 】 【yAP-1】 【酸 化 ス トレ ス 応 答 】 は じめ に 細 胞 が 増 殖 刺 激,ス を受 容 ・感 知 して,そ トレ ス な どの シ グ ナ ル の シ グ ナ ル を転 写 因 子 の 活 性 化 に 導 き核 ま で到 達 さ せ る 。 そ の 結 果,一 連 の特 異 的 な に伴 う 質 的 な 変 化 の 側 面 か ら分 類 して み る と,① 転 写 因 子 その もの の ダ イナ ミ ック な局 在 変 化 を伴 う場 合,す な わ ち細 胞 質 に局 在 す る転 写 因 子 が,シ グナル を受 け 遺 伝 子 群 の 発 現 誘 導 に よ り,そ れ ら の 刺 激 や ス ト レ ス 取 っ て 核 に局 在 し う る 形 に 変 化 す る場 合,そ に対 応 し細 胞 の 向 か う方 向 性 を決 定 す る。 で は ど の よ 転 写 因 子 は常 に 核 内 に 存 在 し,そ う に シ グ ナ ル が 転 写 因 子 に 到 達 し,必 要 な と き に必 要 胞 質 か ら核 に 到 達 す る場 合,が な だ け特 異 的 遺 伝 子 群 の 発 現 誘 導 が 起 こ る の か?こ 場 合 も,細 胞 質 一核 間 の 蛋 白 質 の 輸 送 調 節 が細 胞 機 能 発 の 疑 問 に 答 え る べ く十 数 年 来,数 現 に とっ て 重 要 な ス テ ッ プ と な っ て い る。 多 くの 研 究 グ ル ー プ に よ る精 力 的 な研 究 が な され た 結 果,受 容 体,細 胞内 して,② の エ フェ クターが細 あ げ られ る 。 い ず れ の 細 胞 質 一核 間 の トラ フ ィ ック に関 して は こ こ数 年 で 多 シ グ ナ ル 伝 達 系 を は じ め,転 写 因 子 の活 性 化 と基 本 転 くの 役 者 が 明 らか に さ れ て き た 。 詳 細 に 関 し て は ご く 写 因 子 群 との 相 互 作 用 や,ク 最 近 の 総 説1∼4)があ る の で 参 照 して い た だ く として,本 ロ マ チ ン の 構 造 変 化 と転 写 調 節 な ど に関 す る 多 くの 知 見 が 明 ら か に され た 。 細 稿 で は概 念 的 に 示 す(図1)。 核 で機 能 す る 蛋 白質 は細 胞 外 の シ グ ナ ル が細 胞 質 を 介 して どの よ う な メ カ ニ ズ 胞 質 で 合 成 さ れ た の ち,核 膜 上 に 存 在 す る核 膜 孔 ム で 最 終 的 に核 内 に到 達 す る か を,転 写 因 子 の 活 性 化 (nuclear pore)と Shusuke Kuge,東 stitute o fMedical 京 大 学 医 科 学 研 究 所 ウ イ ル ス 研 究 部(〒108-8639東 Science,The University 京 都 港 区 白 金 台4-6-1 )[Department of Tokyo,Shirokanedai,Minato-ku,Tokyo u-tokyo.ac.jp RegulatedNuclearLocalizationofTranscriptionFactors:NuclearExportofyAP…1isSensitivetoOxidativeStress 668 よ ば れ る 通 り道 を 通 っ て核 内 輸 送 さ 108-8639,Japan] of Microbiology,InE-mail:skuge@ims. 39 転写因子の核局在機構 RNAの 核 外 輸 送 に 関 与 して い る と 考 え ら れ て い る が, mRNAの 核 外 輸 送 に関 して は 出 芽 酵 母 で はCrm1の 肯 定 的 で,脊 関与 が 椎動物 細胞 の場 合 は議 論 の 分 か れ る と こ ろで あ る。 積 み 荷 が 受 容 体 か ら離 れ る ス テ ップで働 くのがRanGTP/ RanGDPで あ る。RanGTP は 核 内 でimportinに 結 合 し, 核 内輸 送 シグナル を もった積 Database Center for Life Science Online Service み 荷 か らimportinを 図1 核 内 輸 送 と核 外 輸 送 こ こ で は核 内 輸 送 受 容 体,importinを 単 量体 分 子 と して示 して い る が,高 プ タ ー分 子importin α を 介 して 積 み 荷 の 核 内輸 送 シ グナ ル(こ る場 合 が 多 い。 一 方,積 み荷 の核 外 輸 送 シ グナ ル(こ こ で はNESと exportinに よ って 認 識 され 核 外 輸 送 され る 。NESとexportinと 要 で あ り,細 胞 質 に お ける この 複 合 体 の 解 離 にはRanGDPが RanGDPが,解 離 に はRanGTPが 等真核細胞ではアダ こ で はNLSと 示 す)は 示 す)を を も っ た 積 み 荷 のCrm1へ 認識す 核 外 輸 送 受 容 体, の結 合 にはRanGTPの 結 合 はRanGTPの 結合が必 働 く。importinとNLSの 結合には に てRanGDPに る(図1)。 れ る 。 またRNAや あ る種 の 蛋 白質 は,や は り核 膜 孔 を らの 輸 送 は,(a)往 来 す る 分 子(積 結 合 に よ り開 始 され,(b)ひ (c)積 み 荷)と 受容体 の き続 く核 膜 孔 の 通 過 後 に, activating 質(RanBP1,RanBP2)の 輸 送 にかか わ る受 容 体 は核 内 輸 送 に働 くimportinと, 分 類 され る。 また 積 み荷 に よ り解 離 され 細 胞 質 で はRan- protein)とRan結 活 性 が 導 き 出 さ れ てRanGTPが 合蛋 白 変 換 さ れ,RanGDPの 濃 度 が 高 く 維 持 さ れ て い る と 考 え ら れ て い る が,核 (regulator exchanging of chromosome よ りRanGTPの factor)で 内で あ るRCC1 condensation)の 働 きに 濃 度 が 高 い と考 え ら れ て い る 。 し た が は そ の輸 送 の 方 向性 を決 め る シグ ナル として,importin っ てRanサ に認 識 され る核 内 輸 送 シ グ ナ ル やexportinに て い る とい え る。 認 識 され 結合が必 存 在 に よ りRanのGTPase はRan-GEF(GTP み荷 と受 容 体 の 解 離 が 起 こ り完 結 す る 。 核 外 輸 送 に働 くexportinに GAP(GTPase の 要 で あ り,こ の 場 合 は 細 胞 質 必 要 で あ る。 通 っ て細 胞 質 に核 外 輸 送 され 細 胞 質 で 機 能 す る 。 これ 解 離 させ る 働 きが あ るが,反 対 にNES イ ク ル は 細 胞 質 一核 間 輸 送 の 方 向 性 を規 定 し る核 外 輸 送 シ グ ナ ル が 存 在 す る。 典 型 的 な 核 内 輸 送 シ グ ナ ル はSV40(simian virus 40)T抗 プ ラ ス ミン に 存 在 す るNLS(nuclear nal)で,こ 原,ヌ ク レオ Ⅰ.細胞質一 核間輸送による転写 因子の活性制御(図2) localization sig- れ らは ア ダ プ タ ー 分 子 で あ るimportin α に よ っ て 認 識 されimportin α とimportinβ とのヘ テ ロ 2量 体 蛋 白 質 に よ り核 内 輸 送 され る(単 量 体 のimportin 細 胞 質 に局 在 す る転 写 因 子 が ど の よ う に核 内 に そ の 局 在 を移 す の か?そ の 戦 略 は い くつ か に分 類 され る こ とが わ か っ て き た 。 に よ り運 ば れ る分 子 も出 芽 酵 母 の 系 で は多 く示 され て い る)。 一 方,典 型 的 な核 外 輸 送 シ グ ナ ル は,ロ イ シ ン な ど疎 水 性 ア ミノ 酸 に 富 ん だ 配 列 を 特 長 と す るNES (nuclear export signal)で,HIV(human deficiency virus)のRev蛋 白 質,PKI(後 存 在 し,核 外 輸 送 受 容 体Crm1(chromosome maintenance)/Xpo1(exportin1)に 質 に 運 ば れ る7∼11)。Crm1は immuno述)な どに region よ っ て 核 か ら細 胞 ま た,U snRNAや5S 1.核 内輸 送 シグナ ル が調 節 分子 に よ り隠され てい る 場合 最 も有 名 な例 と して あ げ られ るの が,転 XB(nuclearfactorxB,Re1フ p65,c-Rel,Re1B)で 写 因 子NF- ァ ミ リー;p50,p52, あ る5)。 この 転 写 因 子 は 普 遍 的 に存 在 し,細 胞 外 か らの 活 性 化 刺 激(IL-1,TNF-α な ど)や ス トレ ス な どに よ り活 性 化 さ れ る。NF-κB(p50 669 40 蛋 白質 核 酸 酵 素 Vol.44 No.5(1999) 3.細 胞 内 膜 に 結 合 して いる 場合 他 の メ カニ ズ ム として は,細 胞 質 の 構 造 体 に結 合 して い る 場 合 が あ げ ら れ る 。SRBP1 (sterol regulatory-binding protein1)は 分 子 量125Kの 前駆 体 として小胞 体膜 お よび 核 膜 に ア ンカ ー され てい る。 細 胞 の ス テ ロ ー ル が 枯 渇 す る と, Database Center for Life Science Online Service こ の 前 駆 体 蛋 白質 は可 溶 性 の 68Kの 蛋 白質 と し て切 り出 さ れ,こ れ が 核 に移 行 し て そ の 標 的 遺 伝 子 で あ る,LDL(low図2 転 写 因子 の核 内輸 送 調 節 の戦 略 転 写 因 子,エ フェ ク ター 分 子 は活 性 化 に伴 う質 的 な 変 化 に よ り核 内輸 送 シグナ ル(こ density lipoprotein)受 こで はNLS HMG-CoA遺 と表 示)が 提 示 され,核 内輸 送 に 導 か れ る。 とp65と の ヘ テ ロ2量 体)はI-κB(inhibitor-κB)と 容 体, 伝 子 な どの 転 写 を 活 性 化 す る9)。 よ ば れ る阻 害 分 子1分 ま た よ く 研 究 さ れ て い る 例 と し て は,イ 子 と3量 体 を形 成 し た 状 態 で 細 ロ ン(IFN)に よ る 転 写 因 子STAT(signal 胞 質 に局 在 す るが,細 胞 外 刺 激 に よ り1-κBが 分 解 され and activators 隠 さ れ て い たNF-κB分 ズ ム が あ る10)。STAT1,STAT2は わ れ,核 子 内 の 核 内輸 送 シ グ ナ ル が 現 内 輸 送 さ れ る。 こ の1-κBの 分 解 は,1-κBキ of transcription)の ンター フェ transducers 核 移 行 の メ カニ イ ンター フェ ロン (α/β)受 容 体 の 細 胞 質 ド メ イ ン に 結 合 し て い る が,イ ナ ー ゼ に よ る リ ン酸 化 とユ ビ キ チ ンープ ロ テ ア ソー ム経 ン タ ー フ ェ ロ ン の 細 胞 外 ドメ イ ン へ の結 合 に よ り リ ン 路 に よ り達 成 され る 。 酸 化 を 受 け,ホ また 同 様 な例 と して,ス テ ロイ ド/ビ タ ミン受 容 体 型6) お よ びAh受 容 体(AhR;aryl hydrocarbon モ2量 に よ り核 に 輸 送 さ れ る 。 receptor また は ダ イ オ キ シ ン受 容 体)7)な どの 核 内 受 容 体 が あ げ 4.リ られ る 。 こ の場 合,細 の機能 が調節 さ れる 胞 質 に お け る核 内 受 容 体 と調 節 分 子 の複 合 体 が リガ ン ドの 結 合 に よ り解 離 さ れ,核 受 容 体(転 写 因 子)が 体 形 成 とそ の 受 容 体 か ら の解 離 内 ン 酸 化 ま た は 脱 リ ン 酸 化 に よ る 構 造 変 化 でNLS 調 節 分 子 を必 要 とせ ず に,リ 核 内 輸 送 さ れ る。 Junl1),NF-AT(nuclear 2.調 節 分 子 と 複 合 体 を 形 成 す る こ と に よ り核 内 輸 送 シ グ ナ ル が 供 給 さ れ 核 に輸 送 さ れ るE2F4 細 胞 周 期 のG1-S期 必 須 なE2F(E2 の な か で,E2F4は の 進 行 を コ ン トロ ー ルす るた め に 写 因子 に,細 胞質 か ら核 に局 在 変 化 す る こ とが 明 らか と な っ た 。E2F4は 核 内 輸 送 シ グ ナ ル を も た な い が,核 factor of activated T cell)12,13),IRF-3(interferon regulatory factor-3)14) や 出 芽 酵 母 転 写 因 子 のswi515),Pho416,17)な promoter binding factor)転 細 胞 周 期 依 存 的 にG1期 ン酸 化 され る こ とに よ り核 内 輸 送 が 負 に調 節 さ れ て い る転 写 因 子 と して,V- 合 体 を形 成 す る こ とに よ り核 内 輸 送 さ れ る8)。 Swi5は,細 接合 型 の ス イ ッチ ング に関与 す る 胞 周 期 特 異 的 リ ン酸 化 に よ りそ の 局 在 が 調 節 さ れ て お り,い ず れ の 場 合 も核 内 輸 送 シ グ ナ ル付 近 の セ リ ン残 基 の リ ン酸 化 に よ り核 内 輸 送 は 阻 害 さ れ 細 内輸送 シグ ナル を もつ パ ー トナ ー 分 子(p107,pRB2/p130,DP2)と れ て い る。v-Junや どが 示 さ 複 胞 質 に局 在 す る が,リ に局 在 す る。v-Junの で あ り11),Swi5の ン酸 化 さ れ て い な い と き に は 核 特 異 的 核 局 在 は細 胞 周 期 のG2期 場 合 はG1期 また,出 芽 酵 母 転 写 因 子Pho4は で あ る15)。 リン酸 の 欠 乏 に よっ て 核 局 在 化 し標 的 遺 伝 子 を 活 性 化 す る。 高 リ ン酸 濃 度 670 41 転写因子の核局在機構 下 で は サ イ ク リ ン-CDK(cyclin-dependent 複 合 体 のPho80-Po85がPho4の kinase) 核 内 輸 送 シグ ナル 内 の ry complex factor)がMAPキ セ リ ン残 基 を リン酸 化 す るた め細 胞 質 に局 在 す るが,低 リン酸 濃 度 下 で はCDK阻 Po85の 害 剤 で あ るPho81がPho80- 蓄 積,こ れ がimportin(Pse1)に 結 合 し核 内 に 輸 送 さ れ る16,17)。 T細 ナ ー ゼ フ ァ ミ リー のJNK/SAPKや 核 内 で 哺 乳 動 物AP-1を 構 成 す るc-JunやATF2 (activating transcription factor 2)を リ ン酸 化 し活 性 化 す る こ とが 知 られ てい る19)。興 味 深 い こ とに,分 胞 の 活 性 化 に 必 須 な 転 写 因 子,NF-ATの 場合 酵 母 の ス トレ ス 活 性 化MAPキ 裂 ナ ー ゼ,Spc1/Sty1も は核 内 輸 送 シ グ ナ ル か ら離 れ た 調 節 ド メ イ ン がCKIα 浸 透 圧 ス トレ ス で 細 胞 質 か ら核 に 局 在 変 化 し,転 写 因 (caseinkinase Iα)に 子ATF1を よ り リ ン酸 化 され,核 グ ナ ル を マ ス ク す る。 一 方,T細 胞 内Ca2+濃 内輸送 シ 胞 の 活 性 化 に伴 う細 度 の 上 昇 に よ り活 性化 され たCa2+依 脱 リン酸 化 酵 素,カ Database Center for Life Science Online Service さ らにMAPキ p38は ス トレ ス刺 激 に よ り細 胞 質 か ら核 へ 局 在 変 化 し, 活 性 を抑 制 し,結 果 的 に リン酸 化 を受 け て い な いPho4が ナ ー ゼ に よ り リ ン酸 化 さ れ る19)。 ル シ ニ ュー リンは,NF-AT調 メ イ ン を脱 リ ン酸 化 す る。 そ の 結 果,調 MAPキ 節 ド 核 に局 在 変 化 す る こ とが 示 され て お り21),酵 母 か ら哺 乳 節 ドメ イ ン と 浸 透 圧 ス トレ ス で細 胞 質 か ら 動 物 に 至 り細 胞 質-核 間 の輸 送 がMAPキ ナーゼカスケ ー ド制 御 の 重 要 な ス テ ッ プ で あ る こ と を示 し て い る 。 の 機 能 を発 揮 す る12,13)。ま たIRF- Ⅱ.ユニークな調節機構をもつyAP-1 3の リン酸 化 とそ れ に 伴 う核 局 在 化 が,ウ イ ル ス感 染 に よ るIFN-β ナ ー ゼ,Hog1は トレ ス 活 性 化 存性 核 内 輸 送 シ グ ナ ル と の相 互 作 用 が な くな りNF-ATは 核 内 に 輸 送 され,そ リ ン酸 化 す る こ とに よ り活 性 化 す る こ とが 示 さ れ た20)。ま た 出 芽 酵 母 の 場 合 も,ス 遺 伝 子 転 写 誘 導 に必 要 で あ る こ とが 示 され て い る14)。 前 述 し た よ う に,現 在 知 られ て い る 多 くの 転 写 因 子 は 核 内 輸 送 の ス テ ップ で 調 節 され て い るが,筆 5.シ グ ナル伝 達経 路の 核内 への到 達 最 近,核 転 写 因 子 が 定 常 的 に核 に局 在 し て い る場 合,そ の活 者 らは 内 輸 送 は定 常 的 に 起 こ り,核 外 輸 送 の ス テ ッ プ で 調 節 さ れ る転 写 因 子yAP-1を 明 らか に した22,23)。 性 調 節 分 子 が 細 胞 質 で シ グ ナ ル を受 け取 っ て 核 へ 移 行 し転 写 因 子 を活 性 化 す る 。 1.yAP-1は CREB(cyclicAMPresponsiveelementbinding protein)は 細 胞 内cAMP濃 れ る転 写 因 子 で,定 CREBを 3) 度 が上 昇 した と き活 性 化 さ 常 的 に 核 内 に 局 在 す る 。 一 方, 活 性 化 に導 くキナ ー ビのPKA(cAMP-depen- dent protein kinase)2分 (PKI)2分 子 は,調 され たPKAは 節 サブ ユニ ッ ト 濃 度 上 昇 に伴 い 解 離 核 内 輸 送 され,CREBの133番 yAP-1は 出 芽 酵 母 のAP-1様 目の セ リ に は結 合 で きない。GCN4は yAP-1は,c-Jun,ATFな す18)。 bZIPド の発 現 合 配列 出芽 酵 母 の もう1つ のAP位 に は結 合 で き な い こ とか ら,両 者 の 結 合 特 異 性 は 明 らか に 異 な る25)。 leucine-zipper)構 構 成 す るc-Fosは,そ 合 配 列 に結 合 し, 1様 転 写 因 子 で あ るが,SV40AP-1部 ン残 基 を リ ン酸 化 す る こ と に よ り転 写 の 活 性 化 を果 た ま た 哺 乳 動 物AP-1を 転 写 因 子 と して ク ロ ー ニ ン グ され た が24),SV40のAP-1結 ソマ トス タ チ ン遺 伝 子 な ど の典 型 的 なAP-1結 子 とヘ テ ロ4量 体 を 形 成 し不 活 性 型 と して 細 胞 質 内 に存 在 す るが,cAMPの 酸 化 ス トレス 応 答 に中 心 的 に機 能 す る(図 のbZIPド ど と 同 様 にbZIP(basic 造 を も つ が,そ れ らの間 で は この メ イ ンの み に 相 同性 が み られ る24)。yAP-1は こ メイ ンの相 互 作 用 で ホ モ2量 体 を形 成 す るが, レベ ル が血 清 刺 激 な どに よ り誘 導 され るが,こ れ はMAP 現 在 ま で にAP-1で キ ナ ー ゼ(mitogen 2量 体 を 形 成 す る証 拠 は な い(筆 者 ら:未 発 表)。yAP-1 activated protein kinase)が 細胞 明 らか に され て い る よ うな ヘ テ ロ 質 か ら核 へ 局 在 変 化 し,cfos遺 伝 子 の プ ロ モ ー ター を の 機 能 は,YAP1遺 活 性 化 す る こ と に よ る。c-fosプ ロモ ー タ ー上 に はSRE 育 に 影 響 を与 え な い こ とか ら不 明 で あ っ た 。 しか し そ (serum response element)が ponse factor)2分 あ り,SRF(serumres- 子 とTCF/SAP-1/Elk-11分 子がヘ テ ロ3量 体 を 形 成 して 結 合 して い る。 このTCF(terna- の 後,①yAP-1を 伝 子 を 欠 損 させ て も酵 母 細 胞 の 生 酵 母 細 胞 内 で 過 剰 発 現 させ る と,作 用 の 異 な る薬 剤 に対 して耐 性 とな る,② さ らにyapl遺 伝 子 欠 損 細 胞 は酸 化 ス トレ ス に 対 して 感 受 性 が 高 くな 671 42 蛋 白質 核 酸 酵 素 Vol.44 No.5(1999) ン サ ー か ら核 内 へ の シ グ ナ ル の伝 達 機 構 を 明 ら か に す る こ とにつ なが る。 筆 者 ら は 初 め に,yAP-1の 結 合 配 列 へ の特 異 的DNA結 合 活 性 は,酸 化 ス トレ ス に よ り2倍 程 度 上 昇 す る こ と を 見 い だ した が,酸 化 ス トレス の な い細 胞 のyAP1に も 結 合 活 性 は あ る こ とか ら,他 の 調 節,局 在 変化 の可 能 性 を 予 想 した 。 そ こでyAP1の 局 在 変 化 を 追 跡 す るた め, Database Center for Life Science Online Service N末 端 にGFP(green cent protein)を 図3 yAP-1に 融 合 し発 現 さ せ た 。 都 合 の よ い こ と に,こ よ る 酸 化 ス トレ ス 応 答 機 構 yAP-1は 酸 化 ス トレス に よ り活 性 化 され,多 くの 夕ー ゲ ッ ト遺 イ 云子 の 転 写 に影 響 を 与 え,還 元 型 チ オ レ ドキ シ ン,還 元 型 グ ル タチ オ ン,グ ル タ チオ ン トラ ンス ポ ー ター な どの 発 現 を増 強,酸 化 ス トレス抵 抗 性 に 中 心 的 に機 能 して い る 。 の 細 胞 は 薬 剤 耐 性 能,転 酸 化 ス トレ ス でyAP-1の 転 写 活性 能 が上 昇 す る,な どが 明 らか とな り26∼28),yAP-1が 察 す る こ とに よ り,実 際 のyAP-1の 複数 の薬剤 耐 性 遺 伝 子 の発 現 を 担 っ て い る こ とが 予 想 され た 。yAP1に よ り誘 導 さ れ る遺 伝 子 の 検 索 の 結 果,細 胞 の過 酸 4)。 子(TRX2)が B.Crm1に ル タ チ オ ン合 成 に か か わ る遺 伝 子29),グ ル タ チオ ン胞 合 体 の輸 送 ボ ン プ30)な どがyAP-1の 細 胞 全 体 に存 ア ミ ドな ど に よ る酸 化 ス ト レ ス に よ り核 に 局 在 変 化 す る こ とが 明 らか にな った22)(図 化 物 抵 抗 性 に必 要 な 遺 伝 子 と し て チ オ レ ドキ シ ン遺 伝 同 定 さ れ た26)。そ の 後,グ 酸 化 水 素,ジ 蛍 光 を観 挙 動 を観 察 で き る と考 え た。 お も し ろ い こ とに,yAP-1は 在 す るが,過 写活 性 化 能 な ど は 親 株 と変 わ らな い こ と か ら,GFPの る,③ fluores- よる負 の調 節 次 に こ の局 在 変 化 の 調 節 機 構 を 明 ら か に す る た め の 標 的遺 伝 子 と して 明 らか に さ れ,酸 化 ス トレ ス,薬 剤耐 性 に中心 的 に 機 能 す る転 写 因 子 の1つ で あ る こ とが 判 明 し た28)(図 3)。TRX2遺 伝 子 は そ の 後, バ ク テ リア の シ グ ナ ル トラ ン ス ダ ク シ ョ ン系 で あ る二 成 分 制 御 系 類 似 の 蛋 白 質Skn7と 協 同 調 節 され て い る こ とが 明 らか と な っ て い る31)。 2.yAP-1核 A.核 外輸 送の 調節 局在 化 と転写 活性 化 yAP-1の 転 写活性化機構 図4 酸 化 ス トレ ス はCrmlに よ るyAP-1蛋 白質 の核 外 輸送 を阻害 す る yAP-1の 局在 は 酸 化 ス トレ ス(ジ ア ミ ド)に よ り細 胞 質 か ら核 に変 化 す るが,CRD(cysteine rich domain)中 の シ ス テ イ ン を す べ て変 異 させ たyAP-1cm46A5やCRDをPKINESに 置 き換 え た yAP-1-NESで は こ の 局 在 変 化 は起 こ ら な い。 しか しすべ て の場 合,核 外 輸 送 の 受 容 体Crm1の の 解 明 は酸 化 ス トレ ス 応 答 の 発 現 を抑 え る と(Crm1抑 制)核 に 局 在 す る 。 左 側 はGFPの 蛍 光 を,右 側 は 透 過 像 を共 焦 点 レ ー ザ ー顕 微 鏡 で 観 察 した 。 理 由 は不 明 で あ る がyAP-1-NES(Crm1誘 導)で は リ ン グ状 の 局 在 全 体 像,す が 観 察 さ れ る が,こ 672 な わ ち ス トレ ス セ れ は 細 胞 質 側 の核 膜 上 にyAP-1が トラ ッ プ され て い る と考 え られ る 。 43 転写 因子の核局在機構 転 写 活 性 が 上 昇 す る こ と, CRDをGAL4のDNA結 合 ドメ イ ン にGFPと と もに融 合 す る と,酸 化 ス トレ ス に よ る そ の融合 蛋 白質 の局在 を コン トロ ー ル す る こ とが で き る こ と,な ど の 結 果 に 加 え,two hybrid法 CRDが に よ りCrm1と 相 互 作 用 す る こ とが 明 ら か に な っ た こ とか ら,CRD がNES様 の核 外輸 送 シ グナ ル と して 機 能 し て い る と考 え Database Center for Life Science Online Service ら れ た22.23)(図5)。 図5 yAP-1 CRD中 のNES様 局 在 は 細 胞 質(C)と 核(N)で PKI(37-47)NES]お よ び,プ 配 列 と シ ス テ イ ン 残 基(598,620,629)の 示 す 。Crm1と ル ダ ウ ン ア ッ セ イ(野 生 型,cm46A5)で で はyAP-1の 変 異 と そ の 活 性 の 相 互 作 用 はtwo hybrid法[野 生 型,cm46A5, 解 析 し た 。nd:未 核外移行 の 調 節 は どの よ うに起 こるのか? 試 験 。 Crm1に よる核 外輸 送 活性 そ の も の が 酸 化 ス トレ ス で 調 節 突 破 口 とな っ た のが,分 裂 酵 母 に お け る遺 伝 学 的 解 析 で あ る。 分 裂 酵 母 のyAP-1ホ モ ロ グ で あ るPap1の の 調 節 遺 伝 子 と し て,crm1+が同 る32)。す な わ ち,crmlの 負 定 され て いたの であ 活 性 の低 下 した 変 異株 で は Pap1の 転 写 活 性 が 上 昇 し,一 方Crm1の Pap1の 転 写 活 性 を低 下 させ る。 この こ とは 出 芽 酵 母 に お い て もyAP-1がCrm1に 過剰 発現 は よ り活 性 が 調 節 され て い る 可 能 性 を示 し て お り,解 析 した と こ ろ,調 モ ー タ ー でCRM1遺 を観 察 した 。 お も しろ い こ とに,Crm1の る とyAP-1特 節 可能 プ ロ 伝 子 を 発 現 しyAP-1の 転 写 活性 発 現 を抑 制 す 異 的 転 写 の 活 性 は酸 化 ス トレ ス に よ る誘 され て い る の か?こ の 可 能 性 はCRDをPKINESと 交 換 し たyAP-1(yAP-1NES)が 酸 化 ス トレ ス に よ り 影 響 され な い こ とか ら否 定 され た 。 す なわ ち,Crm1が NESを 認 識 して核 外 輸 送 す る活 性 は 酸 化 ス トレ ス に よ り影 響 を 受 け な い こ とが 判 明 し た23)(図4,5)。 それ で はCRDのNESと して の活 性 が 変 化 す るの か?CRD に は確 か にNES様 の疎 水 性 ア ミノ酸 残 基 に富 む配 列 が 存 在 す る が,そ の 配 列 中 と周 辺 に シ ス テ イ ン残 基 が 存 在 す る。 このCRD内 の1つ また は 複 数 の シ ス テ イ ン残 基 が 酸 化 ス トレ ス に よ るyAP-1の 核局 在化 調節 に必須 で あ る こ と,酸 化 ス トレス に よ るyAP-1とCrm1と の 導 と同 レ ベ ル ま で 上 昇 した 。 そ し て 前 述 し た よ う に, 相 互 作 用 の 調 節 に 必 須 で あ る こ とが 明 らか とな っ た の yAP-1の で あ る22.23)(図5)。 した が っ て,CRDは 活 性 化 は 局 在 変 化 を伴 うが,Crm1がyAP-1 通 常NESと の核 局 在 を 阻 害 す る こ とが 明 らか とな った の で あ る23)(図 し てCrm1に 認 識 さ れ核 外 移 行 され る が,酸 4)。 ス でNESと して の 機 能 を失 い,Crm1に C.CRDは 調 節 可 能 なNESか? そ の 後,前 (NES)の 述 した よ うに,Crm1は 受 容 体,す な わ ちNESを 識 さ れ な くな る と考 え られ た 。 核 外 輸 送 シグ ナル D.yAP-1の 認 識 して 核 外 に 輸 yAP-1の 活性 調節 の メ カニ ズム 核 内 輸 送 は酸 化 ス トレス に よ り影 響 を 受 け 送 す る こ とが 示 さ れ て き た 。 した が っ て,yAP-1も な い と考 え られ る。 す な わ ちCRDをNESに Crm1に 合(yAP-1-NES),お よ る 核 外 輸 送 で負 に 制 御 され て い る可 能 性 が 考 え られ た 。 で はyAP-1に yAP-1の 配 列 が あ る の か? ドメ イ ン構 造 を 解 析 す る過 程 で,C末 CRD(cysteine Crm1に もNES様 rich domain)と 端側 の 名 づ けた ドメ イ ンが よる制 御 に必 要 な領 域 で ある こ とが 示 された22,23) (図5)。 す な わ ち,CRDを 化 ス トレ よ り も はや 認 欠 い たyAP-1は 核 に局 在 し よ び3つ 変 え た 場 合(yAP-1cm46A5)の り核 外 輸 送 され る が,酸 変 えた 場 の シ ス テ イ ン を同 時 に い ず れ もCrm1に よ 化 ス トレ ス に よ り核 局 在 化 や 転 写 の 活 性 化 は も はや 起 こ ら な く な る こ とか ら(図4, 5),こ れ らの 変 異 体 の場 合 は核 内 輸 送,核 外輸 送 とも に 酸 化 ス トレス に よ り影 響 を 受 け て い な い と結 論 づ け 673 44 蛋 白質 核 酸 酵 素 Vol.44 No.5(1999) 裂 酵 母 のyAP-1ホ Pap1も モ ロ グ, 酸 化 ス トレス に よ り核 に局 在 変 化 す る 。 しか しな が らこの 場 合,出 芽 酵 母yAP-1 の 系 と 異 な りMAPキ Spcl/Sty1に い る33)。Sty1が でPap1を ナー ゼ よ り調 節 さ れ て どの ステ ッ プ 活 性 化 す る か, Pap1CRDの 機 能 な どに関 し て は こ れ か ら の研 究 課 題 で あ る。 本 稿 で 示 し たyAP-1の 転 Database Center for Life Science Online Service 写 調節 機構 は核外 輸送 に よる 負 の 調 節 の 重 要 性 を 示 唆 して 図6 yAP-1転 写 因子 の 酸化 ス トレス に よる核 局 在 化 調 節 モ デ ル yAP-1は 定 常 的 に核 内輸 送,核 外 輸 送 され て お り,核 内 で は 濃 度 が 低 く保 た れ て い る。 核 外 輸 送 はCrm1がyAP-1の 調 節 ドメ イ ンCRDを 認 識 す る こ と に よ る。 しか しなが ら,酸 化 ス トレス に よ りyAP-1のCRDの お そ ら くシス テ イ ン残 基 を介 した 構 造 変 化 に よ りCrm1に な り核 外 輸 送 が 阻 害 され,結 果 的 に核 内のyAP-1濃 認識 され な く 度 が 上 昇 し,特 異 的 遺 伝 子 の 転 写増 強 に導 かれる。 い る が,実 yapl変 際 に核局 在型 の 異 を もつ 酵 母 細 胞 は過 酸 化 物 に感 受 性 で あ る こ とが わ か っ た22)。最 近,い くつ かの 転写 因 子 の核 外輸 送 に よる負 られ る。 の 調 節 が 明 らか に な っ て きた 。 た と え ば前 述 したNF- 以 上 の 結 果 か ら,図6に yAP-1は 示 す モ デ ル が 考 え られ る23)。 細 胞 質-核 間 を シ ャ トル し て お り,核 yAP-1蛋 内の 白質 の 濃 度 が 低 く保 た れ て い る。 しか しな が κBは 数 多 くの タ ー ゲ ッ ト遺 伝 子 の な か でI-κBα 遺 伝 子 の 発 現 も増 強 し,新 た に 合 成 され たI-κBα 行,核 内 のNF-κBに は核 に移 結 合 し て 不 活 化 し,さ ら にI- ら,酸 化 ス トレ ス に よ り核 外 輸 送 の み が 阻 害 さ れ,結 κBα が もつ核 外 輸 送 シ グナ ル に よ りNF-xBを 果 的 に核 内yAP-1の 移 行 させ る41)。この よ うに タ ー ゲ ッ ト遺 伝 子 の 転 写 を介 は お そ ら くCRD内 濃 度 が 上 昇 す る。 核 外 移 行 の 調 節 の シ ス テ イ ン残 基 の レ ドッ ク ス 調 節 で そ の 構 造 に変 化 が 起 こ り,Crm1に な っ た 状 態 が 想 定 さ れ る(図6)。 よ る認 識 され な く この よ うにユ ニー ク な 活 性 調 節 に ど の よ うな メ リ ッ トが あ る か を 考 察 す る と,① 非 ス トレ ス 条 件 下 で も ター ゲ ッ ト遺 伝 子 の 基 礎 活 性 を維 持 す る た め に必 要 で あ る こ と,②yAP-1は 胞 質,核 細 内 で 酸 化 ス トレス セ ンサ ー と し て 機 能 し て い る 可 能 性,な どが 考 え られ る 。 した ネ ガ テ ィ ブ フ ィー ドバ ッ ク ル ー プ の 例 以 外 に,転 写 因 子 内 に核 外 輸 送 シ グ ナルNESを 314)な ど で 示 さ れ て い る。 また 転 写 因 子 を活 性 化 す る エ フ ェ ク タ ー に 関 して も 同 様 な核 外 輸 送 に よる 調 節 が 明 らか に され て い る。PKI は核 内 に 移 行 され て核 内 に存 在 す るPKAと 質 に移 行 させ る戦 略 でPKA活 (MEK1)にNESが 核 外 輸 送 調 節 機 構 に関 して は,今 後 の 課 題 としてCRDとCrm1の の 同 定,そ 相 互 作 用 に必 要 な 因 子 れ ら相 互 作 用 の 試 験 管 内 実 験 系 を 構 築 し, もち核 外 輸 送 に よ る 負 の調 節 に 寄 与 して い る こ と が,NF-AT34),IRF- い る35)。ま たMAPキ お わ りにyAP-1の 核外に 結 合,細 性 の 負 の 調 節 を行 な っ て ナ ー ゼ を 活 性 化 に 導 くMAPKK 存 在 し,Crm1に よ り核 外 輸 送 され る こ とが判 明 した36)。この 場 合,MAPKKは にMAPキ 胞 非誘 導時 ナ ー ゼ と結 合 し,細 胞 質 に 止 め る た め に 機 能 して い る可 能 性37),ま た はMAPKK自 体 も活 性 化 に 酸 化 ス トレ ス に よ る 相 互 作 用 調 節 の 再 現 を 試 験 管 内 で 伴 い核 局 在 とそ の直 後 の 核 外 移 行 に よ り,MAPキ 行 な う必 要 が あ る。 これ に よ りCRD内 ゼ の 活 性 化 調 節 を し て い る 可 能 性38)が 示 唆 され て い る。 の シ ス テ イ ン残 基 の 変 化 を解 析 す る 道 が 拓 け る と考 え られ る。 ま た 本 さ ら に ス トレ ス活 性 化MAPキ 稿 で は誌 面 の都 合 上 述 べ る こ とが で き な か っ た が,分 るMAPKAP 674 kinase-2は,活 ナ ー ゼp38の ナー 基質 で あ 性 化 に 伴 いp38を 核外 45 転写因子の核 局在機構 輸 送 に よ り負 に調 節 し て い る こ とが 示 され て い る39,40)。 この ように特異 的転 写 の活性 化が適 切 な時間軸 を も 19)Karin,M.,Liu,Z.,Zandi,E.:Curr.Opin.Cell Biol.,9,240-246(1997) 20)Gaits,F.,Degols,G.,Shiozaki,K.,Russell,P.: っ て調 節 さ れ る た め に は,核 外 輸 送 に よ る 負 の 調 節 は 核 内 輸 送 に よ る活 性 化 と 同 時 に 重 要 で あ り,今 後 さ ら に そ の 重 要 性 が 示 さ れ て い く と思 わ れ る。 Genes Dev.,12,1464-1473(1998) 21)Ferrigno,P.,Posas,F.,Koepp,D.,Saito,H., Silver,P.A.:EMBO J,17,5606-5614(1998) 22)Kuge,S.,Jones,N.,Nomoto,A.:EMBO 本研究 は東京大学 医科学研究所 ウイルス研究部の野本 明男博 士 をは じめ研究室 の方 々の ご協 力 をいただ き遂行 され ました。 ここ に感謝 申し上 げます。 また本稿執筆 にあた り助言 を与 えて くださ った東京大学医科学研究所の伊庭英夫博士,白 木和子博士 に深謝 いた します。 J.,16, 1710-1720(1997) 23)Kuge,S.,Toda,T.,Iizuka,N.,Nomoto,A.: Genes to Cells,3,521-532(1998) 24)Moye-Rowley,W.S.,Harshman,K.D.,Parker,C. S.:Genes Dev.,3,283-292(1989) 25)Jones,R.H.,Moreno,S.,Nurse,P.,Jones,N.: Cell,53,659-667(1988) 文 1)大 26)Kuge,S.,Jones,N.:EMBO 献 野 睦 人:蛋 白 質 核 酸 酵 素,43,1255-1264(1998) Database Center for Life Science Online Service 2)Ohno,M.,Fornerod,M.,Mattaj,I.W.:Cell,92, 327-336(1998) chem.,67,265-306(1998) 4)Stutz,F.,Rosbash,M.:GenesDev.,12,3303-3319 W.:Mol.Micyobiol.,19,651-658(1996) 29)Wu,A.L.,Moye-Rowley,W.S.:Mol.Cell.Biol., 14,5832-5839(1994) 30)Wemmie,J.A.,Szczypka,M.S.,Thiele,D.J., (1998) 5)Ghosh,S.,May,M.J.,Kopp,E.B.:Annu.Rev. 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