クター-“スリパー”を中心として-中野衛一
溶 原 性ファ ー ジDNAは,
宿 主 染 色 体 に 組 み 込 ま れ て 安 定 に 存 在 しう る。 こ の性 質 を 利
用 して, ターゲ ッ ト遺 伝 子 を 安 定 に 保 存 で き る ベ ク タ ー を 開 発 した 。 溶 原 性7ア ー ジDNA
はま た, 特 定 の 条 件 下 で は, 宿 主 染 色 体 か ら切 り出 され,
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す る。 こ の し くみ を利 用 して,
短 時 間 に100∼1,000倍
に増 殖
目的 の 遺 伝 子 産 物 を き わ め て 効 率 よ く作 らせ る こ と が で き
る。
は じめ に
ミ ド系 ベ ク ター に つ い て, そ の概 略 を紹 介 す る。I
大 腸 菌 を宿 主 とす るベ ク ター は, プ ラ ス ミ
ド由来 の も の^<1)>と
λフ ァー ジ 由来 の も の^<2∼4)>と
が ほ とん ど
同時 期 に開 発 され, 1973∼1974年
に発 表 され て い る。
.
ス リー パ ー ベ ク タ ー
そ の後, 分 子 量 が 小 さ く, 取 り扱 い が容 易 な プ ラス ミ ド
ベ クタ ーが 通 常 の組 換 えDNA実
験 に 広 く用 い られ , 一
ス リー パ ー ベ クタ ー は 初 期 の λ系 ベ クタ ー^<2∼4)>と
異な
方, フ ァー ジ系 ベ クタ ーは 比 較 的 大 きな サ イ ズ のDNA
り, λDNA中
央 部 に存 在 す る宿 主 染 色 体 へ の 組 み 込 み
で も安 定 に保 持 で き る こ とな どか ら, 遺 伝 子 バ ン クを作
に必 要 な遺 伝 子 att-int-xis (図1)
る際 に よ く用 い られ る よ うに な った 。 現在, 遺 伝 子 の解
た め 宿 主 染 色 体 に 組 み 込 まれ て 細 胞 内に 安 定 して存 在 す
を も っ て お り, そ の
析 の面 か らは, よ り大 きな サ イ ズを よ り安 定 に ク ロー ニ
る こ とが で き る。 図2に 示 した よ うに, 目的 とす る外 来
ング で き るベ ク タ ーが 求 め られ, ま た, 酵 素 な ど遺 伝 子
遺 伝 子 は, フ ァー ジ の コー ト蛋 白質構 造 遺 伝 子 の部 分 に
産 物 の工 業 生 産 の 面 か らは, よ り生 産能 が高 く, かつ,
組 み 込 め る よ うに な って お り, そ れ に よ り組 換 え 体 の安
よ り安 定 な 宿 主-ベ ク ター系 が 求 め られ て い る よ うに 思
全 性 (フ ァー ジ粒 子 が で きな い た め) と生 産 性 (不 要 な
え る。
蛋 白質 を作 らな い た め) を高 め て い る。 さ らに, コ ー ト
筆 者 らは, 溶 原性 フ ァー ジ λが 大 腸 菌 に溶 原 化 され た
蛋 白質 遺 伝 子 の強 力 な プ ロモ ー ターP'Rを
利 用 して, 遺
状 態 (プ ロ フ ァー ジ の状 態) で は 非 常 に安 定 で あ る こ
伝 子 産 物 の高 度 な 生 産 が 可能 で あ る。 宿 主 染 色 体 に 組 み
と, お よび, 自己 増 殖 を 開 始 す る と100∼1,000コ
込 まれ る とcIリ
細 胞 に も達す る こ とに注 目 し, 安 定 性 に優 れ,
ピー/
プ レ ッサ ー のみ が 作 られ, そ れ に よ り
自己 複 製 が 抑 え られ る。cIに
しか も 目
は 温 度 感 受 性 変 異cI_<857>^<6)>
を導 入 した の で, 自己 増 殖 を誘 発 す る に は単 に培 養 温 度
的 とす る遺 伝 子 産 物 の 生 産 能 の高 い 宿 主-ベ クタ ー系 を
作 るべ く, 1975年 こ ろ か ら研 究 を行 な っ て き た 。 そ し
を上 げ て リプ レ ッサ ー を失 活 させ るだ け で よい。 自己増
て, 溶 原 化 能 を保 持 した 一 連 のベ クタ ー (“ス リーパ ー”
殖 開 始 後 の宿 主 の溶 菌 を抑 え, コ ピー数 を500∼1,000/
ベ クタ ー^<5)>)
を 開発 した。
細 胞 ま で高 め るた め, 溶 菌 関 連 遺 伝 子SにS_7変
本 稿 で は, ス リーパ ーベ ク タ ー を中 心 と して, 宿 主 染
色体 に組 み 込 ん で安 定 化 で き る フ ァ ー ジ系 お よび プ ラス
Eiichi
Nakano,
Noda,
Noda
キ ッ コ ー マン (株) 研 究 本 部
City,
Chiba
278,
(〒278野
異^<7)>を
導 入 した 。
田 市 野 田399)
“ス リーパ ー” の 由来 は,
[Research
& Development
通常は宿主め 染色体 り中に
Division,
Kikkoman Corp.,
Japan]
Lysogenic Phage Vectors-“Sleeper” and its Relatives
Key 【フ
wordァ ー ジ ベ ク タ ー 】 【ス リ ー パ ー 】 【温 度 感 受 性 】 【λ フ ァ ー ジ 】
1133
34
蛋 白 質
図1.
核 酸
酵 素
Vol. 32
No. 9
(1987)
λ フ ァ ー ジ の 遺 伝 子 地 図
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遺 伝 子 は 重 要 な もの だ け を 示 した 。P'Rは 溶 菌 お よび コー ト蛋 白質 遺 伝 子 の プ ロ モ
ー タ ーで , Q遺 伝 子 産 物 に よ り活 性 化 さ れ る。 λDNAの
左 右 両 端 は12塩
基 の互 い
に相 補 的 配 列 を もっ1本 鎖 で, 環 状 や 直 列 構 造 を と りや す くな っ てい る。
図2.ス
リ ー パ ー ベ ク タ ー 概 念 図
図4. slp1ベ
白抜 き部 分 は φ80由
部 位 を 示す 。
1. slp
ク タ ー
来 で あ る。 矢 印 はEcoRI切
断
1
図3にslp1作
製 の概 略 を示 した 。Murray
に よ り, λDNA上
の不 要 な. Eco RI部
ら の方 法^<2)>
位 を消 去 した の
ち に, φ80フ ァ ー ジ と掛 け 合 わ せ て, コー ト蛋 白質 遺 伝
子 部 分 にEco
RI部
合 わ せ る と, φ80の
位 を 導 入 した 。λ と φ80を 単 に掛 け
αtt^<*1>を
もつslp2タ
高 頻 度 で 出 現 す るの で, slp1を
を 使 い, φ80のatt右
図3. slp1作
製 の 概 略
イ プ (図4) が
作 る と きに は φ80ptrp
側 で の 組 換 え を 抑 え て 行 な った^<5)>。
図4に 示 した ま う に, slp1型
ベ クタ ー はDNA分
子 左 側 の コ ー ト蛋 白質 遺 伝 子 部 分 が φ80由 来 で, そ の
隠 れ て い て, 遺 伝 子 産 物 を作 らな い こ とに よ る。 最 初 の
部 分 に数 カ所 のEcoRI部
ベ ク タ ーは1976年
を もつ の で, 大 腸 菌 染 色 体17分
に完 成 し, そ の後, 種 々 の改 良 を加
位 を もつ 。slp15は
え て 現 在 に至 った 。 主 要 な も の を タ イ プ別 に以 下 で紹 介
が, slp2Sは
す る。
み 込 まれ る。 両 者 を 同一 宿 主 に溶 原 化 す る こ とも可 能 で
あ る。slp1Sで
*1
φ80のattを
λのatt
の位 置 に組 み 込 まれ る
はKpnIやSacIも
も って い るの で27分
に組
コ ー ト部 分 に のみ
宿主染色体に組み込 まれ る際に, この部位で染色体 と組換えが行なわれ る。宿主染色体上の特定の部位 とホモロ ジーを もつ。
1134
溶 原 性
ファ
ー ジ ベ
ク タ ー
35
図5. Slp10ベ
クタ ー
λcI_<857>
plac 5 S_7は 母 体 と な った フ ァ ー ジ で あ る 。矢 印 は
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Eco RI部
位 を示 す 。
切 断 部 位 を もつ の で, Eco RIと
2Sに
同 様 に使 用 で き る (slp
つ い て は未 確 認)。
2. slp
10
白質 (No.20)
slp 10は 他 の ス リーパ ー と 異 な り, 溶 菌 関 連 遺 伝 子
(S, R,
Rz)
図6. slp
白 抜 き 部 分 は φ80由
EcoRI部
位を示す 。
お よび コー ト蛋 白質 遺 伝 子 (Nu1-J)
ロモ ー タ ーP'Rの
のプ
直 後 に 唯 一 の 利 用 可 能 な制 限 酵 素 部
位 を もっ て い る (図5,
図1)。 こ の部 位 に外 来 遺 伝 子 を
500ベ
クタ ー
来 で あ る。 指 定 の な い 矢 印 は
の 構 造 遺 伝 子 の中 に 存 在 す る^<10)>の
で, そ
の部 位 にcDNAな
どを挿 入 して融 合 蛋 白質 を 作 らせ る,
いわ ゆ る発 現 ベ クタ ー と して利 用 可能 で あ ろ う。
図6に 示 した よ う に, 3φ500Sは
同 じで あ るが, Eco RI部
機 能 的に は1Sと
位 を整 理 して 使 い や す く しで
組 み込 ん で も コー ト蛋 白質 遺 伝 子 は損 傷 を受 け な い の
あ る。 λcI_<857>S_7を
母 体 と し, 左 端 付 近 は301Sと
で, 組 換 え体 は フ ァ ー ジ粒 子 と して回 収 で き る。
で, 中 央 のEco
RI部
位 か ら右 は1Sと
左 の2つ のEco
RI部
位 (図3) 間
slp10 Sは
λcI_<857>plac
5S_7^<8)>を
母 体 と し, attのEvo
RI部
位 間 のlacを
RI部
位 の み を残 して, 他 は消 去 した も の で あ る。slp10
WESは,
WとEに
含 む 部 分 を除 去 し, P'R直 後 のEco
変 異 を入 れ て, supEま
た はsupFを
のDNAは
slp501Sは,
5005と11Sを
左 部 分 が500Sで,
右 が11S由
用 い て作 製 した も の で,
来 で あ る。XbaI部
外 来遺 伝 子 を 導 入 した あ と, EcoRIで
で あ る。
み込 む こ とが 可 能 で あ る。501S⊿Rは500Sと11S⊿R
slp11Sは10SめEco
DNAを
RI部
位 に合 成DNAを
位 に変 え た も の で, Eco RI部
挿入
位 を もつ
組 み 込 む ときな どに 使 う。
5功10S⊿Rと11S⊿Rは,
2ヵ 所 のAat
除 去 して
あ る。
もた な い株 で は フ ァ ー ジ粒 子 を 作 れ な い よ うに した も の
し てXbaI部
同 じ
同 じで あ る。att
を用 い て 作製 した 。501S-Tcは
位に
別 の遺 伝 子 を組
遺 伝 子 バ ン ク作 製 の と
きな どに 便利 な よ うに, 501SのXbaI部
位 にpBR322
の テ トラサ イ ク リン耐 性 遺 伝 子 を 導 入 した も の で あ る。
溶 菌 遺 伝 子Rに 存 在 す る
II部 位 間 の 配列^<9)>を
除 去 してR^-と
した
も ので あ る。S_7のみ で は, 条 件 に よっ て は溶 菌 す る こ と
も あ るが, S_7⊿Rで はそ の よ うな場 合 で も溶 菌 は ま った
く起 こ らな か った。
そ の降 に,
プ ロモ ー タ ーをP_<trp>に変 え て あ る の で,
5015-Tcの
溶 原 菌 は ト リプ トフ ァ ンの な い 培 地 で のみ
1.5μg/ml程
度 の弱 い耐 性 を示 す 。
slp505Sは501Sの
で, XbaI部
位 とEco
左端 のEco
RI部
RI部
位 のな い 構 造
位 に 外 来遺 伝 子 を 組 み 込 ん
だ の ち に (こ こ ま では フ ァー ジ粒 子 が で き る), Kbn I
3. slp500
slp301S
また はSacIで
(図6)
は10Sを
母 体 と し, 右 端 のEco RI
部位 を消 去 して, 左 端 に φ80由 来 のRI部
たも の で あ る。Eco RI部
さ らに別 の遺 伝 子 を組 み 込 む こ とが 可 能
であ る。
位を導入 し
位 は φ80の メ ジ ャ ー コ ー ト蛋
1135
36
蛋 白 質
表1.
核
ス リーパ ーベ ク タ ー のDNA収
酸
酵 素
Vol. 32
No. 9
菌 はT-Y保
容力
(1987)
存 培 地^<*2>に
植 え, 30℃ で 培 養 した のち に,
キ ャ ップ を 固 形 パ ラフ ィン で密 封 し, 室 温 で保 存 して お
く と, 少 な く とも数 年 間 は コ ロ ニー の 選 択 をせ ず に そ の
ま ま使 用 で き る。
II.
ス リー パ ー ベ ク タ ー の 利 用
図7に ス リー パ ー の使 用 法 を示 した 。 ベ クタ ー を利 用
可 能 な 制 限酵 素 で 切 断 し, そ の ま まか あ るい は グ リセ リ
ン密 度 勾 配 遠 心 法 に よ り 左 右両 ア ー ム を精 製 し た の ち
に,
目的 の遺 伝 子 を もつDNA断
片 (同 じ制 限酵 素 で
切 断 した も の) を 加 え てDNAリ
ガ ーゼ 処 理 し, 組 換
え体DNAを
作 る。 次 い で, in vitro パ ッケ ー ジ法^<12,13)>
に よ り λフ ァー ジ の コ ー トに パ ッ ケー ジ して フ ァー ジ粒
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子 と し, 宿 主 大 腸 菌 に感 染 させ, 目的 とす る溶 原菌 を分
4.
ス リー パ ー ベ ク タ ー のDNA収
容力
離 す る。 分 離 の際, 組 換 え 体 に 選択 マ ー カー が つ い て い
ス リー パ ー ベ ク タ ーは λフ ァ ー ジ の コ ー ト蛋 白質 に パ
ッ ケ ー ジ して 使 用 す る の で, 組 み 込 め るDNAの
な い場 合 に は, λcb2を 感 染 させ て生 き残 っ た株 (溶 原菌
と λ抵 抗 性 変 異 株 を 含 む) の 中 か ら, 温度 感 受 性 を示 す
サイ ズ
に 上 限 と下 限 とが あ る。 各 ベ クタ ー の容 量 を 表1に 示 し
た が, 0∼27kbの
範 囲 が 可 能 で あ る。nin5欠
を 導 入 す る と30kbま
も の (=溶 原 菌) を 分 離 す る。
失変 異^<11)>
で広 が るが, nin5株
組 換 え 体 溶 原 菌 は, 32℃ で培 養 す る と, 基 本 的 に は 目
的 とす る遺 伝 子 産 物 を 作 らな い (外 来遺 伝 子 が 大腸 菌 内
を作 って み
た とこ ろ, 遺 伝 子 産 物 の生 産 効 率 が や や 低 下 した ので,
で制 御 を受 け ない プ ロモ ー タ ーを も って い る場 合 に は 多
使 っ て い な い。
少 作 るか も しれ な い)。 そ のた め, 溶 原 菌 の32℃
育 速 度 は宿 主 大 腸 菌 とま った く変 わ らな い。42℃
5.
安
定
性
分 間 培 養 した の ち に, 37℃
ス リーパ ーベ クタ ー お よび そ の組 換 え体 は, 大 腸 菌 の
す る と, 組 換 え 体DNAが
*2
1136
T-Y保
存 培 地
: Tryptone 0.5%,
ス
酵 母 エ キ ス
リ ー
パ
ー
(Difco) 0.25%,
で15
(任意 の温 度 で よい) で培 養
宿 主 染 色 体 か ら切 り出 され
て, 自己 増 殖 す る。kil 遺 伝 子 の働 き に よ り分 裂 が 抑 え
染 色 体 に組 み 込 ん だ状 態 で半 永 久 的 に保 存 で き る。 溶 原
図7.
での 生
ベ
ク
タ
ー
の 使
Nacl 0.25%,
用
法
寒 天0.6%;
2ml/4mlバ
イ アル 。
溶 原 性 フ ァ ー ジ ベ ク タ ー
37
ら れ るの で, 菌 体 は フ ィ ラ メ ン ト状 とな り^<14)>,
そ の 中
で 組 換 え 体DNAは,
D NAが
最初 は 閉 環 状 で, そ の後 は 直 鎖
直 列 に つ な が った形 で コ ピー数 を急 速 に増 加 さ
せ る (rolling circiereplication^<15)>)。
最 終 的 な コ ピー数 は
500∼1,000/細
ーP'Rと
胞 とな り^<7)>,
加 え て, フ ァー ジ プ ロモ ー タ
外 来 遺 伝 子 上 の プ ロモ ー タ ー の働 き とに よ り
,
目的 の遺 伝 子 産 物 が 著 量 蓄 積 され る。 この状 態 の菌 体 か
らDNAを
抽 出 す る と, 大 部 分 が 組 換 え体DNAな
で, そ の ま まDNA分
の
析 を行 な った り, in vitro パ ッ ケ
ー ジ法 に よ りフ ァー ジ粒 子 と した のち に
原 化 で き る。 また, ⊿R株
図8.
, 他 の宿 主 へ 溶
以 外 で はR遺 伝 子 産 物 (溶菌
酵 素) が つ くられ て い る の で, 適 当 な 条 件 を 与 え れ ば,
大 腸 菌1100
(slp1S-thr11)
に よ る ア ス パル トキ
ナ ー ゼI-ホ モ セ リン脱 水 素 酵 素I (thr A産 物) と ホ モ
セ リン キ ナ ーゼ (thr B産 物) の 生 産^<18)>
上 は 組 換 え 体DNAの
構 造 で あ る。 下 は 組 換 え 体 に よ っ て
生 産 され た 蛋 白質 のSDSポ
リア ク リル ア ミ ドゲル 電 気 泳 動
を示す。
す み やか に溶 菌 させ る こ とが 可 能 で あ る。
以下 で は, ス リー パ ーベ クタ ー の若 干 の利 用 例 を紹 介
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し, あわ せ て 今後 の可 能 性 につ い て述 べ る。
1.
熱 誘 導 後 の 培養 時 間
酵 素 生 産
大腸 菌trpオ
ペ ロ ン^<16)>を
もつ21kbのEcoRI断
slp1Sに組 み込 み, 大 腸 菌1100⊿trpに
片を
溶 原 化 した 。 表
2は 組 換 え 体 に よ る ト リプ トフ ァ ン合 成 酵 素 の 生産 を 示
して い る。 熱 誘 導 を行 なわ な か っ た対 照 と比較 す る と,
生 産 量 は 約3,000倍
上 昇 した^<5)>。
熱 誘 導 後, ト リプ トフ
ァ ン合 成 系 の 人工 誘 導 剤 で あ るイ ン ドー ル 酢酸 を 添 加 し
て も, 合 成 量 は増 加 しな か った。 この こ とか ら, 熱 誘 導
後 の コ ピ ー数 の増 加 は, trpリ
プ レ ッサ ーの 影 響 を ま っ
た く受 け ない ほ ど十 分 であ った と推 定 され る。
図9.
大 腸 菌 thrA,
B遺 伝 子^<17)>を
含 む4.7kbの
片 を2個 直 列 にslp1Sに
導 入 し, 1100
Eco RI断
(slp1S-thr11)
を 作 製 した 。 プ ラ ス ミ ドの系 で は 発 現 の 上 昇 が あ ま り見
られ な い と報 告 され てい る^<17)>に
もか か わ らず,
ーでは
, 熱 誘 導 後, 著 量 のthrA,
が 見 ら れ た (図8)。
thr
A産
素I)
B遺
は 全 蛋 白質 の20%を
ンキ ナ ー ゼ) は7%ぐ
大 腸 菌glpK遺
slp
1Sに4個
伝 子 産 物 の蓄 積
モ セ リン脱 水 素酵
占め, thrB産
GHF54に
熱 誘 導 後37℃
で培 養 し, 全 可 溶 性 蛋 白質 をSDSポ
リア
ク リル ア ミ ドゲル 電 気 泳 動 に よ り分 析 した 。 矢 印 は グ リセ ロ
キ ナ ー ゼ の位 置 を 示 す 。
ス リー パ
デ ン シ ト メー タ ー測 定値 よ り,
物 (ア スパ ル トキ ナ ーゼI-ホ
大 腸菌1100glpK
(sko 1S-glpK)
よる グ リセ ロキ ナ ー ゼ の生 産^<19)>
物 (ホ モ セ リ
ら い と推 定 され る^<18)>。
伝 子 を もつ2.7kbのEco
RI断 片 を
直 列 に 導 入 し, 溶 原 菌1100slp1S-glp
K) GHF54を
作 製 し た 。 図9に
示 した よ うに, 熱 誘 導
後 に 生 産 され る グ リセ ロ キ ナ ー ゼ は, 全 可 溶 性 蛋 白質 の
40%に
も達 した^<19)>。
大 腸 菌 以 外 の 細 菌 由来 の酵 素 につ い て も, い くつ か 行
な い, 同 程 度 の 生 産 量 が 得 られ て い る。 生 産 され た酵 素
は す べ て可 溶 性 画 分 に あ り, 集 菌 の の ち フ ァ ー ジ由 来 の
溶 菌 酵 素 で 自己 消 化 して容 易 に 取 りだ せ る。 ミニ ジ ャ ー
フ ァ ー メ ンタ ー を用 い た培 養 で は, 1∼2g/lの
表2.
1100⊿trp
(slp1S-trp) に
よ る
ト リ プ トフ ァン 合 成 酵 素 の 生 産^<5)>
酵素生産
が 認 め られ て い る。
現 在 ま で の結 果 か ら, ス リーパ ーの 系 で 最 大 の酵 素 生
産 量 を得 る には,
(1)
a)
37℃,
20分
間 に1μmolの
を 消 失 させ る 活 性 を1ユ
イン ドー ル
ニ ッ トと した。
目的 の遺 伝 子 に 大 腸 菌 で働 くプ 旨モ ー タ ーが 付
い て い る こ と (な い 場 合 には 適 当 な プ ロモ ー タ ー
を 付 け る)
1137
38
蛋 白 質
(2)
そ のDNA断
核 酸
酵 素
Vol. 32
No. 9
(1987)
片 を 直 列 に ス リー パ ー ベ クタ ー
生 産 した (表4)^<20)>。
現在, gshIとgshIIを
そ の際 に 転 写 の 方 向 が フ ァー ジ プ ロモ ー タ ー
最 大 とな る菌 株 の作 製 を行 な っ て い る。
に導 入 す る こ と
(3)
種 々の 比 率
で 同一 ベ クタ ー に組 み 込 ん で, グ ル タ チ オ ン の合 成 量 が
P'Rと 同 じで あ る こ と
が 必 要 と考 え て い る。 と くに (3)
は重 要 で あ り, thr 遺
伝 子 の 場 合 に はP'Rと
逆 方 向 につ な ぐ と, 生 産 量 は1/
10に 低 下 した 。(1)
の プ ロモ ー タ ー は通 常 は リプ レ ッ
3.
遺伝子 バンク
ス リーパ ーベ クタ ーは 染 色 体 に組 み込 まれ た 状態 で は
1コ ピーな の で, 繰 り返 し配 列 を含 む な ど不 安 定 な 構 造
シ ョン のか か っ て い る も のが 望 ま しい。 染 色 体 に組 み 込
のDNAや,
遺 伝 子 産 物 が 宿 主 に 悪 影 響 を 与 え る よ うな
まれ て い る状 態 で は 目的 の遺 伝 子 産 物 が 作 ら れ な い の
遺 伝 子 の クロ ー ニ ン グ に有 効 と考 え ら れ る。501S-Tc
で, 宿 主 に対 す る負 担 が ま った くな く, 一 方, 熱 誘 導 後
の よ うに薬 剤 耐 性 マ ー カ ー のつ いた もの が利 用 可 能 で あ
に は コ ピ ー数 が リプ レ ッサ ー数 を上 回 る こ とに よ り, 自
ろ う。
動 的 に リプ レ ッシ ョ ンが 解 除 され るか ら で あ る。
III.
2.
ス リーパ ーベ クタ ー を 用 い る と27kbま
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類 縁 の フ ァー ジベ ク タ ー
バ イオ リア ク ター
伝 子 を 安 定 に 保 持 で き る (slp1Sと2Sと
と, 50kbも
での 外来遺
を同 時 に使 う
可 能 で あ ろ う)。そ のた め, 複 数 の 酵 素 を 必
1.
λgf4, λgt11
λgt4は
λcI_<857>plac5nin5の右 側3ヵ 所 のEco RI部
位 を消 去 し, 中 央 部 分2ヵ 所 の み を 残 した も の で あ る
要 とす るバ イ オ リア クタ ー の作 製 に 最 適 な 宿 主-ベ ク タ
(図10)。
ー系 で あ る と考 え
溶 原 化 で き る。gt4に 大 腸 菌DNAリ
, グ ル タ チ オ ン合 成 系 につ い て研 究 を
グル タ チ オ ンは Glu, Cys お よびGlyか
プ チ ドで, そ の 合 成 にはGSBI
とGSHII
らな る ト リペ
(γ-グル タ ミル-L-シ ス
(グ ル タ チ オ ン合 成 酵 素)
を必 要 とす る。gsh II遺 伝 子1コ
ピー をslp10Sに
込 ん で酵 素 の 生 産 量 を 調 べ た とこ ろ, gshIIを
コ ピー もつpGSB402プ
産 が み られ た (表3)。
Tcに4コ
ガー ゼ遺 伝 子 を 導
入 した と ころ, 溶 原 菌 は 熱誘 導 の のち, 非 溶 原 菌 の100
行 な って い る^<*3>。
テ イ ン合成 酵 素)
こ の中 央 部 に 外 来遺 伝 子 を 組 み込 ん で宿 主 に
組み
同 様 に1
ラ ス ミ ドと比 較 して約3倍 の 生
また, gsh I遺 伝 子 を slp 501S-
ピー組 み込 ん だ と ころ, 同 じ遺 伝 子 を1コ
ー もつ プ ラス ミ ド (pGS100)
の約6倍
のGSHI酵
ピ
素を
倍DNAリ
ガ ーゼ を 生 産 した 。ま た, S_7変異 株 で は, 生
産 量 は500倍
λgt11は
で, lacZ遺
とな った^<21)>。
λcI_<857>plac5nin5S_<100>を
母体と した も の
伝 子 の 末 端 に近 い と ころ に 唯一 のEco
位 を 残 して,
cDNAな
RI部
他 は 消 去 した もの であ る。 こ の 部 位 に
ど を挿 入 す る と,
フ レー ムが 一 致 した 場 合 に
は, β-ガ ラ ク トシダ ー ゼ との融 合 蛋 白質 が 作 られ る。溶
原 菌 を 誘 導 培 養 して生 産 され る融 合 蛋 白質 と抗体 との反
応 に よ り, cDNAラ
イ ブ ラ リー か ら特定 の ク ロー ンを
選 び だ す こ とが で き る^<22)>。
表3.
グル タ チ オン 合 成 酵 素 (GSHII)
の生 産^<20)>
これ らの ベ ク タ ーは宿 主 染 色 体 に組 み込 め る 点 で ス リ
ーパ ー と似 て い るが
して い るの で, DNA収
力 なP'Rプ
a)
μmolグ
表4.
ル タ チ オン/mg蛋
*3
白質/時
γ-グル タ ミル-L-シ ス テ イン 合 成 酵 素
(GSHI)
の 生 産^<20)>
μmolγ-グ
ル タ ミル-L-シ ス テ イン/mg蛋
白 質/時
京都大学 食糧科学研究所 ・木村光教授 との共同研究。
1138
容 力 は は るか に少 な く, ま た, 強
ロモ ー ター を 利用 して い な い 点 で 異 な っ て
図10.
a)
, コー ト蛋 白質遺 伝 子 を そ の ま ま残
λgt4^<21)>,λgt11^<22)>
矢 印 はEcoRI部
位 を 示す 。
溶 原 性 フ プ ー ジ ベ ク タ ー
図11.
λNM459,
矢 印 はEcoRI部
39
λNM1070^<23)>
位 を 示す 。
い る。2
図12.
λSV2^<25)>
. λNM459, λNM1070
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λNM459
(図11)
は λcI_<857>nin5を
母 体 と し, 右側3
ヵ所 のEcoRI部
位 が 消去 され, 残 る中 央 部 分2カ 所 の
部 位 間 のDNAが
除 去 され た も の で あ る^<23)>。
λgt4と 基
本 的 に は 同 じで, ま った く同 じもの が λgt2と して 発 表
さ れ て い る^<21)>。
似 た よ うな構 造 で, HindIIIが
ジ法 を 用 い な い の で, どの よ うな サ イ ズ のDNAで
も導
入 で き る とい う特 徴 を も っ て い る。 染 色 体 上 の プ ラス ミ
ドDNAは
が,
熱 誘 導 に よ り切 り出 され て 自己増 殖 を 行 な う
コピ ー数 は5∼10/細胞
と少 な い。
使え るも
の (λNM540)^<24)>もあ る。
λNM1070の
詳 細 は 不 明 で あ るが,
5nin5WESの
お そ ら く λcI_<857>Plac お わ りに
中央 部 分2ヵ 所 のEcoRI部
本 稿 で は宿 主 染 色 体 に 組 み込 まれ て 安 定 に
位 を残
存 在 し, 熱 誘 導 に よ りコ ピー数 を 増 加 させ うるベ ク タ ー
し, 他 の部 位 を消 去 した も の と思 わ れ る (図11)^<23)>。
こ
とい う観 点 か ら, ス リー パ ー お よび 関 連 ベ ク タ ーを 紹 介
れ も基 本 的 に は λgt4と 同 じで, 中央 部 に 外来 遺 伝 子 を
した。 一 方, ス リ ー パ ー と同 時 期 に開 発 され た ベ クタ ー
挿 入 して宿 主 染 色 体へ 組 み 込 め る。 溶 菌 関連 遺 伝 子S
に ラ ンナ ウ ェイ ベ ク ター^<26∼28)>が
あ り, 培 養 温 度 で コ ピー
の他 に コー ト蛋 白質 遺 伝 子 の うちWとEに
数 を 変 え られ る点 で 似 て い る。 λ のPLプ
amber
変異
ロモーターを
を導 入 して, 遺 伝 子 産 物 の 生 産 効 率 を 上 げ る工 夫 を して
もつ プ ラ ス ミ ド^<29)>で
は, 転 写 のみ を温 度 で 制 御 す る。 こ
い る。NM1070にT4ポ
の よ うな プ ラス ミ ドベ ク タ ー に対 して, フ ァー ジ ベ クタ
子 をP'Rの
リヌ ク レオ チ ドキ ナ ー ゼ遺 伝
転 写 方 向 に合 わ せ て導 入 し溶 原 化 す る と, 可
溶 性 蛋 自質 の約7%ぐ
ー の 有 利 な 点 は , 誘 導 が 一 時 的 な温 度 シ フ トで 完 了 し,
らい の酵 素 生 産 が 認 め られ た^<23)>。 そ の 後 は 任 意 の 温 度 で培 養 で き る 点 で あ ろ う。
利用
枯 草 菌 では 溶 原 性 フ ァ ー ジ を利 用 した ク ロー ニ ン グ法
コー ト蛋 白質 を作 ら ない よ うにす る こ と とP'Rを
す るこ とな ど, ス リーパ ーに きわ め て 近 い発 想 が み られ
る。
と して プ ロ フ ァ ー ジ形 質 転 換 法^<30)>が
知 られ て い る。
本稿を掲載す る機会を与 えて下 さった京都大学食糧科学研究
所 ・木村光教授 に深 く感謝致 します。
IV.
類 縁 の プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー
文
1.
λSV2
λSV2は
大 腸 菌 染 色 体 に組 み 込 まれ て存 在 し うる プ ラ
ス ミ ドベ ク ター で あ る (図12)^<25)>。
λのattを
もち, こ
の部 位 で 染 色 体 に組 み込 まれ る。λ 由来 のPR-P-P遺
伝
子 は, プ ラス ミ ド状 態 での み 働 き, DNA自
己複 製 を行
な う。SVgpt部
大 腸 菌 gua
X遺
分 はSV40由
来 のDNAと
1)
伝 子 とか らな り, 動 物 細 胞 で の 選 択 マ ー カ ー と な
2)
3)
4)
る。
λSV2は int, xis,
cI_<857>な
ど溶 原 化 に必 要 な遺 伝 子 を
もつ 特 殊 な 宿 主 に の み組 み込 め るが, そ の際 にパ ッケ ー
5)
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