ショートレビュー生物界間接合大腸菌と酵母の接合の分子機構吉田和夫・西川正信原核生物の大腸菌と真核生物の酵母菌とはそれぞれの生物界に特徴的な細胞構造と性サイクルをもっている。最近，大腸菌と酵母が接合し，遺伝子が大腸菌から酵母へ移行，伝達されることが見つかった。この原核・真核生物間接合と，伝達された遺伝子DNAと Database Center for Life Science Online Service 主染色体との相互作用の分子機構について，細菌接合やTiプ宿ラスミドの植物への伝達とを比較しながら紹介する。原核生物の性の起源は30億年前の始生代 a）。次いで接合管が形成され，プラスミドの一方のに，減数分裂を伴う真核生物の性は10億年前の原生代 DNA鎖はじめにの特定配列oriTでニックが入り，5'方向からに始まるといわれている。原核生物である大腸菌の性は受容菌側へ1本鎖DNAの F因子のようなエピソームにより決定されていて，そのて移行鎖および残留鎖を鋳型としてDNA合接合も一方向的である。一方，真核生物である酵母菌に菌，供与菌内で進む（図1b）。最終的には完全な環状プ移行が起こる。それと平行し成が受容は高等動植物のように明確な性の分化があり，無性増殖ラスミドが複製され，接合が完了し，供与菌と受容菌は可能な接合子が貧栄養をシグナルに減数分裂により配偶分離する。受容菌はプラスミドを受取り，トランスコソ子に相当する胞子をつくり，発芽した両性細胞が同等にジュガントとなる（図1c）。自己伝達性プラスミドは最融合して接合子を形成する。小限mob，tra，oriT,oriV遺最近，大腸菌と酵母とが接合し，大腸菌から酵母菌へ DNAが移行する現象が見いだされ1-5)，遺伝子の水平伝達を示すものであり，生態進化学的にもおおいに興味を oriT特伝子群が必要で，mobは異的ニック酵素で，traは多数の遺伝子群の総称で，性繊毛形成，接合管形成，接合制御に関与する遺伝子からなっている。oriTはmobの酵素により認識切断プラスミドの複製開始もたれている。この生物界間接合について，分子生物学され移行開始する点で，oriVは的データの蓄積があることもあり，筆者らの研究を中心点である。mobとtraはに紹介したい。説明の都合上，まず細菌，とくに大腸菌ずしも同じプラスミド上になくてもよく，別のプラスミの接合について簡単に触れたい。トランスに機能するので，必ド（ヘルパー）上でもよい。図2（a）に示すようにF因子には挿入配列IS， γδ（Tn1000）があり，これを介して Ⅰ ．細菌一大腸菌の接合伝達6）大腸菌染色体に組み込まれてHfrとなり，染色体全体を可動化することはよく知られている。プラスミドの細菌内共存性は不和合性遺伝子incが大腸菌のF因子の接合伝達を一般化した模式図が図1 である。接合伝達プラスミドをもつ供与菌（雄）からのめていて，同一inc種性繊毛を介して，受容菌（雌）とペアが形成される（図1 のヘルパーがB細胞に自己伝達し，Bの Kazuo Yoshida，Masanobu of Molecular Mechanism 【原核 60 Nishikawa， Science,Hiroshima 広島大学理学部植物学教室（〒724東 University,Kagamiyama,Higashi-Hiroshima of Trans-kingdom Conjugation between 広島市鏡山1−3−1） 724,Japan] Escherichia ・真核生物間接合】【伝達性シャトルプラスミド】【性進化】 coli and 決は共存できない。しかし，細胞A Yeasts ［Botanical 同incプラスミ Institute，Faculty 生物界間接合 61 ドをC細胞へ伝達することが可能で，これを図1の通常の二親接合に対して三親接合（triparental mating）よぶ。このヘルパーはいずれBかとら脱落する。 Ⅱ ．原核・真核生物間接合大腸菌と酵母の接合2∼3）原核・真核生物界間接合用に筆者らの構築した伝達性 ’ シャトルプラスミドの一部を図2（b）に示す。大腸菌で働くmob，oriT,oriVとく複製配列ARS，マーカー遺伝子，酵母で働動原体CEN,マーカー遺伝子などから構築されている。真核生物で働く遺伝子は白抜きブロックで示されている。これらプラスミドはヘルパー上の traとmobのトランス機能によって可動化される。すなわち，プラスミドは種属・生物界間障壁を越えて可動化 Database Center for Life Science Online Service する機能と移動DNAの図2（b）安定化維持機能が必要である。のプラスミドを形質転換で導入した大腸菌と酵母の接合伝達を行なった結果のまとめが表1である。接合は大腸菌で使われるメンブレンフィルター法を使用した。表1からわかるように，栄養要求性酵母から非要求性酵母が出現するが（No．1，2，6∼8），oriTやヘルパーやプラスミドがないと，この出現は見られない（No．3∼5）。これは大腸菌から酵母ヘプラスミドが接合伝達されることを示している。この結果を分子レベルで確認するために，出現した酵母トランスコンジュガントからDNAを抽出し，サザソブロット解析を行なった。確かにプラスミドがどのトランスコンジュガントにも存在した（図3a）。また，継代培養したトランスコソジュガント酵母からこのプラスミドを抽出し，大腸菌を形質転換し，形質転換体から抽出したDNAを解析した結果は，プラスミドは機能的にも構造的にも変化していないことを示している。これらのプラスミドは富栄養培地で培養することでキュアリング（curing：プラスミドを宿主から除去すること）できるが，まれにキュアリングできないトランスコンジュガントが出現する（表1のNo． 2）。この酵母のDNAのが図3（b）図1． (a) (b) 物理的接触と対合：tra遺伝子発現による性繊毛形成と凝集塊中でのペア形成 DNA移行と相補鎖合成：traによる接合管形成， mobによるoriT部位のニックと5，端からの1本鎖 DNAの移行。移行鎖，残留鎖の相補鎖合成，再環状化。DNA，RNAポ（c）細菌の接合過程リメラーゼ，DNA結合蛋白質はパルスフィールド電気泳動結果で，大部分はプラスミド伝達前の酵母との明瞭な差は認められないが（レーン1，3），明らかに新しいバンドの出現したトランスコンジュガント（レーン2）が一株得られた。前者はプラスミドのURA3遺伝子のみが，後者はプラスミド全体が染色体に組み込まれていることが，図3（c）のサザンプロットの結果からわか宿主染色体由来，かっこ内はF因子遺伝子名。プラスミドの安定化とトランスコンジュガントの分る。さらに組込み機構を知るために，トランスコンジュ離。ガントのURA3遺伝子座付近の構造を解析した（図 61 Database Center for Life Science Online Service 62 蛋白質核酸酵素 Vol.38 No.1 （1993）図2．Fプラスミドの遺伝子地図（a）と原核・真核生物間接合用シャトルプラスミドの構造（b）2 5,10）（a）oriTは伝達開始起点，oriVは複製開始起点，mobはoriT特異的ニック酵素， traは伝達に関与する遺伝子，finは稔性抑制遺伝子，phiはファージ抑制遺伝子， incは不和合性遺伝子，IS， γδ（Tn1000）は挿入配列，内部のサークルはkbスケール，内部円弧は他のincFⅠ ，FⅡ タイププラスミドとの相同領域を示す。挿入配列と大腸菌染色体に相同組換えにより，染色体へ組み込まれ,Hfr菌となる。F因子はincFIタイププラスミド。 (b)ARS1,CEN4,LEU2,TRP1,URA3, GAL10-proは，それぞれパン酵母の複製配列，動原体，ロイシン合成，トリプトファン合成，ウラシル合成，ガラクトース資化性遺伝子プロモーターを示す。 GUSはグルクロニダーゼの遺伝子， NPTIIはネオマイシンポスホトランスフェラーゼ遺伝子，Km「，Tc「はカナマイシソ，テトラサイクリン耐性遺伝子を示す。他は（a）に同じ。LBとRBはTi プラスミドのT-DNAの境界配列。白抜きブロックは真核生物で機能する遺伝子を示す。pAY-GUSは発現用，pBASG は動物用プラスミド。pAY100シリーズはincPタイプ，pAY200シ incQタイププラスミド。 62 リーズは Database Center for Life Science Online Service a）curable型およびnon-curable型生物界間接合表1．大腸菌と酵母の接合 63 のトランスコソジュガントの出現頻度は受容菌あたりの出現トランスコンジュガント数で表わしてある。キュアリングは完全栄養培地で12時間行なった。出現頻度のあとの［］内の記号はプラスミド型［P］か染色体組込み型［C］かを示す。 b）（）内は大腸菌または大腸菌ミニセルの保持するプラスミドを示す。 c）プラスミドpRK2013，pRH210，pRH220はtra，mobを HB101，J53，P678-54はもつ可動化用ヘルパープラスミドを示す。大腸菌で最後はミニセル生産菌。YNN281はトリプトファン，ヒスチジン，ウラシル要求性，YN3はトリプトファン，ロイシソ，ウラシル要求性パン酵母。D1−15はウラシル，ヒスチジン要求性のクルーベリ酵母。 d）プラスミドYRp7は上記ヘルパーで可動化されるoriTをもたない非伝達性プラスミド。 e）ミニセルは通常，核（核様体）をもたないが，プラスミドは保持できる。 No.3，7，12,13，14は二親接合，それ以外は三親接合（triparental mating）。 3d）。パルスフィールド電気泳動でバンドシフトを生じ後（b），（c）のプロセスに進むと考えられている。図4 ないトラソスコソジュガソトからは全部5．5kbのURA3 に示すように，大腸菌・酵母間の接合でも液体培地でのを含むBamHI断接合には凝集塊形成は必須で，これを抑制すると接合が片しか見られないが（レーソ1∼3,5），バンドシフトのある酵母では，15，11，3，1．5kbの4個阻害される。この凝集には大腸菌と酵母の細胞表層物質のBαmHI断片が検出された（レーン4）。このことから，も関与しているらしい。図3（e，f）に示すような組換えが原核・真核生物間接合の際に起こったと考えられる。すなわち，染色体の ura3-52とプラスミドのURA3と pAY201（図2参照）は酵母での複製配列ARSをもっていないので酵母内では増殖できないが，酵母へ伝達が2回組換えによりされたプラスミド遺伝子が一過発現して，図4のような入れ替わるか（図3e），接合時にプラスミドが多重複製しマイクロコロニーを形成することを見いだした。この接て2回組換えで入れ替わり（図3f），バンドシフトを起合をabortive こすほど大きなDNA挿 conjugationとよんでいる。入となった。また，形質転換に以上の大腸菌とパン酵母の接合の結果を推測もまじえ比べて接合伝達では2回組換えが起こりやすいのは接合て模式的にまとめたのが図5である。大腸菌内の伝達性伝達時のDNA構プラスミドのtra遺造の相違による可能性が高い（未発表）。大腸菌どうしの接合では図1（a）に示すように性繊毛による凝集塊が形成され，その中でペアができ，その伝子の働きで酵母菌と接着，凝集塊を形成し（図5a），その中で対をつくり，接合管を形成する。mobの作用によりoriT部位で切断され，5'方 63 蛋白質核酸酵素 Vol.38 Na.1 （1993） Database Center for Life Science Online Service 64 図3． (a) (b) トのDNA,4は (c) (d) 解析2，3）伝達前の酵母DNA，左端ローマ数字は染色体番号。（b）のサザンプロット。1∼4はプローブにURA3のないpAY201（pKT230）を，5∼8はpAY201を使用。（b）のトラソスコンジュガント酵母DNAのBamHIダイジェストのサザンプロット。1∼3，5はバンドシフトのなかったトランスコソジュガント，4は（b）の2のバソドシフトのあったトランスコンジュガント，6は伝達前のYNN281酵母からのDNA。 (e) (f) トランスコンジュガソト酵母のプラスミドDNAの pAY101を伝達された酵母DNAのサザンブロット。1は対照，2，3はトランスコンジュガント，4,5は通常の形質転換体，6，7は伝達前の酵母，8，9はpAY101のDNAを示す。奇数はPstI処理し，プローブはpAY101。アリングされないトラスコンジュガソト酵母の電気泳動核型。1∼3はpAY201伝達で得られキュたトランスコソジュガン（d）の1∼3，5の（d）の4の向から1本鎖DNAはプロ一ブはpAY201。トランスコンジュガントの説明図。H，BはHindⅢ トラソスコソジュガントの説明図。H，Bは酵母内へ入り．核膜を通過し核へ，BamHI切断個所。chrV：第5染色体。（e）に同じ。 ARSをもっていなければ，一過性発現してマイクロコ移行し，そこで相補鎖が合成されて再環状化して元のプロニーを形成するが，最終的には消失する（図5d，eI）。ラスミドと同じ構造になる（図5b，c）。プラスミドが ARSが 64 あればプラスミドとして安定保持されて，キュ Database Center for Life Science Online Service 生図4．物界間接 65 合大腸菌と酵母の接合凝集とマイクロコロニー形成4）（a）大腸菌と酵母の凝集（左）と凝集抑制。（b）（a）の左の顕微鏡写真。（c）（a）の右の顕微鏡写真。（d）ARSのないプラスミド伝達と一過発現によるマイクロコロニー形成。大きいのが正常コロニーで，周りの小さいコロニーがマイクロコロニー。アリング可能な正常コロニーを形成する（図5d，eⅡ ARSの）。 Ⅲ ．原核・真核生物間接合とTiプ有無にかかわらず2回組換えにより染色体に組ラスミド系の類似性7）み込まれることが低頻度で起こり，キュアリングされない正常コロニーを形成する（図5d，eⅢ ）。酵母受容菌については何もわかっておらず，菌株によって受容能に大きな差があるが，遺伝的にはまだ不明である。このような接合はパン酵母以外の，系統分類学的にもアグロバクテリアによる植物腫瘍（クラウンゴール）形成は古くから知られている現象である。これはこの細菌の巨大TiプラスミドのT-DNAの植物細胞への伝かなり離れたクルーベリ酵母4,5)や分裂酵母（Sikorski：私達によることが最近，分子生物学的にも明らかになって信）と大腸菌のあいだでも起こることが明らかになってきた。このプロセスを模式化したのが図6である。植物いる。表1のNo．9∼11は傷害が刺激となり，細菌が植物に接着し，virA，virGをクルーベリ酵母の場合を示している。面白いことにパン酵母のARSのないpAY201 でも正常コロニーを形成するところから，このプラスミ活性化する。これが他のvir遺伝子群を活性化し，virD 酵素により1本鎖T−DNAが切り出され，virEの蛋白質ドのどこかの個所がこの酵母のARS機能を示すものとと結合して植物細胞内に移行し，核で染色体に組み込ま考えられる。また，パソ酵母のCEVがあるとプラスミれるという。T-DNAのドがキュアリングしやすくなるなど興味深い現象が見らは上述の大腸菌と酵母の接合にきわめて類似している点れる。核（核様体）をもたない大腸菌ミニセルと酵母の接台を試みたのが表1のNo．13でホルモン遺伝子の発現により，植物細胞は異常増殖して腫瘍化する。この一連の過程に，ミニセルから酵母へのがある。Tiプラスミド自身伝達性プラスミドで，その traの作用で他のアグロバクテリアへ伝達される。vir プラスミド伝達を示すが，まだ完全とはいいがたいとこがtraのろがある。ア間に伝達するという最近の報告もある8）。原核・真核働きをしてIncQプラスミドをアグロバクテリ生物間接合が高度に進化適応したのがTiプラスミド伝 65 66 Vol.38 No.1 （1993） Database Center for Life Science Online Service 蛋白質核酸酵素図5．大腸菌と酵母の接合過程3）二親接合のみ示し，三親接合は示していない。達系なのかもしれない。である。このことが図2の筆者らのpAYベ DNAのRB，LBがクターにT− 入っている理由である。残念ながらまだこの系の確立には至っていない。現在では原核・真筆者らがこの一連の研究を開始したのは，核生物間接合も確立されてきたので，大腸菌から直接動酵母の接合現象の研究を通して性の起源・進化に興味をおわりに植物へ伝達する系の開発の試みに重点を移しつつある。もっていたことと，アグロバクテリアから酵母へのT− DNA伝生物界間接合による遺伝子の水平伝達の生物学的意義達系の開発を試みていたことによる。この系がや応用については，すぐにさまざまなことが考えられよ確立されれば分子生物学的手法が駆使できる酵母によう。生物学的意義の考察や応用はもちろんたいせつであり，植物細胞よりも明解な結果が得られると考えたからるが，今はこの性現象の自然界での存在例をより多く確 66 物界間接 67 合 Database Center for Life Science Online Service 生 LB，RBは図6・アグロバクテリアから植物へのT−DNA伝達機構それぞれレフトボーダー，ライトボーダー，EはvirE遺伝子産物の1本鎖DNA結合蛋白質，D2はvirD 伝子産物のDNAニック酵素，● はvirB遺伝子の膜蛋白質，cenは動原体，telはテロメア，？は予想を遺示す。？は促進制御，→ は遺伝子発現，物質の移動， ⇒ は移行結果を示す。認していくことがたいせつであろう。現在までに知られている種・属あるいは生物界を越えた代表的接合現象の関係を系統関係と関連させてまとめたのが図7である9）。この図の矢印の広がりが今後の研究の進展によりどうな 3)Nishikawa,M.,Suzuki,K.,Yoshida,K.:Curr. Genet.,21,101-108(1992) 4)Nishikawa,M.,Inomata,K.,Sekito,T.,Suzuki, K.,Yoshida,K.:in Tubigen Endocytobiology University 5)Inomata,K.,Nishikawa,M.,Yoshida,K.: っていくか興味深い。．Mol．Microbiol．，印刷中 6)Willets,N.,Skurray,R.:in 文 V,p.105, Press(1992) 献 Salmonella Escherichia coli and typhimurium(ed.Neidhardt,F. C.),vol.2,pp.1110-1133,Am.Soc.Microbiol., 1)Heinemann,J.A.,Sprague,G.F.J.:Nature, 340,205-209(1989) 2)Nishikawa,M.,Suzuki,K.,Yoshida,K.:Jpn. Washington,D.C.(1987) 7)Ream,N.:in ModernMicrobial Genetics(eds. Streips,N.W.,Yasbin,R.E.),pp.431-453, Wiley-Liss,New York(1991) 67 Database Center for Life Science Online Service 68 蛋白質核酸酵素 Vol.38 No.1 （1993）図7．生物系統樹と遺伝子の生物界間接合，生物界内接合による伝達矢印は伝達方向を示し，系統樹は三生物界説による無根系統樹。 8)Beijersbergen,A.,Dulk-Ras,A.D.,Schilperoort, R.A.,Hooykaas,P.J.J.:Science,256,13241327(1992) 9)Hirsh,P.R.:in Bacterial Genetics in Natural Environments(eds.Fry,J.C.,Martin,J.D.), pp.31-40,Chapman and Hall,London(1990) 10)Shapiro,J.A.:in DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes(eds.Bukhari,A.I., Shapiro,J.A.,Adhya,S.),p.671,Cold Spring Harbor Laboratory(1977) お知らせ教育講座細胞培養コース・セミナーと実習対象者：企業などにおいて新たにバイオテクノロジーに関する研究開発に携わるもの開講期間：平成5年3月1日（月） ∼6日（土）開講場所：実習場所北里大学衛生学部2号棟3階パイオ実習室セミナー場所北里大学衛生学部2号棟6階セー室ミナ総合討論かながわサイエソスパーク会議室募集人員：20人セミナー・実習のテーマおよび講師3 無菌操作と細胞培養柴忠義（北里大学衛生学部）培養一般一その基礎技術と応用黒田行昭（麻布大学環境保健学部）昆虫（ショウジョウバエ）細胞培養と細胞への遺伝子導 68 入三宅端（三菱化成生命科学研究所）トリ初代培養細胞と細胞への遺伝子導入ニワ伊庭英夫（東京大学医科学研究所）植物細胞培養と細胞への遺伝子導入島本功（植物工学研究所）実習／無菌操作，代培養●継代培養法の手技，細胞株への遺伝子導入，導入された遺伝子産物の解析柴忠義（北里大学衛生学部）受講料：140，000円連絡先：（財）神奈川科学技術アカデミー教育部教育研修科〒213川崎市高津区坂戸3-2-1 かながわサイエンスパーク西棟6F Tel.044-819-2033,FAX044-819-2026