構造生物学四方山話（２００３年バージョン）神田大輔（九州大学・生体防御医学研究所）だ「構造生物学」という便利な言葉が生まれる以前から，タンパク質の構造生物学的研究まを行って来た私の経験に基づいて，構造生物学に関する話題をいくつか提供します。物事が１００％正しいことはあり得ません。個人の置かれている状況で変わりますし，今は正しくとも一年後には判断が変わることもあり得ます。というわけで，以下は２００３年において７５％くらい確かな話です。外からみた構造生物学のイメージいわゆる「構造生物学」を生業にしていない人達からは，「構造生物学分野」はどのように見られているのでしょうか？雑誌にはコンピュータグラフィックスのきれいなタンパク質の絵が溢れているし，インパクトファクターの高い雑誌に掲載されることが比較的多いと見なされて，おいしい学問分野であると思われているのではないでしょうか？羨ましい反面，何が面白くて立体構造決定をしているのか？と思っている人も多いはずです。一見何の脈絡もなく次々にいろいろなタンパク質を対象とするので，学問に対する哲学というものがないのではないか？構造生物学研究者は便利屋にすぎないと，心の片隅で思っていませんか？生物関係の研究者は二種類に分類できます。一番目の分類の人はタンパク質をただの丸や四角で表わして，「加水分解酵素」のような現象論的な名前をつけて満足できる人です。もっと高次の生命現象を研究したいので，要素としてのタンパク質はただの丸や四角で良いのです。これに対し，二番目の分類の人はタンパク質がどのように特定の物質を見つけて，どんなふうに加水分解するのかをそのカラクリまで考えないと満足しない人です。生物というよりは，化学や物理的な考え方が好きです。この二つの立場は生物学研究の本流ですが，この二つをつなぐ糸はそれほど太くないというのが印象です。立体構造決定しながら，ノックアウトマウスをつくるような新しい研究スタイルがないものかと思いますがいかがなものでしょう？最高級 NMR マシンと最強 F １マシン 12 趣味のタンパク質昆虫採集立体構造解析技術の現状体の構造において，二つの球状タンパク質が表面で接触してい２００３年現在，X 線結晶解析と NMR 解析に関しては，方法論自るというイメージが普通ですが，ある球状タンパク質に他のタ体は完成しているといってよい段階にあります。今はハイスンパク質が巻き付いているような構造もあります。この場合，ループット化や自動化を目指した技術開発の段階です。一方，巻き付いている側のタンパク質は単独で発現しても立体構造は電子顕微鏡を用いた方法には二次元結晶を用いた電子線回折と形成できないのが普通です。イメージ処理を中心とする単粒子像解析があります。どちらも，タンパク質調製成功の後は，結晶化する条件のスクリーニンまだ技術開発と同時に構造解析するような段階にあって，一般グや良い NMR スペクトルを測定するための溶液条件の検討をに汎用されるに至っていません。行います。これも試行錯誤を要する結構時間のかかるプロセスタンパク質の立体構造決定はどれくらいの時間がかかるでです。影響するパラメータの数が多いのですべての組み合わせしょうか？これはタンパク質調製から論文投稿までを考えるを試すわけにはいきません。短い期間（数ヶ月）で終えるにはか，立体構造決定過程のみを考えるのかで違います。全体の過経験と勘が必要です。あなたのタンパク質が生物学的に興味が程を考えると律速はタンパク質の調製にあって，大量（１０mg 程あればあるほど，この条件検討には時間がかかります。という度）で純粋（＞９９%）なタンパク質試料を得るのはそれほど簡単のは，生物学的に興味のあるタンパク質は他のタンパク質と複ではありません。さらに，タンパク質の精製ができて透明な溶雑に相互作用するのが仕事なので，純粋に取り出して高濃度の液ができたとしても安心はできません。得られたタンパク質が溶液を調製すると，相手がいないので自分同士でぺたぺたくっ立体構造をきちんと形成できずにランダム構造ということが意つく傾向があります。この現象をアグリゲーションと言います外に多くあります。遠心上清に回収されたから，収量が高いかが，アグリゲーションを抑える条件を見つけることが構造解析ら，というのは当てになりません。ランダム構造なら細胞内で成功のための鍵です。分解されるのが理屈ですが，昨今の大量発現系は壊されるより良い結晶が得られた，または良い NMR スペクトルが得られれも，速くタンパク質を作ってしまいます。昔は酵素活性を測っば，最終立体構造座標を手に入れるのは時間の問題です。今なていたので一応安心できるのですが，最近は機能未知タンパクら，半年程度が平均でしょう。今後自動化プログラムなどが改質やドメインを切り出すような実験をするので，良い評価シス良されれば，もっと短縮されるはずです。テムがありません。そこで面倒とばかり，生化学実験や結晶化スクリーニングにすぐに入るのは感心しません。一次元 NMR ス構造生物学の現状ペクトルを測定することをお勧めします。この場合は安定同位１９９０年代なかばあたりから，構造生物学という言葉が流布し，体ラベルは不要ですし，分子量や濃度の制限も立体構造決定に一般化しました。今や大学や研究所では，構造生物学の看板を比較すると大幅に緩いのです。無駄な一年間をたった１０分で回掲げる研究室が必要です。構造生物学がここまで繁盛している避することができるのです。わけは，タンパク質をあたかも巨視的な機械装置のように，そ蛇足ながら，タンパク質が立体構造を形成しないことが正しの機能をメカニカルな記述で説明できることにあります。例えいケースである場合もあることを指摘したいと思います。複合ば，タンパク質表面のくぼみにリガンドがはまり込んで，タン｜ October 2003 ｜ No.12 ｜ 13 パク質のコンホメーションが変化し，その結果，ドメインの相のあとに立体構造の絵が出てきて，ここにαへリックスがある，対配置が変化するというような見てきたような記述をします。あそこに水素結合がある，などの話を延々と聞かされます。結本当は，リガンドは結合と解離を繰り返したり，タンパク質に局，一番面白かったのは，コンパクトにまとめたタンパク質のはかなり大きな構造の揺らぎがあったりともっと動的な記述が機能に関するイントロだったりします。多分，発表者は与えら必要だと思うのですが，この程度のおおざっぱな記述の方が人れたタンパク質の立体構造決定に苦労して成功したのでしょ間にはわかりやすいのでしょう。ただし，酵素反応などはマクう。自分の構造がかわいくて，詳細のすべてを他の人に伝えたロな記述では不十分で量子化学的な記述が必要かもしれませいのでしょう。でも，ここに水素結合が３本あるというのは，ん。アミノ酸の一次構造を決めてみたら，セリンが３個続いて出て構造から機能が理解できると言いましたが，この場合のタンきましたというのと同じことなのです。パク質の機能とはその「生化学的な」機能を意味しています。立体構造がわかったときに，どのような問題に答えることがこれに対して，タンパク質の「生物学的な」機能があります。できるのかという問題意識が薄いことが話がぱっとしない原因例をあげると，ヘモグロビンの酸素結合が生化学機能ですが，です。ある課題に関してその立体構造から何が期待できるのか酸素運搬は生物学的機能です。タンパク質の構造のみからそのを論理立てて説明することが重要です。細かな話はすぐに忘れ生物学的機能を推定することはできません。ます。でも，構造がわかるとこんな新しい説明や理解が可能な最近は構造生物学を掲げるシンポジウムの集客能力は落ちてのかと聴衆を感心させれば成功です。きていると思います。言い換えると，タンパク質に興味がなければ，その構造生物学的話はつまらなくなっているのです。こ構造生物学の黄昏れ自体は構造生物学的手法が十分に浸透した結果なので喜ばし私は過去に生化若手の会の夏の学校で「バイオ NMR の黄昏」いことです。ただし，たとえタンパク質に興味があっても，なのタイトルで話をしたことがありました。実際に聴いた人の数おつまらない発表も多いように思えます。長々としたイントロは少なかったのですが，ポスターがあちこちに貼られたために，タイトルだけが有名になりました。話の趣旨は「タンパク質の NMR 解析はルーチンワークになって，バイオ NMR 研究者はスーパー高級テクニシャンにすぎない。しかも，対象に興味がなく，次々と対象を変えるのでこれでは昆虫採集だ」とバイオ NMR の凋落ぶりを黄昏（たそがれ）に例えたのでした。本当は続きがあって，だから「これからは本当の構造生物学を指向しようという」かなり建設的な内容でした。この状況は今も変わっていないと思います。スーパー高級テクニシャンからスーパーの文字が取れてしまうのもそう遠い未来ではないでしょう。研究をやるからには，皆，大発見を目指しています。些細な実験結果から思いもかけない新しい展望を開くのが本当の研究でしょう。構造生物学の分野では，立体構造情報を基に機能を「説明」するのが仕事です。したがって，本当に予想外の発見というのは少なく，有ったとしても他の分野に比べてスケールが小さいような気がします。このような理由から，私個人としては構造生物学をやっていることに関して軽い劣等感をもっています。立体構造決定屋の汚名を返上すべく，立体構造の視点と解析手法を出発点として，生化学や細胞生物学を融合した真の構造生物学を展開したいと願って，努力してきました。究極は「構造決定をしない構造生物学研究」です。禅問答のようですが，その真意はまた次の機会に。立体構造決定屋の愉しみとはいえ，私を含めて多くの人が立体構造決定を愉しんでいることは事実です。データを PDB（プロテインデータバンク）に登録すれば，人類全体の共有財産になり，未来永劫記録されメールオーダーで結晶構造解析 14 ます。膜タンパク質や巨大タンパク質複合体など，今でも困難な対象に挑んで世界で一番乗りをすることは快感です。タンパ体，巨大タンパク質複合体などは（網羅的な意味では）入ってク質の構造はなんてきれいなのでしょう。新しい構造を解析すいません。結局のところ，すでに述べたように，「そこにタンパることは珊瑚の海を泳いで新種の熱帯魚を発見するようなものク質があるから解析する」ではなくて，問題意識を持って「タです。そのタンパク質の立体構造を世界で初めて見ていることンパク質を選択して，立体構造決定＋αをする」気持ちが必要に対する感動があります。立体構造を見なければ到達することです。「＋α」に何をするかが，構造生物研究者のアイデンティが困難な作業仮説を生み出すことができます。ティになります。立体構造決定屋の秘かな愉しみ構造生物研究者との正しいつきあい方立体構造決定のための，X 線回折装置，NMR 装置，電子顕微大多数の人は自分の研究しているタンパク質の立体構造決定鏡は一台数千万から数億円もする高価な装置です。これらを使や構造生物学的研究をしてくれる共同研究先を探しているに違いこなす知識と技量を身につけることは，F１レーサーになったい有りません。でも，構造生物学をやっている人には，どのよプロの誇りがあるというものです。そして，苦労に苦労を重ねうなタンパク質でも溶けてさえいればやりますというような人て得られた結晶に X 線を初めてあてるとき，あるいは NMR スは多分いません。誰でもそれなりのポリシーを持っているものペクトルを初めて見るときには緊張します。そして，高分解能です。核酸に結合するタンパク質が好き，とかの事前リサーチの回折像やきれいな NMR スペクトルが目の前に現れたときはも重要でしょう。そして，構造を解いたらこの疑問が氷解する「生きてて良かった」と思います。といった具体的な提案が必要かと思います。構造決定のためのタンパク質の量や純度に関しては構造研究構造ゲノミクス登場者が要求するハードルはなかなか高いです。「たくさん出来てい以上の立体構造決定屋の愉しみを大幅に減ずる（と一般に思ますよ」と持ち込まれる電気泳動をみて，量と純度が両方ともわれている）のが，構造ゲノミクスプロジェクトの台頭です。不十分であることを説明することが普通です。大量のタンパク構造ゲノミクスはなるべくたくさんのタンパク質の立体構造を質を純度よく精製するにはそれなりのノウハウがあります。立ハイスループットでかつ網羅的に決めてしまおうとする国家レ体構造解析にはアフィニティタグを切り離す操作や，イオン交ベルのプロジェクトです。これはポストゲノムシークエンスと換カラム，ゲル濾過カラムの精製などがあり，意外にマニュアしてはきわめて自然な流れです。ただし，個人的にはもう少しル通りにはいきません。共同研究する場合，タンパク質の供給実現の時期が遅れて欲しかったとは思います。構造ゲノミクスを受ける約束をするのですが，結局，発現系をもらって自分のの目的は，テンプレートになるようなタンパク質構造をデータところでタンパク質調製をすることが多いことになります。こベースとして整備して，任意のタンパク質のホモロジーモデリうなると引き受けることができるタンパク質の数は限られてしングを可能とすることです。副産物としては立体構造決定の自まいます。そこで，タンパク質精製に励んで，タンパク質溶液動化のための装置やプログラムが開発され，市販されることにを持ち込めば結構気軽に予備実験をしてもらえるかもしれませあります。構造ゲノミクスが終了する近い将来には立体構造決ん。なんと言っても時間がかかるのがタンパク質の精製だから定手法は拡散して，誰でも使える一般的な技術になります。事です。最近は結晶化の予備的なスクリーニング実験のセット実，宅急便で結晶を放射光施設に送って，遠隔操作で結晶回折アップをするロボット（自動分注機）があるのでかなり気楽に測定を行うといったことがアメリカやヨーロッパでは始まりま引き受けることができます。可能なら，自ら予備的な結晶化スした。日本でも近い将来サービスが始まるでしょう。こうなれクリーニングを行って，結晶らしきものができるところまでをば高価な装置や技術も不要になって，結晶解析が生化学研究室やっておけばなおグッドです。の標準的な手法になると断言できます。（おまけ）構造ゲノミクス時代の構造生物研究者の立場立体構造決定用のタンパク質溶液の目安は以下の通りです。では，構造ゲノミクスの時代あるいはポスト構造ゲノミクスタンパク質の濃度は最低１０mg/ml 程度は必要です。濃縮は膜をつを見据えて，真の構造生物学者は何をすればよいでしょうかって遠心操作で行います。濃縮中に沈殿することもあるのでか？ホモロジーモデリングが可能になるとはいっても，ある注意。安定な pH で１０mM 程度の薄い緩衝液を使います。単に過特定のタンパク質の機能を知りたければ，ホモロジーモデルで去に使っているからという理由だけで，いろいろなものを添加は不十分であって，実際に立体構造解析を行う必要があります。するのは絶対に避けて下さい。溶解度を上げたり，安定性に必構造ゲノミクスの論理は１０個のタンパク質の発現を試して，１個要なものを最少限加えます。塩，DTT，アジド，グリセロール，の性質の良いタンパク質を選んで立体構造決定するということ EDTA などです。アフィニティタグは可能ならプロテアーゼ処理にあります。残りの９個については構造生物学者に任されていで除いておく方がよいでしょう。電気泳動で一本のバンドに見ます。また，構造ゲノミクスには膜タンパク質や基質との複合えても，アフィニティ精製のあとに，イオン交換とゲル濾過を｜ October 2003 ｜ No.12 ｜ 15 さらにかけておくほうがよい。特にゲル濾過には少量のアグリパク質が他のタンパク質やペプチドを認識するときに，結合がゲーションの除去，低分子物質の除去，バッファー交換などの弱くかつ特異性が広いケースがあり，生物現象としても重要で効能があります。ある。このような〈ゆるい相互作用〉の構造的基盤を解明することを目指している。」となります。自己紹介今回，タンパク質の一生に採択していただいた「ミトコンド私は以前は大阪にある生物分子工学研究所（BERI）にいましリア外膜透過装置の立体構造と通過中のポリペプチド鎖のコンたが，２００２年４月に現在の所属（九州大学）へ移りました。以ホメーション」はこのラインに沿った研究課題です。研究室に前は NMR を主な手法として用いていましたが， NMR に加えて新はついてはホームページ http://www.bioreg.kyushu-u.ac.jp/vsb/ たに X 線結晶解析を始めました。研究内容を２００字で説明する index.html を見て下さい。名古屋大学の遠藤斗志也さんと共同研と，「構造生物学的手法（X 線結晶解析と核磁気共鳴法，その他究でおこなったミトコンドリアプレ配列レセプター Tom２０分子の物理化学的手法）を用いたタンパク質複合体の構造と機能のの構造が二つの教科書の絵として採用されていて，これもホー解析。対象とするタンパク質は主に細胞表面と細胞内のシグナムページでご覧になれます。最後に月並みですが，大学院生（シル伝達に関与しているものが多いが，特に限定はしない。タンステム生命科学府）を募集していますのでヨロシク。「酩酊講演」余話：黎明期のユビキチンとプロテアソーム田中啓二（東京都臨床医学総合研究所）じめには第一回「タンパク質の一生」班会議は，昨年沖縄で開催された。その渦中の懇親会後に「酩酊講演：ユビキチンとプロテアソーム（と私）」と題して個人的な研究史を発表させて戴く機会を得た。その講演においては，「若い研究者達に向けてのメッセージを」という吉田領域代表者からの依頼を込めて，ユビキチンとプロテアソームの発見の経緯から現在に至るまでの研究の軌跡について，アルコールの余波もあり得意とする冗長・漫談講演を行った。その後，本ニュースレター誌の遠藤編集長から「その時の話が真面目な話より面白かった」という余り有り難くない理由写真１：右から A. Goldberg。筆者，J. DeMartino （１９８９年頃）で説得され，この小文を書く羽目になった。筆者は現役の研究者であり（と本人は思っている），まだ回顧談を上梓するほどに齢を重ねているつもりはないが，時の流れは疾風の如くで，このような原稿の依頼がくると，流石に「現役」と「引退」の狭間に身を委ねている境遇に自ら憐憫の情を禁じ得なくなる（と言っても引退まで未だ１０年近くを残しているので，簡単に朽ち果てるつもりはないが…）。余談はさておき，本題である「黎明期のユビキチンとプロテアソーム」，言い換えると「いかにしてユビキチンやプロテアソームが発見されたか」という小史について語ることにする。ユビキチンの発見については，「その発見は偶然であった」という巷間に流布していない逸話があ 16