(57)【要約】 【課題】 菌体塊形成能を有し、且つ例えば塩類濃度の 高い培地においても高効率で発酵できるチゴサッカロミ セス属に属する新規酵母、及び当該酵母菌株を使用する 発酵調味料の製造方法、及び流動床型のバイオリアクタ ーに関し、固定化担体を用いず、且つ高い浸透圧耐性を 有する新規酵母、及びこれを用いた発酵調味料の製造方 法を提供することを課題とする。また、比較的簡易な構 造で、連続発酵などの処理ができるバイオリアクター装 置を提供することを課題とする。 【解決手段】 菌体塊形成能（凝集能及び接着能を含 む）を有するチゴサッカロミセス（Zygosaccharomyce s）に属する新規酵母（生命工研菌寄第18252 号〔FERM P-18252〕）であることを特徴とする。 (2) 1 【特許請求の範囲】 【請求項１】 菌体塊形成能（凝集能及び接着能を含 む）を有するチゴサッカロミセス（Zygosaccharomyce s）に属する新規酵母（生命工研菌寄第18252 号〔FERM P-18252〕）。 【請求項２】 下記菌学的性質を有するチゴサッカロミ セス（Zygosaccharomyces）に属する新規酵母。 （ａ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地を用い、３０ ℃で２日間培養したときの菌体の形態： 栄養細胞の大きさ：４∼８μｍ。 栄養細胞の形態：卵型。 増殖の形態：出芽。 （ｂ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ寒天培地を用い、 ３０℃で４日間培養したときのコロニーの形態： 形態：円。 隆起：頭状。 周縁：円滑。 大きさ：１∼３ｍｍ。 色調：白色で不透明。 表面：円滑で半光沢。 （ｃ）炭素源資化性：ブドウ糖、ガラクトース、ショ 糖、マルトース、セロビオース、可溶性デンプン、ソル ビトール、メタノール、フラクトース、マンノース、マ ンニトール、デキストリンは資化し、ブドウ糖、マルト ースを発酵する。α-メチルグルコシド、トレハロー ス、乳糖、メリビオース、ラフィノース、イヌリン、ク エン酸ナトリウム、エタノール、キシロースは資化しな い。 （ｄ）耐塩性：２５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地にお いて生育可能である。 【請求項３】 請求項１又は２記載の新規酵母を用いる 発酵調味料の製造方法。 【請求項４】 管体の下方から上方に向かって水流を生 じさせる水流発生手段が具備され、且つ前記管体の上方 に、生体触媒によって処理された処理液が取り出される 取出口が設けられており、該水流発生手段によって生体 触媒が流動し被処理液を処理するバイオリアクターであ って、 前記管体の上方内部には、筒状の隔壁が管体の内周面に 対して間隔を空けて設けられており、前記隔壁の下端部 が取出口の下方に延出されていることを特徴とするバイ オリアクター。 【請求項５】 前記隔壁の周壁には、前記取出口と非対 向位置に、処理液が通過可能な通過口が形成されている 請求項４記載のバイオリアクター。 【請求項６】 管体の下方から上方に向かって水流を生 じさせる水流発生手段が具備され、且つ前記管体の上方 に、生体触媒によって処理された処理液が取り出される 取出口が設けられており、該水流発生手段によって生体 触媒が流動し被処理液を処理するバイオリアクターであ 10 20 30 40 50 特開２００２−２８１９５８ 2 って、 前記管体の内部には、該内部を区画する小孔板が上下方 向に多段状に設けられていることを特徴とするバイオリ アクター。 【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、菌体塊形成能を有し、 且つ例えば塩類濃度の高い培地においても高効率で発酵 できるチゴサッカロミセス属に属する新規酵母、及び当 該酵母菌株を使用する発酵調味料の製造方法、及び流動 床型のバイオリアクターに関する。 【０００２】 【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】酵母 は、古来より日本酒などのアルコール類の製造、醤油な どの発酵調味料の製造、パンの発酵などの各種の製造に 使用されている。例えば、醤油の醸造は、原料の蒸煮し た丸大豆若しくは加工脱脂大豆と焙煎した小麦とを混合 し、これに種麹を接種して製麹した後に食塩水を加え諸 味を造り、発酵・熟成後にこの諸味を圧搾することによ り醤油を製造している（本醸造）。しかしながら、諸味 を発酵・熟成させるには通常約６ヶ月と長期にわたって いるために、製造工程の大部分をこの発酵・熟成期間が 占めることになる。そのため、この発酵・熟成期間を短 縮することが可能になれば、醤油製造においてその製造 コストを大幅に削減することが可能になる。 【０００３】そのため、酵母による発酵工程を、バイオ リアクターによって効率的に行わせる研究がなされてい る。一般に、バイオリアクターを利用する発酵工程で は、生体触媒を固定化して使用する方法が採られてい る。 【０００４】生体触媒の固定化方法としては、不溶性担 体に担持させる結合法、生体触媒同士を結合させる架橋 法、高分子ゲルなどの内部に包み込む包括法、及びこれ らの複合法などが知られている。しかしながら、これら の方法では、固定化担体の購入、固定化担体の殺菌、生 体触媒の固定化工程、固定化担体の維持管理、固定化担 体の廃棄・処理などのような生体触媒を固定化する上で のコストが必要となる。また、生細胞（増殖細胞）の固 定化が必要となる発酵食品の製造やアルコールの連続生 産においては、菌体増殖又は原料液中の化学成分等によ る高分子ゲルなどの固定化担体の崩壊による目詰まりな どの問題が生じるため、一般には、多孔質無機材料等へ の担体結合法（物理的吸着）が用いられているが、多孔 質セラミック等の多孔質無機材料を固定化担体とした場 合には固定化される菌体量が少なく、発酵速度の向上や 微生物汚染への抵抗性などに問題がある。 【０００５】これに対して、菌体の分離・回収が容易に できる凝集性酵母を利用する方法では、酵母菌体の固定 化工程や、酵母菌体と発酵液との分離工程を省略できる ため、全体のシステムが簡略化され、低コストで且つ効 (3) 3 率の良い発酵生産が可能となる。 【０００６】これまで報告のある凝集性酵母菌株は、サ ッカロミセス・セレヴィシェ（Saccharomyces cerevisi ae）に属する酵母であり、これらは主に細胞融合技術や 遺伝子組換え技術によって育種されている。しかしなが ら、これらサッカロミセス・セレヴィシェを改良した菌 株では浸透圧耐性（耐塩性を含む）が低いため、塩類や 糖濃度の少ない原料を発酵原料として使用することはで きるものの、廃糖蜜（例えば、カリウム、マグネシウ ム、ナトリウムなどの塩類が０．５∼１．５Ｍ程度含ま れるもの）や、糖類の加水分解物といった高濃度の塩 類、糖類を含む液などを原料として使用する場合は、そ の原料を希釈する必要があり、このことが発酵・蒸留終 了後の廃液処理量の増大につながり、工業的な生産コス トを増大させる一因となっている。 【０００７】また、発酵法による工業的なエタノール生 産では、廃糖蜜等の安価な発酵原料を使用し、回分発酵 法や、酵母循環法及び固定化酵母法などの連続発酵法が 開発されて一部では実用化されているが、従来の技術で は酵母菌体を高密度に維持するため、その装置や工程が 複雑であり、維持管理の費用が高額となる。 【０００８】本発明は、以上のような点に鑑みて、固定 化担体を用いず、且つ高い浸透圧耐性を有する新規酵 母、及びこれを用いた発酵調味料の製造方法を提供する ことを課題とする。さらに、本発明は、比較的簡易な構 造で、連続発酵などの処理ができるバイオリアクター装 置を提供することを課題とする。 【０００９】 【課題を解決しようとする手段】醤油醸造に用いられて いるチゴサッカロミセス属の酵母が、高い浸透圧耐性を 有し、例えば、２．５Ｍ以上の塩化ナトリウム存在下及 び／又は５０％（Ｗ／Ｗ）のグルコース培地でも生育、 発酵を行うことができる。そして、本発明者らは、チゴ サッカロミセス属の酵母を含む醤油諸味から酵母をスク リーニングしたところ、所定の菌体塊形成能を有する新 規な醤油主発酵酵母菌株（チゴサッカロミセス・ルキシ ーＲ−２株（Zygosaccharomyces rouxii R-2株）と命 名：生命工研菌寄第18251 号〔FERM P-18251〕）を単離 した。この菌株の形成する菌体塊は硬く、通気撹拌によ る剪断力でも崩壊せず、菌体塊形成能（凝集能及び接着 能を含む）は市販の酵母菌より優れていた。ただし、そ の菌体塊は比較的小さく、バイオリアクターに使用する ことを想定した場合の沈降性は必ずしも十分ではなかっ た。そこで、本発明者らは、更に鋭意研究した結果、こ の菌株と醤油主発酵酵母とを細胞融合することにより、 耐圧性が高く、且つより大きな菌体塊を形成できる優れ た酵母を得、本発明を完成させた。 【００１０】すなわち、本発明は、菌体塊形成能（凝集 能及び接着能を含む）を有するチゴサッカロミセス（Zy gosaccharomyces）に属する新規酵母（生命工研菌寄第1 10 20 30 40 50 特開２００２−２８１９５８ 4 8252号〔FERM P-18252〕）を提供する。さらに、本発明 は、前記新規酵母を用いる醤油などの発酵調味料の製造 方法を提供する。 【００１１】また、本発明は、管体２の下方から上方に 向かって水流を生じさせる水流発生手段が具備され、且 つ前記管体２の上方に、生体触媒によって処理された処 理液が取り出される取出口６が設けられており、該水流 発生手段によって生体触媒が流動し被処理液を処理する バイオリアクターであって、前記管体２の上方内部に は、筒状の隔壁７が管体２の内周面に対して間隔を空け て設けられており、前記隔壁７の下端部が取出口６の下 方に延出されているバイオリアクターを提供する。さら に、本発明は、前記隔壁７の周壁であって、取出口６と 非対向位置に、処理液が通過可能な通過口８が形成され ている前記バイオリアクターを提供する。さらに、本発 明は、管体２の下方から上方に向かって水流を生じさせ る水流発生手段が具備され、且つ前記管体２の上方に、 生体触媒によって処理された処理液が取り出される取出 口６が設けられており、該水流発生手段によって生体触 媒が流動し被処理液を処理するバイオリアクターであっ て、前記管体２の内部には、該内部を区画する小孔板５ が上下方向に多段状に設けられているバイオリアクター を提供する。 【００１２】 【発明の実施の形態】以下、本発明の実施形態について 説明する。本発明の新規酵母は、上記のように、チゴサ ッカロミセス属の酵母を含む醤油諸味から、菌体塊形成 能を有する酵母菌株（チゴサッカロミセス・ルキシーＲ −２株（Zygosaccharomyces rouxii R-2株）：生命工研 菌寄第18251 号〔FERM P-18251〕。以下、「Ｒ−２株」 と略称する場合がある）を取得し、この菌株と市販され ているチゴサッカロミセス・ルキシー株（Zygosaccharo myces rouxii）（以下、「市販酵母株」と略称する場合 がある）とを細胞融合することにより創製することがで きる。 【００１３】細胞融合では、通常、両親株に対して変異 処理を行い遺伝的性質で標識することが行われるが、酵 母の優良な性質を損ねないという点から、標識処理は行 わない方が好ましい。また、細胞融合法は、公知の方法 を採用できるが、融合効率が高い点で高電圧パルス細胞 融合法が好ましい。得られた融合株を複数回培養した 後、より大きな菌体塊の形成できる菌株を選択すること により、本発明の新規酵母、特に醤油主発酵酵母として 好適な菌株を得ることができる。この新規酵母菌株を、 チゴサッカロミセス・ルキシーＺＲ−２ｆ株（Zygosacc haromyces rouxii ZR-2f株。以下、「ＺＲ−２ｆ株」と 略称する場合がある）と命名し、これを工業技術院生命 工学工業研究所に生命工研菌寄第18252 号〔FERMP-1825 2〕として寄託した。 【００１４】このチゴサッカロミセス・ルキシーＺＲ− (4) 5 ２ｆ株（FERM P-18252）と、両親株（市販酵母株及びＲ −２株）の菌学的性質を、実験農芸化学下第３版（東京 大学農学部農芸化学教室著、（株）朝倉書店発行）に基 づいて検討したところ、次の通りである。 〔ＺＲ−２ｆ株〕 （ａ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地を用い、３０ ℃で２日間培養したときの菌体の形態： 栄養細胞の大きさ：４∼８μｍ。 栄養細胞の形態：卵型。 増殖の形態：出芽。 （ｂ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ寒天培地を用い、 ３０℃で４日間培養したときのコロニーの形態： 形態：円。 隆起：頭状。 周縁：円滑。 大きさ：１∼３ｍｍ。 色調：白色で不透明。 表面：円滑で半光沢。 （ｃ）炭素源資化性：ブドウ糖、ガラクトース、ショ 糖、マルトース、セロビオース、可溶性デンプン、ソル ビトール、メタノール、フラクトース、マンノース、マ ンニトール、デキストリンは資化し、ブドウ糖、マルト ースを発酵する。α−メチルグリコシド、トレハロー ス、乳糖、メリビオース、ラフィノース、イヌリン、ク エン酸ナトリウム、エタノール、キシロースは資化しな い。 （ｄ）耐塩性：２５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地にお いて生育可能である。 〔市販酵母株〕 （ａ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地を用い、３０ ℃で２日間培養したときの菌体の形態： 栄養細胞の大きさ：４∼８μｍ。 栄養細胞の形態：卵型。 増殖の形態：出芽。 （ｂ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ寒天培地を用い、 ３０℃で４日間培養したときのコロニーの形態： 形態：円。 隆起：頭状。 周縁：円滑。 大きさ：１∼３ｍｍ。 色調：白色で不透明。 表面：円滑で光沢。 （ｃ）炭素源資化性：ブドウ糖、ガラクトース、ショ 糖、マルトース、セロビオース、可溶性デンプン、ソル ビトール、メタノール、フラクトース、マンノース、マ ンニトール、デキストリンは資化し、ブドウ糖、マルト ースを発酵する。α−メチルグルコシド、トレハロー ス、乳糖、メリビオース、ラフィノース、イヌリン、ク エン酸ナトリウム、エタノール、キシロースは資化しな い。 10 20 30 40 50 特開２００２−２８１９５８ 6 （ｄ）耐塩性：２５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地にお いて生育可能であるが時間を要する。 〔Ｒ−２株〕 （ａ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地を用い、３０ ℃で２日間培養したときの菌体の形態： 栄養細胞の大きさ：４∼８μｍ。 栄養細胞の形態：卵型。 増殖の形態：出芽。 （ｂ）１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ寒天培地を用い、 ３０℃で４日間培養したときのコロニーの形態： 形態：円。 隆起：頭状。 周縁：円滑。 大きさ：１∼３ｍｍ。 色調：白色で不透明。 表面：円滑で半光沢。 （ｃ）炭素源資化性：ブドウ糖、ガラクトース、ショ 糖、マルトース、セロビオース、可溶性デンプン、ソル ビトール、メタノール、フラクトース、マンノース、マ ンニトール、デキストリンは資化し、ブドウ糖、マルト ースを発酵する。α−メチルグルコシド、トレハロー ス、乳糖、メリビオース、ラフィノース、イヌリン、ク エン酸ナトリウム、エタノール、キシロースは資化しな い。 （ｄ）耐塩性：２５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地にお いて生育可能である。 【００１５】本発明の新規酵母は、それ自身が大きな塊 状になるため、酵母菌体の固定化工程や、酵母菌体と処 理液（発酵液）との分離が簡易に行えるため、特に、醤 油、みりんなどの発酵調味料の製造、日本酒、焼酎、ワ インなどのアルコール類の製造、糖ヌクレオチド生産時 の菌体の製造などにおける流動床式バイオリアクターで 好適に使用できる。更に、比較的高い塩濃度環境下でも 発酵を行うことができるので、種々の被処理液を発酵処 理することができる。尚、本発明の新規酵母は、パン、 味噌などの発酵に使用することも可能である。 【００１６】本発明の新規酵母は、これを培養して用い られ、発酵処理後に全液を交換する回分発酵システム、 被処理液を連続的に供給して発酵処理を行う連続発酵シ ステムの何れの方式にも使用することができ、特に、連 続発酵システムに好適に使用できる。 【００１７】連続発酵システムに使用されるバイオリア クターとしては、従来公知のものを使用してもよいが、 本発明に於いては、下記の流動床式のバイオリアクター を用いることが好ましい。具体的には、図１及び図２に 示すように、バイオリアクター１は、例えば、下方部２ ａ（導入部２ａ）、中間部２ｂ（生体処理部２ｂ）及び 上方部２ｃ（固液分離部２ｃ）の複数の筒部材が連結さ れた管体２と、管体２の下方部２ａに設けられた供給口 ３と、管体２の中間部２ｂ内に設けられた区画用の小孔 (5) 7 板５と、管体２の上方部２ｃに設けられた取出口６と、 管体２の上方部２ｃ内であって、上方部２ｃの中央部に 設けられた筒状の隔壁７とを備えている。 【００１８】管体２は、例えば、耐衝撃性ガラス、ステ ンレスなどの金属などの耐衝撃性を有する公知の素材か らなり、被処理液の処理量に応じて適宜の大きさに形成 されている。なお、管体２は、図１のように、下方部２ ａ、中間部２ｂ及び上方部２ｃの複数の筒部材が連結さ れた構成でも良いし、一体的な筒部材から構成されてい ても良い。供給口３は、例えば、管体２の下方部２ａの 底面に穿設されている。該供給口３には、空気と被処理 液を供給する供給路（図示せず）が取り付けられてお り、該供給口３から空気と被処理液が管体２の内部に供 給されるようになっている（図１の矢印）。尚、供給口 ３は、下方部２ａの周壁に形成されていてもよいし、 又、２以上の供給口３を設けて、空気と被処理液を別々 に供給してもよい。 【００１９】小孔板５は、管体２内部に充填される被処 理液と、生体触媒（例えば、本発明の酵母に係る菌体 塊）の全部又は一部と、が通過可能な大きさの孔を有す る部材であれば特に限定されず、例えば、１．５∼３ｍ ｍ、より好ましくは２∼２．５ｍｍの大きさのメッシュ 板（例えば、金属製網状板）などが例示される。この小 孔板５を設けることにより、管体２内部に於ける生体触 媒の濃度勾配及び／又は生成物の濃度勾配を形成するこ とができる。また、小孔板５を設けることにより、該小 孔板５によって区画された各領域で流体の対流が生じる （図１に矢印で示す）。小孔板５は１つでも構わない が、濃度勾配を良好に形成させるためには、小孔板５が 上下方向に多段に亘って設けられていることが好まし い。具体的には、図１に示したように、２ｍｍの網目の 大きさのメッシュ板５が２枚所定間隔を置いて設けられ ている。 【００２０】取出口６は、管体２の上方部２ｃの周壁の 中途部に設けられており、該取出口６から、処理がなさ れ後の処理液が取り出される。この取出口６には、キャ ップ１５が嵌着されており、その中央部には、排出用の パイプ１６が設けられている。本実施態様に於いては、 このパイプ１６が実質的に取出口６の役割を担い、この パイプ１６から処理液と空気が排出される（図１の矢 印）。このように下方から供給された空気が上方で排出 されることにより（空気の流れにより）、管体２内に は、下方から上方に向かって水流が生じるようになって いる（水流発生手段に相当する）。尚、水流発生手段 は、空気の給排による構成に限られず、例えば、管体２ 内に回転翼を設け、これを回転させて水流を生じさせる 構成などでもよい。 【００２１】次に、隔壁７は、例えば、管体２と一体的 に形成された円筒状体からなり、その上端部が管体２に 連結されている。一方、隔壁７の下端部は、自由端とな 10 20 30 40 50 特開２００２−２８１９５８ 8 っており、図１に示すように、取出口６の下端部６ａよ りも下方に延出されている。隔壁７は、中間部２ｂから 上昇する水流を受け入れるため、中間部２ｂと同じ開口 又は中間部２ｂよりも大きな開口を有し、図１に示すよ うに、隔壁７は、その開口部分１２が中間部２ｂの開口 部分１４を囲繞するように対向して配置されている（平 面から見た場合に、中間部２ｂが隔壁７に囲われるよう に配置されている）。かかる構成により、中間部２ｂか ら上昇する流体（処理液及び生体触媒）は、まず隔壁７ の内側にほとんどが集約される。さらに、この隔壁７ は、その外周面が、管体２の内周面に対して液が流れる 程度の間隔（隙間１１）を有して配置されている。 【００２２】また、隔壁７のうち、取出口６と非対向位 置（真向に向かい合った位置でないという意味である） には、少なくとも処理液が通過可能な通過口８が形成さ れている。通過口８としては、例えば、図示したよう に、取出口６の下端より下方又はそれとほぼ同高の位置 に通過口８の一部が位置する切欠部８が例示されるが、 その他、孔や複数の小孔の集合などを通過口８として構 成してもよい。通過口８が形成される非対向位置は、図 示したように、取出口６と正反対（１８０度水平回転さ せた）位置が好ましいが、取出口に対して直角位置（図 ２のＢで示す）などであってもよい。また、通過口８ は、正反対位置に１箇所形成されていれば十分である が、複数箇所に形成されていてもよい。 【００２３】尚、１０は、管体２内部に連通する操作口 を示し、隔壁７の内側に設けられている。１１は、操作 口を閉塞するキャップを示す。１２は、管体２内の温度 を維持するために温水などを通す通路を示す。また、管 体２の下方部２ａ、中間部２ｂ及び上方部２ｃの間など の各部の間には、水密用のパッキンが設けられている。 【００２４】上記バイオリアクター１は、内部に、 （廃）糖蜜などの被処理液と、ＺＲ−２ｆ株などの生体 触媒を充填し、空気を供給することにより、生体触媒が 流動し、被処理液を発酵、分解、生成などの生物的処理 を行い、得られた処理液は、取出口６から排出される。 この際、本発明のバイオリアクター１は、図１∼３（流 体の流れを矢印で示す）に示すように、生体触媒と処理 された処理液とが、水流発生手段により、管体２の上方 部２ｃに上昇する。上昇した処理液及び生体触媒は、隔 壁７の内部で流動し、処理液と一部の生体触媒が通過口 ８を通じて隔壁７の外部に流出し、隔壁７と管体２との 間（隙間１１）を通じて取出口６側へと押し出される。 この隙間１１は、隔壁７の存在によって、水流発生手段 による上方向きの水流の影響を受けにくいので、隙間１ １を通過する途中で、生体触媒は、自重により下降する こととなり、ほとんど処理液のみが取出口６へ移動す る。従って、処理液と生体触媒の分離を容易に行うこと ができる。 【００２５】被処理液としては、（廃）糖蜜、糖質加水 (6) 9 分解物など公知のものを用いることができる。また、生 体触媒としては、本発明の新規酵母（ＺＲ−２ｆ株）に 限られず、既知の凝集性酵母、担体に固定化された菌体 や酵素、ゲルなどに包括された菌体や酵素などを従来公 知のものを用いることもできる。 【００２６】 【実施例】以下に、細胞融合、菌体塊形成能に優れた融 合株の選択、選択した融合株の回分発酵および連続発酵 試験を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実 施例によりその技術的範囲が限定されるものでない。ま た、バイオリアクターなどの説明に於いては、上記実施 形態と同じ名称のものは、特段に説明がない限り、上記 実施態様と同様のものである。 プロトプラストの調製 プロトプラストの調製は、基本的には野田らの方法（Ag r.Biol.Chem.,54巻,2023頁(1990)）に準じて行った。す なわち、従来型バイオリアクター（市販酵母株が担持さ れた多孔質セラミック担体を使用）より排出された発酵 液の中から速やかに沈降する菌体塊形成酵母チゴサッカ ロミセス・ルキシーＲ−２株と、市販酵母株であるチゴ サッカロミセス・ルキシー（ビオック製、品名：醤油主 発酵酵母）をそれぞれ１０％のＮａＣｌを含む公知のＹ 8 ＰＤ培地１０ｍｌで３０℃で定常期初期（１×10 細胞 ／ｍｌ）まで振盪培養し、得られた菌体を滅菌した１０ ％食塩水で洗浄した。ついで、１．２Ｍのソルビトー ル、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のメルカプトエタノー ルを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７． ５）に懸濁した。この菌体懸濁液にザイモリエース溶液 （生化学工業（株）製）を終濃度１ｍｇ／ｍｌになるよ う添加し、３０℃で９０分間処理してプロトプラスト化 させた。そして、プロトプラストを遠心分離（１，２０ ０×ｇ）して集め、１．２Ｍのソルビトール溶液で３回 7 洗浄して、それぞれ５×10 プロトプラスト／ｍｌの濃 度で懸濁した。 【００２７】細胞融合 細胞融合は、高電圧パルス細胞融合法（電気細胞融合 法）で行った。すなわち、細胞融合装置（（株）島津製 作所製、品名：ＳＳＨ−１０）を用いて行い、融合条件 は、電極間隔１ｍｍ、交流周波数１ＭＨｚ、交流初期印 加電圧４０Ｖ、パルス幅５００μＳ、パルス電圧４５０ Ｖ（電界強度４．５ｋＶ／ｃｍ）、交流２次印加電圧４ ０Ｖとした。印加処理後のプロトプラスト懸濁液を３０ ℃で３０分間保温し、これをＳＤプレート（最少培地： ０．６７％のイーストニトロゲンベース、アミノ酸不 含、２％のグルコース、１．２Ｍのソルビトール、２％ の寒天）に０．１ｍｌ塗布し、２５℃、３∼７日間培養 して、プロトプラストを再生させた。ついで、この再生 した菌体を１５％のＮａＣｌを含む１０ｍｌのＹＰＤ液 体培地（ｐＨ５．０）に入れ、同培地５mlをＳＤプレー ト表面に添加後，生育してきたコロニー（菌体）を分散 10 20 30 40 50 特開２００２−２８１９５８ 10 させ，その０．５ｍｌを植菌し、３０℃で定常期に達す るまで（２∼３日）振盪培養を行った。この培養液を５ 分間静置後、浮遊している菌体を除去し、これに新たな １５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地１０ｍｌを加えて、 さらに３０℃で定常期に達するまで振盪培養を行った。 この操作を５∼９回繰り返して行い、菌体塊形成能の向 上した菌株の濃縮を行った。その後、沈降した菌体を、 滅菌処理した１５％の食塩水で３回洗浄後、１５％のＮ ａＣｌを含むＹＰＤプレートに塗布し、（１０００倍希 釈した懸濁液を０．１ml塗布する）、生育したコロニー を取得した。さらに、これらのコロニーを１５％のＮａ Ｃｌを含む１０ｍｌのＹＰＤ液体培地（ｐＨ５．０）に 植菌して（１コロニー植菌する）、３０℃、３日間振盪 培養し、菌体塊形成能を有するコロニー（ＺＲ−２ｆ 株）を選抜した。 【００２８】菌体塊沈降速度の評価 菌体塊の沈降速度の評価は、分光光度計（MILTONROY 製、品名：SPECTORONIC 20）による濁度（ＯＤ６６０ｎ ｍ）の減少速度により行った。供試菌株を１５％のＮａ Ｃｌを含むＹＰＤ培地１０ｍｌに植菌し、（凝集菌体の かさとして０．５mlを植菌する）、３０℃、４８時間振 盪培養し、これをボルテックスミキサー（iuchi 製、品 名：AUTOMATIC LABO.MIXER）で１０秒間撹拌後、経時的 に６６０ｎｍの吸光度変化を計測した。その結果を図４ に示す。尚、供試菌株は、市販酵母株、Ｒ−２株、上記 細胞融合で得られたコロニー（ＺＲ−２ｆ株）の３種を 用いた。 【００２９】市販酵母株では、６６０ｎｍの吸光度に変 化が認められず、又、Ｒ−２株では僅かながら変化が見 られたのに対して、ＺＲ−２ｆ株では６６０ｎｍの吸光 度が急速に減少していた。このことからＺＲ−２ｆ株 は、菌体塊が速やかに沈降することがわかった。又、視 覚によってもＺＲ−２ｆ株は、おおよそ直径０．５∼３ ｍｍ程度の菌体塊を形成していた。このＺＲ−２ｆ株の 菌体塊形成効果を明確にするため、Ｒ−２株、ＺＲ−２ ｆ株、市販酵母株を直径１８ｍｍの試験管に採り、それ らの菌体塊の様子を参考写真１に示す。参考写真１から も明らかなように、ＺＲ−２ｆ株は、Ｒ−２株に比べて はるかに大きい菌体塊を形成していた。また、Ｒ−２株 では、比較的小さいものの、試験管底面部の写真におい て菌体塊の形成が明らかに認められた。これに対して、 市販酵母株では、試験管側面部の写真はもちろん、試験 管底面部の写真においても菌体塊の形成は全く認められ なかった。この結果、ＺＲ−２ｆ株は、きわめて特徴的 な菌体塊形成能を有し、Ｒ−２株は、少なくとも市販酵 母株とは明確に識別できる菌体塊形成能を有することが 判明した。 【００３０】パルスフィールド電気泳動 次に、各供試菌株０．５ｍｌを、１５％のＮａＣｌを含 むＹＰＤ培地１０ｍｌで３０℃、４８時間振盪培養して (7) 11 得られる各菌体を、遠心分離器で集菌・洗浄して使用し た。試料の調製は、染色体ＤＮＡの断片化を防止するた め、可能なすべての過程をアガロースゲル中で行い、ゲ ルブロックを調整した。ゲルは、１％のアガロース（Bi o-Rad 社製 Pulsed Field Centrified Agarose）ゲルを 用い、泳動には０．５×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を 使用した。泳動は、Bio- Rad社製ＣＨＥＦ−ＤＲ III S ystem を用い、泳動電圧６Ｖ／ｃｍ、パルス間隔（開 始：ＩＮＴ）６０∼（終了：ＦＩＮ）１２０秒、パルス 角１２０度、泳動時間２２時間、槽内温度１４℃で行っ た。電気泳動後のバンドを参考写真２に示す。参考写真 ２からも明らかなように、Ｒ−２株、ＺＲ−２ｆ株、市 販酵母株ともに、ほとんど同一の染色体分離パターンで あった。ただし、Ｒ−２株及びＺＲ−２ｆ株では、市販 酵母株には認められない約８００ｋｂの位置に染色体Ｄ ＮＡが認められた。このことから、ＺＲ−２ｆ株及びＲ −２株は、同属菌株ではあるものの、市販酵母株とは明 らかに異なる菌株であることが確認された。 【００３１】実施例１ （ジャーファメンターによる回分発酵試験）上記細胞融 合によって得られたＺＲ−２ｆ株２０ｍｌを、前培養と して、１５％のＮａＣｌを含むＹＰＤ培地５００ｍｌで ３０℃、４８時間振盪培養した。その後１０分間静置し て培養液と共に沈降しない菌体を除去することによって 得られたＺＲ−２ｆ株の約５０mlを、固定化担体に担持 せずに、そのままの状態で発酵試験用培地（酵母エキス ０．５％、ポリペプトン１％、グルコース１０％、Ｎａ Ｃｌが１５％、ｐＨ５．０）１リットルが入れられたジ ャーファーメンター（東京理化器械（株）製、品名：MI NI FERMENTOR M-100）に充填し、３０℃で発酵させ、経 時的にそのアルコール濃度をガスクロマトグラフ （（株）島津製作所製、品名：ＧＣ−９Ａ）によって測 定した。その結果を図５に示す。１回目の発酵は若干遅 延時間が長いものの、順調に発酵は進み、発酵５日目に は３．７％（Ｗ／Ｖ）のアルコールが生成された。この とき非凝集性となった株が出現するものの、発酵終了後 には凝集塊が沈降し、繰り返し回分発酵が可能であっ た。また、繰り返し回分発酵の２、３回目には遅延時間 が短縮され、発酵３日目で３．８％（Ｗ／Ｖ）のアルコ ールが生産された。 【００３２】実施例２ （バイオリアクターによるエタノールの連続発酵試験） 実施例２− ．図６に示す形状のように、管体２０全体 が円筒状のバイオリアクター１００（仕様：下方部２０ ａが容量約７４ｍｌ、中間部２０ｂが内径（直径）４５ ｍｍで容量約２８６ｍｌ、上方部２０ｃが容量約６０ｍ ｌで総容積４２０ｍｌ）（東京理化器械（株）製、特注 品）を用いて、次の試験を行った。尚、このバイオリア クター１００には隔壁及び小孔板は設けられていない。 このバイオリアクター１００内に、発酵試験用培地（酵 10 20 30 40 50 特開２００２−２８１９５８ 12 母エキス０．５％、ポリペプトン１％、グルコース１０ ％、ＮａＣｌが１５％、ｐＨ５．０）１リットルを充填 し、上記実施例１と同様にして前培養したＺＲ−２ｆ株 の約５０mlを、固定化担体に担持せずにそのまま充填 し、通気量０．１ｖｖｍ、３０℃で２日間循環発酵させ た。その後、同培地を流速１０ｍｌ／ｈｒ∼２５ｍｌ／ ｈｒの速さ同バイオリアクター装置に供給して連続発酵 させた。経時的に生産された発酵液をサンプリングし、 このアルコール濃度をガスクロマトグラフ（（株）島津 製作所製、品名：ＧＡ−９Ａ）により分析し、アルコー ル生産性を測定した。その結果、菌体の生育と共に凝集 塊が増加したが、この増加した菌体塊が１８日目にはバ イオリアクターの取出口６に付着し、その取出口６の閉 塞が起こり、安定した連続発酵は不可能であった。 【００３３】実施例２− ．次に、上記実施形態で説明 したバイオリアクター１を用いて同様に連続発酵試験を 行った。すなわち、図１に示す形状のバイオリアクター １（仕様：下方部２ａが容量約７４ｍｌ、中間部２ｂが 内径（直径）約４５ｍｍで容量約２８６ｍｌ、上方部２ ｃが容量約２７０ｍｌで総容積６３０ｍｌ。隔壁７の内 径（直径）７０ｍｍ、各壁７の下端部と取出口６の下端 部６ａの高低差Ｈが約２０ｍｍ、隙間の幅約１０ｍｍを 作製した。尚、このものには、小孔板５は設けなかっ た。そして、これを用いて上記実施例２− と同様にし て循環発酵及び連続発酵を行ったところ、発酵液と、非 凝集菌体及び菌体塊との分離が速やかに行われ、取出口 ６の閉塞が起きることはなかった。また、非凝集性とな った株は発酵液と共に排出されるものの、菌体塊はリア クター内に保持され、凝集塊の増殖が観察されることか ら、融合株の安定性の欠如は問題とはならなかった。 【００３４】実施例２− の結果を図７に示す。アルコ ール生産性は発酵開始後、菌体塊の増殖と共に徐々に向 上し、２０日後以降において、約１．４ｇ／リットル・ ｈｒ以上（１リットルのリアクター反応槽によって１時 間あたり１．４ｇ以上のアルコールが生産されることを 意味する）を維持した。このことから、固定化担体を用 いなくても安定した連続発酵が可能であることがわか る。このときのエタノール濃度は３．８％（Ｗ／Ｖ）で あり、エタノール転換率は７４％であった。 【００３５】実施例２− ．さらに、菌体密度を増加さ せて連続発酵試験を行った。すなわち、菌体として、実 施例２− で得られた菌体塊のみを嵩容量約３０ｍｌ取 り出し、これを用いた以外は、実施例２− と同様にし て循環発酵及び連続発酵を行った。その結果を図８に示 す。これにより、エタノール濃度４．１％、転換率８０ ％に向上させることが可能であった。 【００３６】実施例２− ．さらに、実施例２− で得 られた菌体塊のみを嵩容量約６０ｍｌ取り出し、実施例 ２− と同じ条件で下方部２ａと中間部２ｂの間及び中 間部２ｂと上方部２ｃの間のそれぞれのフランジに目開 (8) 13 き２ｍｍのステンレス製メッシュ（小孔板５）をそれぞ れ介在させたバイオリアクター１（図１のもの）を用い ステンレス製メッシュの影響について検討を行った。そ の結果を図９に示す。ステンレス製メッシュを介在させ ることにより、生成エタノール濃度及びアルコール生産 性がステンレス製メッシュを介在させないものは１９日 間の発酵期間でほとんど上昇していないのに対して，ス テンレス製メッシュを介在させたものは速やかに向上す ることがわかる。これは、ステンレス製メッシュを介在 させることで菌体増殖の増加と排出菌体量の減少によ る、槽内菌体密度の上昇のためだと考えられた（発酵終 了後の凝集菌体量はステンレス製メッシュを介在させな いもので嵩容量約７０ｍｌ、介在させたもので嵩容量約 １２０ｍｌであった）。また、生成エタノール濃度及び アルコール生成速度ともステンレス製メッシュを介在さ せた方がばらつきが少なく、安定した発酵が可能であっ た。 【００３７】実施例３ （バイオリアクターによる超うす口生揚げ醤油の連続発 酵試験） 実施例３− ．本実施例では、下方部２ａと中間部２ｂ の間及び中間部２ｂと上方部２ｃの間のそれぞれのフラ ンジに目開き２ｍｍのステンレス製メッシュ（小孔板 ５）をそれぞれ介在させた点を除いては、実施例２− で用いたバイオリアクター１（図１のもの）と全く同じ ものを用いた。このバイオリアクターに、生揚醤油脱色 液（全窒素１．４１％、食塩分１７％、直糖分４．５ ％、アルコール１．６５％、ｐＨ５．１）１リットルを 充填し、上記実施例１と同様にして前培養したＺＲ−２ ｆ株の約５０mlを、固定化担体に担持させずにそのまま 充填し、通気量０．１ｖｖｍ、３０℃で２日間循環発酵 させた。その後、同生揚醤油脱色液を流速３０∼６０ｍ ｌ／ｈｒで同バイオリアクターに供給してエタノール濃 度が１％増加するように連続発酵させた。経時的に生産 された発酵液をサンプリングし、このアルコール濃度を ガスクロマトグラフ（（株）島津製作所製、品名：ＧＣ −９Ａ）により分析し、アルコール生産性を測定した。 その結果を図１０に示す。アルコール生産性は発酵開始 後急速に向上し、１４日後以降約１．１ｇ／ｌ・ｈｒを 維持し、固定化担体を用いなくても安定した連続発酵が 可能であった。 【００３８】実施例３− ．次に、バイオリアクター１ から小孔板５を取り外したバイオリアクター（即ち、実 施例２− と同じバイオリアクター）を用いた以外は、 上記実施例３− と同様の試験を行った。その結果を図 １０に示す。 【００３９】実施例３− ．実施例３− は、従来法で 行った。すなわち、実施例３− と同じバイオリアクタ ー１に、生体触媒として、市販酵母株を多孔質セラミッ ク担体（岩尾磁器社製、品名：セラミック担体）に担持 10 20 30 40 50 特開２００２−２８１９５８ 14 させた固定化担体を約４００ｍｌ（嵩容量）充填し、以 後、実施例３− と同様の試験を行った。その結果を図 １０に併せて示す。この固定化担体を用いた従来法で は、ＺＲ−２ｆ株に比して、アルコール生産性は約１／ ２倍であった。また、得られた発酵液は公知の発酵液 （品名：超うすくち生揚げ）との官能上の差は全く認め られなかった。 【００４０】実施例４ （バイオリアクターによる超淡口生揚醤油の連続発酵試 験）バイオリアクター（仕様：下方部が容量３０００ｍ ｌ、中間部が容量３０００ｍｌ、上方部が容量３０００ ｍｌで総容積９リットル）（東京理化器械（株）製、品 名：ＭＢＲＢ−３０３）を用いて、次の試験を行った。 尚、このリアクターには、下方部と中間部の間及び中間 部と上方部の間のそれぞれのフランジに目開き２ｍｍの ステンレス製メッシュ（小孔板）をそれぞれ介在させ た。このバイオリアクターに、上記実施例１と同様にし て前培養し，生揚醤油脱色液によって２日間３０℃で静 置培養（時々撹拌）することによって馴化したＺＲ−２ ｆ株の約２０００ｍｌを、固定化担体に担持させずにそ のまま充填し、生揚醤油脱色液９リットルを通気しなが ら３０℃で２日間培養した。その後、同生揚醤油脱色液 を流速９リットル∼２７リットル／日で同バイオリアク ターに供給して３０日間連続発酵を行った。経時的にア ルコール濃度を酸化法により測定し、アルコール生産性 を測定した。その結果を図１１に示す。 【００４１】アルコール生産性は発酵開始後から順調に 向上し、最高で１．４ｇ／ｌ・ｈｒを示した。安定した 連続発酵が可能であり、１日でバイオリアクター容量の ３倍量の発酵液を得ることができた。また官能上、得ら れた発酵液は従来法で得られるものとの差は見られなか った。 【００４２】実施例５ （バイオリアクターによる超淡口生揚の連続発酵試験） 図１２に示す形状のような、管体１２０全体が円筒状に 形成されたバイオリアクター１１０（仕様：内径（直 径）約３００ｍｍ、高さ約1500ｍｍ、総容積１００リッ トル）（東京理化器械（株）製，特注品）を用いて、次 の試験を行った。尚、このリアクター１２０の内部に は、小孔板５よりも大きな目開きの上面開口型の網籠３ ０が多段（６個）設けられている（直径２８０ｍｍで高 さ２１０ｍｍの底面付き円筒。６個のうち、下方から３ 番目のものは高さ２８０ｍｍ）。さらに、この網籠３０ のうち、図示した網籠３０の底面外側に、目開き１．５ ∼２ｍｍのステンレス製メッシュ（小孔板５）が設けら れている。また、このリアクター１１０の供給口３は、 被処理液用供給口３ａと空気用供給口３ｂに別けられて いる。さらに、取出口６は、管体１２０の上方に設けら れており、同様に、管体１２０の上方には、空気排気口 ３１が別途設けられている。尚、隔壁は設けられていな (9) 特開２００２−２８１９５８ 15 16 い。このバイオリアクター１１０に、生揚醤油脱色液１ ＊ 培地においても高効率で発酵処理ができるので、種々の ００リットルを充填し、上記実施例４と同様にして前培 被処理液を用いて発酵処理を行うことができる。さら 養したＺＲ−２ｆ株の約７０リットルを、固定化担体に に、本発明のバイオリアクターは、比較的簡易な構造 担持させずにそのまま充填し、通気量８．０リットル／ で、処理液と生体触媒とを分離することができる。 ｍｉｎ、３０℃で２日間培養した。その後、同生揚醤油 【図面の簡単な説明】 脱色液を流速５０リットル∼２００リットル／日で同バ 【図１】本発明のバイオリアクターの一実施形態を示す イオリアクター１１０に供給して約２２５日間連続発酵 縦断面図。 を行った。比較例として、従来法（同バイオリアクター 【図２】図１のＡ−Ａ線断面図。 １１０に、生体触媒として市販酵母株を多孔質セラミッ 【図３】バイオリアクターの固液分離部（上方部）を示 ク担体（岩尾磁器社製、品名：セラミック担体）に担持 10 す参考斜視図。 させた固定化担体を、約７０リットル（嵩容量）充填し 【図４】供試菌株の沈降速度を示すグラフ。 たもの）により、同様にして約５６日間連続発酵を行っ 【図５】実施例１の回分発酵試験に於ける発酵度合いを た。尚、従来法では、５６日以後は、発酵ができなくな 示すグラフ。 ってしまった。経時的にアルコール濃度を酸化法により 【図６】従来のバイオリアクターを示す縦断面図。 測定し、アルコール生産性を測定した。その結果を図１ 【図７】実施例２− の連続発酵試験に於ける発酵度合 ３に示す。 いを示すグラフ。 【００４３】アルコール生産性は発酵開始後から順調に 【図８】実施例２− の連続発酵試験に於ける発酵度合 向上し、１日でバイオリアクター容量の２倍量の発酵液 いを示すグラフ。 を得ることができた。得られた発酵液は従来法で得られ 【図９】実施例２− の連続発酵試験に於ける発酵度合 るものとの官能上の差は見られなかった。また、開始か 20 いを示すグラフ。 ら３週間後、運転を約２週間中断し、その後再運転した 【図１０】実施例３の連続発酵試験に於ける発酵度合い が、従来法と比較して復帰が早く、復帰後も順調にアル を示すグラフ。 コール生産性が向上し、安定した運転が可能であった。 【図１１】実施例４の連続発酵試験に於ける発酵度合い その後も断続的に運転を中断させたが、同様に復帰し を示すグラフ。 た。また、凝集性を有することで、漏洩菌の量が減少し 【図１２】実施例５で用いた本発明のバイオリアクター たために濾過性がよくなり、作業性が向上した。 を示す縦断面参考図。 【００４４】 【図１３】実施例５の連続発酵試験に於ける発酵度合い 【発明の効果】本発明に係る新規酵母は、自己凝集性が を示すグラフ。 高く、大きな塊状となるため、担体に固定化などしなく 【符号の説明】 ても、バイオリアクターなどを用いて効率的な発酵が可 30 １…バイオリアクター、２…管体、２ａ…下方部、２ｂ 能となる。特に、醤油などの発酵調味料の連続生産に好 …中間部、２ｃ…上方部、５…小孔板、６…取出口、７ 適である。また、本発明の新規酵母は、塩類濃度の高い＊ …隔壁、８…通過口、１１…隙間 【図２】 【図３】 (10) 【図１】 特開２００２−２８１９５８ 【図４】 【図６】 【図５】 (11) 【図７】 【図８】 特開２００２−２８１９５８ (12) 【図９】 【図１０】 特開２００２−２８１９５８ (13) 【図１１】 【図１２】 特開２００２−２８１９５８ (14) 特開２００２−２８１９５８ 【図１３】 ───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 7 (51)Int.Cl. Ｃ１２Ｍ Ｃ１２Ｎ //(Ｃ１２Ｎ Ｃ１２Ｒ (Ｃ１２Ｍ Ｃ１２Ｒ (Ｃ１２Ｍ Ｃ１２Ｒ (Ｃ１２Ｎ Ｃ１２Ｒ 識別記号 1/00 1/12 15/02 1/16 1:645） 1/00 1:645） 1/12 1:645） 15/02 1:645） (72)発明者 岡本 智美 佐賀県唐津市元石町１番１号 佐賀県醤油 協業組合内 ＦＩ Ｃ１２Ｍ 1/00 1/12 Ｃ１２Ｒ 1:645 Ｃ１２Ｎ 15/00 テーマコート゛(参考） Ｄ Ｂ Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA77 GA07 GA10 GA19 GA21 4B029 AA02 BB07 CC01 DA07 DC05 DC07 DF06 DG06 4B039 LB03 LC03 LG20 LQ24 4B047 LB07 LE01 LG56 LP01 LP19 4B065 AA72X AB02 AC20 BA08 BA22 BC24 CA06 CA42
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