● 解説 ● DNAチ ツプ技 術 とその 応 用 ゲノムの機 能解析 に向けて 君塚房夫 ・加藤郁之進 多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が進んでいる。DNAチ ッ プは,ス ライドガラスやシリコンなどの基板に多数のDNA分 子を整列させたマイクロアレ イであり,遺 伝子の発現や変異,多 型性などの同時解析に非常に有用である。この技術は, Database Center for Life Science Online Service DNA以 外の生体分子にも適用可能である。各種チップの作製,解 析システムが,米 国を中 心に販売されているが,一 般研究者にまでは普及していない。日本がこの分野で完全に遅 れてしまわないために,DNAチ ップ技術の現状と将来の展望を述べ,研 究推進の一助とし たい。 【ゲ ノ ム情 報 】 【DNAチ ップ】 【 機 能解析 】 は じめ に ポ ス トゲ ノ ム の 研 究 課 題 として,functional Drmanacら genomicsあ との ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ っ て 決 定 す る 方 法 る い はdrug discoveryと い う言葉 が著 名 がDNAの 塩 基 配 列 をオ リゴ ヌ ク レ オ チ ド な 学 術 誌 に頻 繁 に 登 場 して い る。 これ は ゲ ノ ム 構 造 解 (sequencing 析 プ ロ ジ ェ ク トの 成 果 をい か に人 類 に役 立 て る か とい と に 始 ま る2)。SBHは う問 い か けで あ ろ う。DNAチ ッ プ(DNAマ 決 定 法 の 限 界 を原 理 的 に 克 服 で き る方 法 と して 注 目 さ レイ と も よ ば れ る)技 術 は,ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク トの 成 イ ク ロア by hybridization;SBH)を れ た が,実 用 化 に は 紆 余 曲 折 が あ っ た 。 そ の 後, 果 を 飛 躍 的 に発 展 させ る新 しい技 術 とし て開 発 され,創 Affymetrix社 薬 研 究,疾 術 を 開 発 し,遺 伝 子 の 発 現 や 変 異,あ 病 の 診 断 や 予 防 法 の 開 発,エ ネル ギ ーや環 考 案 した こ ゲ ル電気 泳動 を用 いる塩基 配 列 やStanford大 学 が 高密 度 ア レイ作 製技 るい は多型 な ど 境 問 題 対 策 な どの 研 究 開 発 に新 し い 手 段 を提 供 す る も を 効 率 よ く短 時 間 で 調 べ る,い の と期 待 さ れ て い る 。 しか し な が ら,そ の 開 発 は米 国 throughput を 中 心 に 行 な わ れ て お り,日 本 の 立 ち 遅 れ が 懸 念 され 術 を実 用 化 す るた め に は,多 数 のDNA断 てい る。DNAチ ク レオ チ ド を固 相 表 面 に整 列 さ せ る た め の 高 密 度 ア レ ッ プ技 術 に関 して は す で に本 誌 で 取 り 上 げ られ て い るが1),筆 者 らが 昨 年 の 夏 ご ろ か ら米 国 の DNAチ ップ 関 連 企 業 と数 々 の 接 触 を続 け て きた 経 験 を 織 りまぜ て,そ の後 の動 向 を も う少 し詳 し く解 説 し,こ screening)が イ(DNAチ ョ ン解 析 技 術 が 必 要 とな る 。 ま た,多 DNAチ ップ の作 製 方 法 と して は,あ Fusao ッ プ 技 術 開 発 が 具 体 化 し て き た の は, Kimizuka,Ikunoshin Kato,宝 DNA 2004 イ ク ロ ア レ イ)3，5)と,基 板 上 で 直 接 合 成 す る方 法(オ リゴDNAマ 滋 賀 県 大 津 市 瀬 田3-4-1)[Biotechnology 520-2193,Japan] Chip Technologies and their Applications:Towards らか じめ 調 製 し イ ク ロア レイ)4，6) が 知 られ て お り,そ れ ぞ れ 一 長 一 短 が あ る(図1)。 酒 造 ㈱ バ イ オ 研 究 所(〒520-2193 ratories,Takara Shuzo Co.,Ltd.,Seta,Otsu,Shiga 数 の サ ンプ ル を ス ラ イ ドガ ラ ス や シ リコ ン な どの 基 板 に 固 定 す る 方 法(DNAマ DNAを DNAチ 片 や オ リゴ ヌ ッ プ)作 製 技 術 お よ び ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ たDNAを ップ技術の概要 可 能 とな っ た3，4)。 チ ップ 技 処 理 す る た め の 自 動 化 装 置 も必 要 に な る 。 の 分 野 の 日本 で の研 究 推 進 の 一 助 と し た い。 Ⅰ .DNAチ わ ゆ るHTS(high- Functional Genomics Research 一 Labo- Database Center for Life Science Online Service DNAチ ップ技術とその応用 図lDNAチ PCRな 53 ップ の作 製 方法 ど に よ り調 製 し たcDNA断 片 を,ア レ イヤ ー を用 いて ス ラ イ ドガ ラ ス に整 列 させ る場 合(a)と,半 ス上 の 特 定 領 域 で 同 時 に 多 数 のDNAを 導体 技 術 を応 用 して ガ ラ 合 成 す る場 合(b)の 概念 図2DNAの 固相 担 体 への 固 定化 法 (a)PCR産 図。 物 な ど の長 鎖DNAを 非 共 有 結 合(静 イ ドガ ラ ス に 固 定化 す る 場 合,(b)合 電 結 合)で スラ 成 オ リ ゴヌ ク レオ チ ドを共 有 結 合 で ス ラ イ ドガ ラ ス に 固 定化 す る 場 合 。 般 的 な チ ップ の 大 きさ は1∼10cm2で,こ ∼ 数 十 万 種 のDNAが プ は,一 の領 域 に数 千 整 列 され て いる。 作 製 され た チ ッ 般 的 に は 蛍 光 標 識DNAプ ロー ブ とのハ イ ブ リ の 一 部,あ cDNA断 る い は3'末 片(expressed 端 か ら200∼300bp程 sequence tag;ESTと 度 の よ ばれ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ り検 出 され る。 検 出 に は1∼10μm る)な ど の ポ リヌ ク レ オ チ ド(原 核 生 物 の 場 合 はopen の 解 像 度 を も つ 高 性 能 蛍 光 ス キ ャナー が 用 い られ る。 ま reading た,蛍 能 が 未 知 で あ っ て も よ い が,一 光 イ メ ー ジ を 解 析 す るた め の ソ フ トウ ェ ア も必 要 とな る 。 す で に チ ッ プ作 製 用 ア レイ ヤ ー,蛍 光スキ frame;ORF)を 固 定 す る。 これ らは 配 列 や 機 ャ ナ ー お よ び 解 析 用 ソ フ トを組 み 合 わ せ た シ ス テ ム が ラ リー,あ 開 発 され,DNAチ で 増 幅 して 調 製 す る(PCRの ップ技 術 を応 用 した 多 数 の研 究 報 告 が あ る(後 述)。 これ ら の シ ス テ ム は米 国 を 中 心 に 開 発 が 進 め られ て き た が,最 近 に な っ て,日 本 版 の 開 発 も 活 発 化 し て き て い る。 一方 異 や 多 型 に対 応 す る種 々 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドを合 成 す る こ と に な る。 さ ら に ップの作製方法 ク レオ チ ド を合 成 す る 。DNAの 固相表 面へ の固定 化 固 定 化 す るDNAは 迅 速 化 が 必 要)。 ,遺 伝 子 の 変 異 や 多 型 を 調 べ る場 合 は,標 準 と な る既 知 の配 列 を基 に して,変 DNAの 1.DNAの ゲ ノ ム の ライ ブ る い は全 ゲ ノ ム を テ ンプ レー トに してPCR 塩 基 配 列 分 析 の場 合 は4n(nは Ⅱ .DNAチ 般 的 には デー タベ ー ス に 登 録 さ れ た 配 列 を 基 に し てcDNAや そ のオ リゴ ヌ 固 定 化 方 法 とし て は, 種 類 お よび 担 体 の種 類 に応 じて適 当 な 方 法 が 選 択 され る。 固 定 化 す るDNAがcDNAやPCR産 目的 に よっ て大 き く2通 りに分 け られ る。 遺 伝 子 の 発 現 を 調 べ る た め に は,cDNAや 塩 基 長)種 場 合,DNAの 荷 電 を 利 用 して,ポ チ レ ン イ ミ ン,ポ 物の リ リ ジ ン3),ポ リエ リ ア ル キ ル ア ミ ン な ど の ポ リ陽 イ オ 2005 54 蛋 白質 核酸 酵素 Vol.43 No.13(1998) ン で 表 面 処 理 し た 固 相 担 体 に 静 電 結 合 さ せ,次 い で余 分 な 陽 イ オ ン を ブ ロ ッキ ング す るの が 一 般 的 で あ る(図 1a,図2a)。 しか し,DNAの5'末 端 と固 相 との 共 有 結 合 を 試 み て い る例 も あ る7)(図2b)。 ド を 固 定 す る 固 相 担 体 と して は,ス ポ リヌ クレオチ ラ イ ドガ ラ ス が 一 般 的 に 用 い ら れ る。 これ は 表 面 処 理 の容 易 さ や 蛍 光 ス キ ャ ナ ー に よ る 解 析 の 容 易 さ と関 連 して い る。 合 成 オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドを固 定 化 す る方 法 と して は, 2通 りの 方 法 が あ る。 一 つ は ガ ラ ス や シ リコ ン基 板(シ リカ 表 面 層 を もつ)上 1b)。 で 直 接 合 成 す る 方 法 で あ る(図 こ の 方 法 で は,基 板 表 面 を4×4の マ ト リ ッ クス に 分 画 し,多 数 の 反 応 部 位 に お け る組 合 せ 反 応(コ ビナ ト リア ル ・シ ンセ シ ス)に で 多 種 類 のDNA合 よ り,最 少 の合 成 回 数 成 を行 な う。 た とえば,8塩 オ リゴ ヌ ク レオ チ ド配 列 は,48=65,536通 Database Center for Life Science Online Service ン 基長の りあ るが,こ れ を マ ト リ ッ ク ス 方 式 で 合 成 す れ ば,4×8=32回 の合 成 サ イ クル で す べ て の 配 列 を合 成 す る こ とが で きる 。 問 題 は,い か に して 微 小 な マ ト リック ス の 所 定 の 領 域(反 応 部 位)で 選 択 的 合 成 を行 な わ せ るか(こ れ をマ ス キ ン グ 技 術 と い う)と い う こ と に な る が,Fodorら は光 照 射 で 選 択 的 に除 去 さ れ る保 護 基 の 使 用 と,半 導体 製 造 に利 用 され る フ ォ ト リ ソ グ ラ フ ィー 技 術(図3a)お よ び 固 相 合 成 技 術 を 組 み 合 わ せ て,こ の 問 題 を見 事 に 解 決 した4)。す な わ ち,光 化 学 的 に 除 去 で き る保 護 基 で 図3担 (a)フ 修 飾 した リ ン カ ー を,ア ミ ノ基 を介 して 固 相 に 結 合 さ せ て お き,反 応 部 位 の み を照 射 で きる よ う なマ ス ク(フ ォ ト リ ソ グ ラ フ ィ ッ ク ・マ ス ク)を か け て 光 照 射 す る。 体 上 で 直 接DNAを 合 成 す る 方 法(on chip合 成) ォ トリソ グ ラ フ ィー に よ る合 成 。 ア ル キ ル ア ミノ シ ラ ンで コ ー トした ガ ラ ス に光 感 受性 保 護 基(R)を もつ リ ンカ ー を共 有 結 合 させ て お く。 マ ス ク を 介 して反 応 部 位 の み を光 照 射 して脱 保 護 を行 な い,最 初 の合 成 を行 な う。 次 の 反 応 部 位 を 同様 に照 射 して 2番 目の 合 成 を行 な う。 この サ イ クル を くり返 す こ とで所 定 の部 位 次 い で,同 保 護 基 を もつ 単 量 体 を 導 入 して 最 初 の カ ッ に所 望 のDNAを 合 成 固 定 で きる。(b)メ カ こ カ ル シ ール に よ る合 プ リ ン グ 反 応 を行 な う。 こ の サ イ ク ル を く り返 す こ と 成 。 テ フ ロ ン ブ ロ ッ ク の表 面 に 同材 質 の 円 形 隆 起 線 で シー ル した で 所 望 の プ ロ ー ブ マ トリ ック ス を作 製 す る(図1b)。 反 応 セ ル をつ くる。 反 応 セ ル を下 側 に しス ラ イ ドガ ラ ス と密 着 さ さ せ,セ ら に フ ォ トレ ジ ス トの 使 用 に よ り,酸 で 除 去 さ れ る 従 来 の 保 護 基 も使 え る よ うに した8)。Southernら は,メ ル 内 に試 薬 を導 入 して合 成 を 行 な う。 セ ル を着 脱 させ,ガ ラ ス をス ライ ドさせ て新 た な反 応 部 位 を 形 成 させ,次 の 合 成 を行 な う。 この サ イ クル を くり返 す 。 カ ニ カ ル シ ー ル に よ る ガ ラ ス 基 板 上 で の オ リゴ ヌ ク レ オ チ ド合 成 を行 な っ て い る6)(図3b)。 また,Hoodら 固 相 に共 有 結 合 させ る方 法 が あ る5，10)(図2b)。DNAへ は フ ォ ト リ ソ グ ラ フ ィー に よ り,酸 化 シ リ コ ン表 面 に の 導 入 官 能 基 と し て は,ア 100μmの 基,ビ 円 形 フ ォ トレ ジ ス トを つ く り,そ の周 辺 を疎 ミノ基,ア ル デ ヒ ド基,SH オ チ ン な どが 用 い られ る 。 また,ガ 水 性 の 高 い シ ラ ンで コ ー ト した の ち レ ジ ス トを 除 去 し カ な どの 固 相 担 体 の 表 面 処 理 に は,ア て 親 水 性 の合 成 部 位 とした9)。合 成 部 位 の修 飾 はSouth- ヒ ド基,エ ラスや シ リ ミ ノ 基,ア ルデ ポ キ シ 基 な ど を有 す る各 種 シ ラ ン カ ッ プ リ ernら の 方 法 を用 い,合 成 試 薬 の供 給 に は イ ン ク ジ ェ ッ ン グ 剤 が よ く用 い られ る 。 オ リゴ マ ー は,表 トプ リ ン タ ー の 原 理 を利 用 して い る 。 こ の よ う に 基 板 た 固 相 に ス ペ ー サ ー や ク ロ ス リン カ ー を 介 して 共 有 結 上 で 直 接DNA合 chip)合 成 して固 定 化 す る方 法 を,in situ(on 成 と称 して い る。 これ に対 して,あ 面 処理 し 合 さ せ る の が 一 般 的 で あ る。 疎 水 性 の ガ ラ ス 表 面 に ポ リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル の微 小 片 を整 列 さ せ,そ こ に合 らか じめ 末 端 に共 有 結 合 の た め の 成 オ リゴマ ー を共 有 結 合 させ る方 法 もあ る11)。この場 合, 官 能 基 を導 入 した オ リ ゴ マ ー を合 成 し,表 面 処 理 し た 部 位 あ た りの オ リ ゴ マ ー の 結 合 量 を多 くす る こ とが で 2006 DNAチ き,液 相 ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ンが 可 能 で あ る 。 特 殊 な 方 法 と して は,Nanogen社 半 導 体 技 術 に よ り,シ の方 法 が あ る12)。これ は リカ チ ップ 上 に微 小 電 極 の ア レ ップ技術とその応用 製 さ れ た チ ップ の 寿 命 は,cDNAア 55 レイ で 数 週 間,オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドア レ イ で は さ ら に長 期 間 で あ る と い わ れ て い る。 イ を 作 製 し,電 極 上 に は ス トレ プ トア ビ ジ ン を含 む ア ガ ロ ー ス の 浸 透 層 を 設 け て 反 応 部 位 とす る。 部 位 を プ ラ ス に荷 電 させ る こ とで ビオ チ ン化DNAを Ⅲ.DNAチ ップによる夕一ゲ ットの検出 固 定 化 し, 部 位 の 荷 電 を 制 御 す る こ とで,高 速 で 厳 密 な ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を可 能 に して い る。 こ の 方 法 は原 理 的 に す べ て の 荷 電 物 質 に 適 用 で き る。 1.サ ン プ ル(タ 作 製 され たDNAチ グ,塩 ッ プ 作 製 装 置(ア 基 板 上 で 直 接DNA合 レ イ ヤ ー) 成 を行 な って チ ップ化 す る方 法 に つ い て は前 述 した の で,こ こで は調 製 され たDNAを 標識 ップ は,遺 基 配 列 の 決 定,変 さ れ る 。 図4に 2.DNAチ ー ゲ ッ ト)の 伝 子 発 現 の モ ニ タ リン 異 解 析,多 示 した よ う に,検 型 解 析 な ど に利 用 出 原 理 は標 識 し た タ ー ゲ ッ ト核 酸 と の ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン で あ る。 タ ー ゲ ッ ト核 酸 の標 識 に は ,お ら れ る が,現 もにRIま た は蛍光 が用い 在 は後 者 が 主 流 に な っ て い る。 遺 伝 子 発 基 板 に ス ポ ッ トす る装 置 に つ Database Center for Life Science Online Service い て 説 明 す る。 装 置 の 性 能 と し て は,マ イ ク ロ プ レ ー トに 分 注 されたDNAサ ンプルの 一 定 量(PCR産 物 の 場 合,1 ∼10fmol,ま た は重 量 として 数ng以 下)を,数 十 ミクロン か ら数 百 ミク ロ ンの サ イズ で, 定 め られ た 位 置 に 定 量 的 に ス ポ ッ トで き る性 能 が 求 め ら れ る 。 同 時 に,遺 伝 子発現 の定 量 的 解 析 や1塩 基 変異 を解析 す るた め に,ス ポ ッ トサ イ ズ や 形 の 変 動 を最 小 限 に す る必 要 が あ る。 ま た,ヘ ッ ドの ピ ン数 や ス ポ ッ テ ィ ング 速 度 も 多 数 の レ プ リ カ作 製 の た め に 重 要 と な る。 ス ポ ッ ト方 式 に は,ピ ン先端 の 固相 への機械 的 な 接 触 に よ る ピ ン(あ は ペ ン)方 式,イ るい ンク ジェ ッ トプ リ ン タ ー の 原 理 を利 用 し た イ ン クジェ ッ ト方 式13),毛 細 管 に よるキ ャ ピラ リー 方 式14)な どが 知 られ て い る 。 細 部 に つ い て は メ ー カ ー ご と に工 夫 が され て い る。 ス ポ ッ ト後 は 必 要 に 応 じてUV照 ロ ス リ ン ク形 成,表 ッ キ ン グ,洗 射 によるク 面 のブ ロ 浄 な どの 後 処 理 を 行 な う。 こ の よ う に し て 調 図4DNAチ ップ の技 術 の全 体 像 DNAチ ッ プ に か か わ る技 術 の 全 体 像 を,作 業 の 流 れ に 従 っ て模 式 的 に示 す。 2007 56 蛋 白質 核 酸 酵 素 Vol.43 No.13(1998) 現 を調 べ る 場 合 は,真 核 生 物 で は,細 mRNAを 胞 や組 織 か ら 抽 出 し,逆 転 写 反 応 に よ り標 識dNTPを り込 ませ て,標 識cDNAと は,液 量 や標 識 方 法 に も 常 数 μg以 下 で あ る。 一 方,mRNAを チ セ ンスRNAと アン して 標 識 す るや り方 もあ る15)。た だ し, こ の 方 法 は ア ン チ セ ン スRNAの mRNAの 増 幅 を 伴 う の で, コ ピー 数 を反 映 し てい る とは限 らない 。 な お, ア レ イ が オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドの 場 合 は,標 識 ター ゲ ッ 3.検 出 ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ り,チ れ た 二 重 鎖 は,RIま た は蛍 光 イ メー ジ ス キ ャナ ー で 解 析 す る 。 チ ッ プ上 の 蛍 光 強 度 は,蛍 とCCDカ ッ プ 上 に形 成 さ 光 レーザ ー顕微 鏡 メ ラ お よ び コ ン ピ ュー タ を 連 結 した 装 置 で 自 動 的 に 測 定 す る。 ス キ ャ ナ ー の 基 本 的 な 性 能 と して は, トを 低 分 子 化 し て お く必 要 が あ る 。 細 菌 な ど の 原 核 生 サ イ ズ が 数 十 ミク ロ ン で,間 物 で はmRNAの ス ポ ッ トを,定 量 的 に識 別 で き る こ とが 求 め られ る。 望 選 択 的 な抽 出 が 困 難 な ので,全RNA を標 識 す る こ と に な る が,そ い う16)。なお,遺 れ で も解 析 可 能 で あ る と 伝 子 の発 現 解 析 にお け るmRNAの 出 感 度 は,細 胞 あた り数 コピー以 下,全mRNA中 量 と し て1:3∼5×105と Database Center for Life Science Online Service れ て い る20)。 す る3)。1回 のハ イ ブ リダイ ゼ ー シ ョン に必 要 なmRNA量 よ るが,通 取 プ ロ ー ブ と のハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ンが 実 際 に行 な わ dNTPを この ほ か に,タ の含 で き るオ ー トフ ォー カ ス機 能 を もつ こ とで あ る。 デ ー 識 行 な う。 ー ゲ ッ ト核 酸 を調 製 した の ち に 標 識 す る ポ ス トラ ベ ル 法 もあ るが,ま 数 の 標 識 に対 応 で き る こ と,広 範 囲 を 高 速 で ス キ ャ ン で き る こ と,基 板 の ミク ロ な 歪 み に 対 応 識 プ ラ イ マ ー か,標 含 む反 応 系 で ター ゲ ッ ト領 域 のPCRを ク ロ ン程 度 の 検 いわ れ て い る7，15)。 遺伝 子 の変 異 や 多 型 を 調 べ る場 合 は,標 ま し くは,複 隔 が100ミ だ一般 的 で はな い。 タ タ 解 析 ソ フ トは,変 異 や 多 型 の 解 析 の よ う に,部 分的 に 重 複 し た 配 列 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドが 多 数 含 まれ る 複 雑 な 解 析 に も対 応 で き る もの で あ る こ とが 望 まれ る 。 ま た,発 現解 析 の場合 はさ らに外部 デ ー タベ ー ス との リ ン ク が 必 要 と な る。 ー ゲ ッ ト核 酸 を標 識 せ ず に検 出 す る方 法 と し て 質 量 分 析 法(MALDI-TOFMS)が あ り17，18),今 後 の展 開が Ⅳ .DNAチ ップの応用例 注 目 さ れ る。 DNAチ 2.ハ イ ブ リダイ ゼー シ ョン ッ プ に よ る検 出 法 に つ い て は こ れ まで に概 略 を述 べ て きた の で,こ チ ッ プ を 用 い るハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョンの 特 徴 は,膜 こで は具 体 的 な 実 施 例 を紹 介 す る(表1)。 な ど を 用 い る場 合 に比 べ て 容 量 が 非 常 に 少 な くて す む (通 常10μl前 後)こ とで あ るが,逆 に そのた め の工 夫 も必 要 とな る。 また,基 板 に 固 定 す るDNAの 鎖 長 と, 1.変 異や 多型 およ び塩基 配列 の解 析 例 Kozalら は オ リゴ ヌ ク レオ チ ドア レイ を 用 いてHIV- タ ー ゲ ッ ト核 酸 の 種 類 に よ り,ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ 1の プ ロテ アー ゼ遺 伝 子 の 変 異 を167検 ン の 最 適 条 件 を設 定 す る必 要 が あ る。 た と え ば,遺 47.5%の 子 発 現 の 解 析 に は,低 よ う に,低 伝 発 現 の 遺 伝 子 も十 分 検 出 で き る い 厳 密 度(stringency)で 長 時 間(一 夜)の ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン を行 な う。 一 方,1塩 基変 異 ア ミ ノ酸 位 置 に多 型(変 た21)。Haciaら ン11に は,乳 エキソ らに,霊 長類 間 の 塩 基 配 列 を比 較 して い る22，23)。 また,Croninら ョ ン を行 な う。 ユ ニ ー ク な 方 法 と して,Nielsenら る 多 数 の 変 異 を 検 出 し て い る24)。 は 存 在 を証 明 し が ん遺 伝 子(BRCA1)の 胞 性 繊 維 症 関 連 遺 伝 子(CFTR)の プ チ ド核 酸)を 開 発 し た19)。PNAはDNAの 異)の お け る多 数 の変 異 を検 出 し,さ の 検 出 に は高 い 厳 密 度 で 短 時 間 の ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ PNA(ペ 体 につ いて調 べ, Cheeら は,33kbの は,嚢 エ キ ソ ン11に おけ ヒ トミ トコ ン ド リ アDNAの 多 ホ ス ポ ジ エ ス テ ル 結 合 をペ プ チ ド結 合 に変 換 し た 人 工 型 を調 べ,180種 核 酸 で あ るが,合 成 に無 水 反 応 を必 要 と しない ので,on 検 出 して い る25)。Shoemakerら chip合 成 が 容 易 な こ と,PNA-DNAハ れた 多数 の酵母遺 伝子 の欠 損株 の 表現 型 を同時 に解析 DNA-DNAハ イ ブ リ ッ ドは イ ブ リ ッ ドに比 べ て 特 異 性 お よび 安 定 性 に優 れ て い る こ と,お よ び ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン に 塩 を必 要 と しな い の で,DNA鎖 と な ど の 特 徴 が あ る。PNAを の 折 りた た み が な い こ 固 定 した ア レ イ とDNA と の ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ンや,DNAア 2008 レ イ とPNA の既 知 の 多 型 の うち,179種 は,PCRに の多型 を よ り作 製 さ す る 方 法 を 開 発 した26)。 こ の ほか,Sapolskyら は,STS(sequence-tagged site)マ ー カ ー の チ ッ プ に よ る コ ス ミ ド ク ロ ー ンの マ ッ ピ ン グ を行 な っ た27)。ま た 最 近,Wangら は,2.3Mb に 及 ぶ ヒ トゲ ノ ムDNAのSNP(single nucleotide DNAチ ップ技術とその応用 表1DNAチ ッ プの応 用例 57 チ ップ を用 いて行 なわ れ て い る33)。 Nanogen社 の グループはシ リコ ン基 板 上 に 整 列 さ せ た 微 小電 極 にオ リゴヌ ク レオチ ド を固 定 した チ ップ を 用 い て モ デ ル 実 験 を行 な い,ハ イブリ ダイ ゼ ー シ ョンの電気 化 学 的 制 御(APEX法)の 有 用性 を 示 した12)。Argonne国 立研 究 所 の グ ル ー プ は,幼 児脳 の cDNAラ イ ブ ラ リー か ら約 73,000のcDNAフ ィル ター ア レ イ を 作 製 し,200∼320の Database Center for Life Science Online Service 33P標 識 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド プ ロ ー ブ を 用 い て,約2万 の 遺 伝 子 を 同 定 す る と と も に, それ らの発現 レベ ルの グル ー プ 分 け を し た34)。 polymorphism;1塩 Ⅴ .主 要DNAチ 基 多 型)を 調 べ,3,241のSNP候 補 を 同 定 し,そ の うちの2,227のSNPの 遺 伝地 図 を作 ップ開発機 関 の動向 成 した28)。 Drmanacら (約1kb)の は,SBHに よ り,p53の 塩 基 配 列 を12検 エ キ ソ ン5∼8 体 につ いて 正 確 に 決 定 し, そ の 診 断 へ の 有 用 性 を示 した29)。同様 に,Argonne国 立 研 究 所 とロ シ ア 科 学 ア カ デ ミー の グ ル ー プ は,ス ラ イ ドガ ラ ス 上 に整 列 さ せ た ポ リア ク リル ア ミ ドゲ ル の 微 小 片 に,DNAや 抗 体 を 固 定 した ア レイ を用 い て モ デ ル 実 験 を行 な い,そ の有 用 性 を 示 した30)。 DNAチ ップ 技 術 の企 業 化 は米 国 を 中 心 に 急 速 な展 開 を みせ て い るが,な か で も先 行 して い る の はAffymetrix 社 で あ ろ う。 同 社 はFodorら に よ って 開 発 され た 高 密 度 ア レ イ 作 製 技 術 を基 に,チ ップ(GeneChip)に よる プ ロ グ ラ ム)を 商品化 解 析 シ ス テ ム(“Easy Access” し よ う と して い る 。 チ ッ プ作 製 装 置 は 販 売 して い な い の で,ユ ー ザ ー は 同 社 にチ ップ の作 製 を委 託 す る か,す で に販 売 され て い る チ ップ を購 入 し,GeneChip専 2.遺 伝 子発 現の 解析例 Schenaら 製 し,2蛍 は,シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ のcDNAチ 解 析 シ ス テ ム を購 入 し て 解 析 す る か,ま ップ を作 光 標 識 法 に よ り葉 と根 にお け る遺 伝 子 発 現 の 違 い を 調 べ,そ の有 用 性 を示 した3)。Hellerら 託 す る こ と に な る。 こ の よ う な 商 業 化 戦 略 は,一 は,炎 症 トの 遺 伝 子5万 最 近Incyte社 種 を解 析 す る チ ップ を開 発 中 とい う35)。 に 買 収 さ れ たSynteni社 を 用 い て患 者 組 織 や 株 化 細 胞 での遺 伝 子 発 現 を調 べ,そ らの 開 発 したcDNAア の 有 用 性 を確 認 し た31)。こ れ に類 似 し た 研 究 と し て, の 技 術 を利 用 す る た め に は,“Technology Lockhartら Program” ウ スB細 リゴ ヌ ク レオ チ ドチ ップ を用 い,マ 胞 で の既 知 の サ イ トカ イ ン遺 伝 子 の 発 現 を定 量 的 に 解 析 して い る15)。 DeRisiら は,酵 母 の全 遺 伝 子 を 含 む チ ッ プ を 多 数 作 製 し て,ア ル コール発酵 前後 の全遺伝子 の発 現 変化 を 経 時 的 に測 定 した32)。同 様 の研 究 が オ リゴヌ ク レオ チ ド 般研 究 者 の 自 由 度 を 著 し く抑 制 す る もの で あ る 。 現 在,ヒ 関 連 遺 伝 子 お よ び 末 梢 血 リ ンパ 球 由 来 の遺 伝 子 チ ッ プ は,オ 用の た は解析 を委 は,Brown レイ 技 術 を商 業 化 し て い る 。 こ と い う契 約 が 必 要 で あ る 。 現 在,ス Access キ ャナ ー お よび チ ッ プ あ た り1万 種 の ヒ ト遺 伝 子 を含 む4種 の チ ップ(UniGemver1.0-4.0)を う35)。Hyseq社 はSBHの 利 用 す る た め の“Access 開発 中 で あ る とい 基 本 特 許 を もち,こ の技 術 を Program” ォ ー マ ッ ト(Hygnostics「 診 断 」,Gene と し て,3種 Discovery「 のフ 遺 2009 58 蛋 白 質 核 酸 酵 素 Database Center for Life Science Online Service 表2主 要DNAチ Vol.43 No.13(1998) ップ開発 機 関の 動 向 伝 子 の 発 見 」,お よ びHyChip「 塩 基 配 列 分 析 」)を用 意 して い る36)。同 社 は,多 数 の遺 伝 子 の塩 基 配 列 デー タ の 蓄 積 を続 け て い る 。 Molecular は,ペ ン方 式 でcDNAチ を も っ て い る 。 近 々,ス ッ と同 様 の“Access キ ャ ナ ー を,次 で ア レ イ ヤ ー を 発 売 す る とい う35,36)。Nanogen社 年 中 に電 極 部 位 が1,000の 1999年 い は今 シ リ コ ン チ ッ プ を 開 発 し, に は1万 部 位 に す る とい う37)。Sequenom社 固 相 上 で多 数 のDNAテ Chip)し ス テ ム とし て 受 注 生 産 を 開 始 した 。 ま た,日 立 ソ フ トウ エ ア エ ン ジ ニ ア リ ン グ ㈱ もア レ イ Dynamics社 プ を作 製 す る技 術 を もち,Synteni社 Program” 内 で は,日 本 レ ー ザ 電 子 ㈱ が ア レ イ ヤ ー お よ び ス キ ャ ナ ー を開 発 中 で,シ ヤ ー の 受 注 を 開 始 して い る。 こ れ ら の チ ッ プ 技 術 の 利 用 は,こ れ まで一部 の大手 薬 品会社 や 研 究機 関 に限 ら れ て い た が,今 後 は一 般 研 究 者 に も手 の 届 く装 置 や シ ス テ ム の 開 発 が 強 化 さ れ,利 用 範 囲 も拡 大 す る こ とが 予 想 され る 。 は, ン プ レー トを トラ ップ(Spectro- て シー ク エ ン ス反 応 を行 な い,そ MALDI-TOFMSに か け る こ とで,多 の ラ ダー を 数 のサ ンプルの 塩 基 配 列 を短 時 間 に決 定 す る 方 法(PROBE法)を 商品 おわ りに 本 年1月 の ク リ ン トン大 統 領 の 一 般 教 書 演 説 で も と りあ げ られ た よ うに,DNAチ ップ 技 術 は,ゲ ノ ム の機 能 解 析 を 飛 躍 的 に発 展 さ せ る た め に不 可 欠 な 化 し よ う と して い る。 前 述 以 外 の 動 向 に つ い て は,表 技 術 で あ り,そ れ ゆ え に 国 に と っ て も戦 略 的 な技 術 で 2を 参 照 され た い 。 も あ り,こ の分 野 に お け る 日本 の 立 ち 遅 れ が 懸 念 さ れ こ の ほ か,種 々 の 使 用 に対 応 で き る,い わ ゆ るDIY る。 ま た,こ の 技 術 は膨 大 な ゲ ノ ム 情 報 を1枚 プ に詰 め込 ん だ,い い る35)。た と え ば,最 ン で あ り,そ の デ ー タ 解 析 に は ゲ ノ ム 解 析 プ ロ ジ ェ ク 近General Scanning社 で は, わ ば 半 導 体 チ ップ のDNAバ のチ ッ 型 の チ ッ プ 作 製 装 置 や ス キ ャ ナ ー の 開 発 も活 発 化 して ージ ョ 種 々 の チ ップ に対 応 で きるス キャナー(ScanArray3000) トの成 果 を 取 り込 ん だ 種 々 の デ ー タ ベ ー ス との リ ン ク を発 売 した。Genetic が 必 須 で あ る。 イ ン タ ー ネ ッ トの 発 達 に よ り,こ れ ら MicroSystems社 で は,高 性 能 の ア レ イ ヤ ー お よ び ス キ ャ ナ ー を今 年 中 に発 売 す る 。 国 2010 の デ ー タベ ー ス へ の ア ク セ ス が 容 易 に な っ て い るが,整 DNAチ 理,統 合 と い う面 で 必 ず し もユ ー ザ ー フ レ ン ド リー で は な い 。 そ の た め に,Incyte社 な ど で は独 自 の デ ー タ ベ ー ス や ア ク セ ス の た め の プ ラ ッ トホ ー ム を構 築 し,こ ップ技術とその応用 Keck,W.,Mous,J.:Nature Biotechnol.,16,45-48 (1998) 17)Koster,H.,Tang,K.,Fu,D.,Braun,A.,Boom,D., Smith,C.L.,Cotter,R.J.,Cantor,C.R.:Nature れ を ビ ジ ネ ス と して 展 開 して い る。 そ の 意 味 で チ ッ プ Biotechnol.,14,1123-1128(1996) 技 術 とイ ン フ ォ ー マ テ ィ クス技 術 は車 の 両 輪 で あ る 。 こ 18)Griffin,T.J.,Tang,W.,Smith,L.M.:Nature こ に 取 り上 げた チ ップ技 術 は,DNAに と ど ま らず,蛋 白質 や ペ プ チ ド,糖 鎖 な どの 他 の生 体 高 分 子 に も適 用 可 能 な 技 術 で あ り,コ ン ビナ ト リア ル ・ケ ミス ト リー と リ ン ク さ せ る こ とに よ り,HTSの 手 段 と し て今 後 広 59 Biotechnol.,15,1368-1372(1997) 19)Nielsen,P.E.,Egholm,M.,Berg,R.H.:Science, 254,1497-1500(1991) 20)Weiler,J.,Gausepohl,H.,Hauser,N.,Jensen,O. N.,Hoseisel,J.D.:Nucl.Acids Res.,25,2792- 2799(1997) 範 に 利 用 さ れ る と予 想 され る 。 21)Kozal,M.J.et al.:Nature Med.,2,753-759(1996) 22)Hacia,J.G.,Brody,L.C.,Chee,M.S.,Fodor,S.P. A.,Collins,F.C.:Nature 文 1)入 献 江 隆 史 ・神 原 秀 記 ：蛋 白 質 核 酸 Erdos,M.R.,Robbins,C.M.,Fodor,S.P.A., 酵 素,42,3087- Brody,L.C.,Collins,F.S.:Nature 3089(1997) Database Center for Life Science Online Service Genet.,14,441-447 (1996) 23)Hacia,J.G.,Makalowski,W.,Edgemon,K., 24)Cronin,M.T.,Fucini,R.V.,Kim,S.M.,Masino, R.:Genomics,4,114-128(1989) R.S.,Wespi,R.M.,Miyada,C.G.:Hum.Mut.,7, 3)Schena,M.,Shalon,D.,Davis,R.D.,Brown,P. 244-255(1996) O.:Science,270,467-470(1995) 25)Chee,M.et 4)Fodor,S.P.A.,Read,J.L.,Pirrung,M.C.,Stryer, Mittmann,M.,Davis,R.W.:Nature (1991) al.:Nucl.Acids Genet.,14, 450-456(1996) Res.,22,2121- 27)Sapolsky,R.J.,Lipshuts,R.J.:Genomics,33, 2125(1994) 6)Maskos,U.,Southern,E.M.:Nucl.Acids Res., 20,1679-1684(1992) 7)Schena,M.,Shalon,D.,Heller,R.,Chai,A., Brown,P.0.,Davis,R.W.:Proc.Natl.Acad.Sci. USA,93,10614-10619(1996) 8)McGall,G.,Labadie,J.,Brock,P.,Wallraff,G., Nguyen,T.,Hinsberg,W.:Proc.Natl.Acad.Sci. USA,93,13555-13560(1996) 9)Blanchard,A.P.,Kaiser,R.J.,Hood,L.E.: Biosens.Bioelectron.,11,687-690(1996) 10)Guo,Z.,Guilfoyle,R.A.,Thiel,A.D.,Wang,R., Smith,L.M.:Nucl.Acids Res.,22,5456-5465 (1994) 11)Yershov,G.etal.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 93,4913-4918(1996) 12)Sosnowski,R.G.,Tu,E.,Butler,W.F.,O'Connell, J.P.,Heller,M.J.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94, 1119-1123(1997) 13)Lemmo,A.V.,Fisher,J.T.,Geysen,H.M.,Rose, D.J.:Anal.Chem.,69,543-551(1997) 14)Shalon,D.,Smith,S.J.,Brown,P.O.:Genome Res.,6,639-645(1996) 15)Lockhart,D.J.et al.:Science,274,610-614(1996) 26)Shoemaker,D.D.,Lashkari,D.A.,Morris,D., L.,Lu,A.T.,Solas,D.:Science,251,767-773 5)Lamture,J.B.et Genet.,18, 155-158(1998) 2)Drmanac,R.,Labat,I.,Brukner,I.,Crkvenjakov, al.:Nature 1675-1680(1996) 16)Saizieu,A.,Certa,U.,Warrington,J.,Gray,C., Biotechnol.,14, 445-456(1996) 28)Wang,D.G.et al.:Science,280,1077-1082(1998) 29)Drmanac,S.,Kita,D.,Labat,I.,Hauser,B., Schmidt,C.,Burczak,J.D.,Drmanac,R.:Nature Biotechnol.,16,54-58(1997) 30)Guschin,D.,Yershov,G.,Zaslavsky,A.,Gemmell, A.,Shick,V.,Proudnikov,D.,Arenkov,P.,Mirzabekov,A.:Anal.Biochem.,250,203-211(1997) 31)Heller,R.A.,Schena,M.,Chai,A.,Shalon,D., Bedilion,T.,Gilmore,J.,Woolley,D.E.,Davis,R. 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